בידוד צואה מורין והשתלת מיקרוביוטה
Summary
המטרה כאן היא להתוות פרוטוקול לחקר המנגנונים של דיסביוזיס במחלות לב וכלי דם. מאמר זה דן כיצד לאסוף ולהשתיל דגימות צואה של מורין, לבודד מעיים ולהשתמש בשיטת “סוויס-רול”, ואחריה טכניקות של צביעת מערכת החיסון כדי לחקור שינויים במערכת העיכול.
Abstract
דיסביוזה של מיקרוביוטת המעי ממלאת תפקיד בפתופיזיולוגיה של הפרעות קרדיווסקולריות ומטבוליות, אך המנגנונים אינם מובנים היטב. השתלת מיקרוביוטה בצואה (FMT) היא גישה רבת ערך להגדרת תפקיד ישיר של המיקרוביוטה הכוללת או מינים מבודדים בפתופיזיולוגיה של מחלות. זוהי אפשרות טיפול בטוחה עבור חולים עם זיהום חוזר Clostridium difficile . מחקרים פרה-קליניים מראים כי מניפולציה של מיקרוביוטת המעי היא כלי שימושי לחקר הקשר המכניסטי בין דיסביוזה למחלות. השתלת מיקרוביוטה בצואה עשויה לעזור להבהיר טיפולים חדשניים הממוקדים במיקרוביוטה של המעי לניהול וטיפול במחלות לב-מטבוליות. למרות אחוזי הצלחה גבוהים במכרסמים, עדיין קיימים שינויים תרגומיים הקשורים להשתלה. המטרה כאן היא לספק הדרכה בחקר ההשפעות של מיקרוביום המעי במחלות לב וכלי דם ניסיוניות. במחקר זה מתואר פרוטוקול מפורט לאיסוף, טיפול, עיבוד והשתלה של מיקרוביוטה צואתית במחקרי מורין. שלבי האיסוף והעיבוד מתוארים הן עבור תורמים אנושיים והן עבור תורמי מכרסמים. לבסוף, אנו מתארים שימוש בשילוב של טכניקות גלגול וצביעת חיסון שוויצריות כדי להעריך מורפולוגיה ספציפית למעי ושינויים בשלמות במחלות לב וכלי דם ובמנגנוני מיקרוביוטה קשורים של המעי.
Introduction
הפרעות קרדיומטבוליות, כולל מחלות לב ושבץ, הן סיבות המוות המובילות בעולם1. חוסר פעילות גופנית, תזונה לקויה, גיל מתקדם וגנטיקה מווסתים את הפתופיזיולוגיה של הפרעות אלה. עדויות מצטברות תומכות ברעיון שמיקרוביוטת המעי משפיעה על הפרעות לב וכלי דם והפרעות מטבוליות, כולל סוכרת מסוג2, השמנת יתר3 ויתר לחץ דם4, מה שעשוי להיות המפתח לפיתוח גישות טיפוליות חדשות למחלות אלה.
המנגנונים המדויקים שבאמצעותם המיקרוביוטה גורמת למחלות עדיין אינם ידועים, והמחקרים הנוכחיים משתנים מאוד, בין היתר בשל הבדלים מתודולוגיים. השתלת מיקרוביוטה בצואה (FMT) היא גישה רבת ערך להגדרת תפקיד ישיר של המיקרוביוטה הכוללת או מינים מבודדים בפתופיזיולוגיה של מחלות. FMT נמצא בשימוש נרחב במחקרים בבעלי חיים כדי לגרום או לדכא פנוטיפ. לדוגמה, צריכת קלוריות ומטבוליזם גלוקוז ניתן לווסת על ידי העברת חומר צואתי מתורם חולה למקבל בריא 5,6. בבני אדם, FMT הוכח כאפשרות טיפול בטוחה לחולים עם זיהום חוזר של Clostridium difficile 7. עדויות התומכות בשימוש בו בניהול מחלות לב וכלי דם מתגלות; לדוגמה, FMT מחולי תסמונת רזה לתסמונת מטבולית משפר את הרגישות לאינסולין8. דיסביוזיס של המעי נקשר גם ליתר לחץ דם הן במחקרים בבני אדם והן במחקריםעל מכרסמים 9,10,11. FMT מעכברים שניזונו מתזונה עשירה במלח בעכברים נטולי חיידקים גורם למושתלים לדלקת וליתר לחץ דם12.
למרות השיעור הגבוה של הצלחה FMT במכרסמים, עדיין נותרו אתגרים תרגומיים. ניסויים קליניים המשתמשים ב- FMT לטיפול בהשמנת יתר ובתסמונת מטבולית מצביעים על השפעות מינימליות או ללא השפעות כלל על הפרעות אלה13,14,15. לפיכך, נדרשים מחקרים נוספים כדי לזהות דרכים טיפוליות נוספות המכוונות למיקרוביוטה של המעי לטיפול בהפרעות קרדיומטבוליות. רוב העדויות הזמינות על מיקרוביוטת המעי ומחלות לב וכלי דם הן אסוציאטיביות. הפרוטוקול המתואר דן כיצד להשתמש בשילוב של FMT וטכניקת גלגול שוויצרית כדי להראות קשר בין מחלות למיקרוביוטה של המעי ולהעריך ישירות את שלמות כל חלקי המעי16,17,18.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא לספק הדרכה לחקר ההשפעות של מיקרוביום המעי במחלות לב וכלי דם ניסיוניות. פרוטוקול זה מספק פרטים נוספים ושיקולים מרכזיים בתכנון הניסוי כדי לקדם תרגום פיזיולוגי ולהגביר את הקשיחות והשחזור של הממצאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
גישה חשובה לחקר התפקיד הסיבתי של מיקרוביוטת המעי במחלות לב וכלי דם ומחלות מטבוליות היא להעביר את המיקרוביוטה הכוללת או מינים נבחרים בעלי עניין לעכברים נטולי חיידקים. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקולים לאיסוף דגימות צואה מבני אדם ומעכברים ששוכנו באופן קונבנציונלי בעכברים נטולי חיידקים כדי ל…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי Vanderbilt Clinical and Translational Science Award Grant UL1TR002243 (ל- A.K.) מהמרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום; מענק איגוד הלב האמריקאי POST903428 (ל- J.A.I.); ומענקים של המכון הלאומי ללב, ריאות ודם K01HL13049, R03HL155041, R01HL144941 (לא.ק.), ומענק NIH 1P01HL116263 (ל- V.K). איור 1 נוצר באמצעות Biorender.
Materials
| Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost | ThermoFisher | B40932 | |
| Anaerobic chamber | COY | 7150220 | |
| Apolipoprotein AI | Novus Biologicals | NBP2-52979 | |
| Artery Scissors – Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Bleach solution | Fisher Scientific | 14-412-53 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | B14 | |
| CD3 antibody | ThermoFisher | 14-0032-82 | |
| CD68 monoclonal antibody | ThermoFisher | 14-0681-82 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-221 | |
| CODA high throughput monitor | Kent Scientic Corporation | CODA-HT8 | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Disposable graduate transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119AM | |
| Disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-2A | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AA33361M1 | |
| Feeding Needle | Fine Science Tools | 18061-38 | |
| Filter (30 µm) | Fisher Scientific | NC0922459 | |
| Filter paper sheet | Fisher Scientific | 09-802 | |
| Formalin (10%) | Fisher Scientific | 23-730-581 | |
| High salt diet | Teklad | TD.03142 | |
| OMNIgene.GUT | DNAgenotek | OM-200+ACP102 | |
| Osmotic mini-pumps | Alzet | MODEL 2002 | |
| PAP Pen | Millipore Sigma | Z377821-1EA | |
| Petri dish | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 21-236-18C | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| Serile Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | AAJ61196AP | |
| Smart spatula | Fisher Scientific | NC0133733 | |
| Stool collection device | Fisher Scientific | 50-203-7255 | |
| TBS Buffer | Fisher Scientific | R017R.0000 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | 9036-19-5 |
|
| Varimix platform rocker | Fisher Scientific | 09047113Q | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-41 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 1330-20-7, 100-41-4 |
Referências
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: a report From the American Heart Association. Circulation. 143 (8), 254 (2021).
- Wu, H., et al. The gut microbiota in prediabetes and diabetes: a population-based cross-sectional study. Cell Metabolism. 32 (3), 379-390 (2020).
- Crovesy, L., Masterson, D., Rosado, E. L. Profile of the gut microbiota of adults with obesity: a systematic review. European Journal of Clinical Nutrition. 74 (9), 1251-1262 (2020).
- Avery, E. G., et al. The gut microbiome in hypertension: recent advances and future perspectives. Circulation Research. 128 (7), 934-950 (2021).
- Perez-Matute, P., Iniguez, M., de Toro, M., Recio-Fernandez, E., Oteo, J. A. Autologous fecal transplantation from a lean state potentiates caloric restriction effects on body weight and adiposity in obese mice. Scientific Reports. 10 (1), 9388 (2020).
- Zoll, J., et al. Fecal microbiota transplantation from high caloric-fed donors alters glucose metabolism in recipient mice, independently of adiposity or exercise status. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 319 (1), 203-216 (2020).
- Hvas, C. L., et al. Fecal microbiota transplantation is superior to fidaxomicin for treatment of recurrent Clostridium difficile infection. Gastroenterology. 156 (5), 1324-1332 (2019).
- Kootte, R. S., et al. Improvement of insulin sensitivity after lean donor feces in metabolic syndrome is driven by baseline intestinal microbiota composition. Cell Metabolism. 26 (4), 611-619 (2017).
- Li, J., et al. Gut microbiota dysbiosis contributes to the development of hypertension. Microbiome. 5 (1), 14 (2017).
- Shi, H., et al. Restructuring the gut microbiota by intermittent fasting lowers blood pressure. Circulation Research. 128 (9), 1240-1254 (2021).
- Zhong, H. J., et al. Washed microbiota transplantation lowers blood pressure in patients with hypertension. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 679624 (2021).
- Ferguson, J. F., et al. High dietary salt-induced dendritic cell activation underlies microbial dysbiosis-associated hypertension. JCI Insight. 5 (13), 126241 (2019).
- Yu, E. W., et al. Fecal microbiota transplantation for the improvement of metabolism in obesity: The FMT-TRIM double-blind placebo-controlled pilot trial. PLoS Medicine. 17 (3), 1003051 (2020).
- Leong, K. S. W., et al. Effects of fecal microbiome transfer in adolescents with obesity: the gut bugs randomized controlled trial. JAMA Network Open. 3 (12), 2030415 (2020).
- Zhang, Z., et al. Impact of fecal microbiota transplantation on obesity and metabolic syndrome-a systematic review. Nutrients. 11 (10), 2291 (2019).
- Laubitz, D., et al. Dynamics of gut microbiota recovery after antibiotic exposure in young and old mice (a pilot study). Microorganisms. 9 (3), 647 (2021).
- Xiao, L., et al. High-fat feeding rather than obesity drives taxonomical and functional changes in the gut microbiota in mice. Microbiome. 5 (1), 43 (2017).
- Brunt, V. E., et al. Suppression of the gut microbiome ameliorates age-related arterial dysfunction and oxidative stress in mice. The Journal of Physiology. 597 (9), 2361-2378 (2019).
- Choo, J. M., Rogers, G. B. Gut microbiota transplantation for colonization of germ-free mice. STAR Protocols. 2 (3), 100610 (2021).
- Kim, T. T., et al. Fecal transplant from resveratrol-fed donors improves glycaemia and cardiovascular features of the metabolic syndrome in mice. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 315 (4), 511-519 (2018).
- Lu, H., et al. Subcutaneous angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e53191 (2015).
- Wang, Y., Thatcher, S. E., Cassis, L. A. Measuring blood pressure using a noninvasive tail cuff method in mice. Methods in Molecular Biology. 1614, 69-73 (2017).
- Ishimwe, J. A., et al. The gut microbiota and short-chain fatty acids profile in postural orthostatic tachycardia syndrome. Frontiers in Physiology. 13, 879012 (2022).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Laboratory Animals. 15 (1), 57-59 (1981).
- Ishimwe, J. A., Garrett, M. R., Sasser, J. M. 1,3-Butanediol attenuates hypertension and suppresses kidney injury in female rats. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 319 (1), 106-114 (2020).
- Bokoliya, S. C., Dorsett, Y., Panier, H., Zhou, Y. Procedures for fecal microbiota transplantation in murine microbiome studies. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711055 (2021).
- Van Beusecum, J. P., Xiao, L., Barbaro, N. R., Patrick, D. M., Kirabo, A. Isolation and adoptive transfer of high salt treated antigen-presenting dendritic cells. Journal of Visualized Experiments. (145), e59124 (2019).
- Harrison, D. G., Marvar, P. J., Titze, J. M. Vascular inflammatory cells in hypertension. Frontiers in Physiology. 3, 128 (2012).
- Sylvester, M. A., et al. Splenocyte transfer from hypertensive donors eliminates premenopausal female protection from ANG II-induced hypertension. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (3), 245-257 (2022).
- Reikvam, D. H., et al. Depletion of murine intestinal microbiota: effects on gut mucosa and epithelial gene expression. PLoS One. 6 (3), 17996 (2011).
- Le Roy, T., et al. Comparative evaluation of microbiota engraftment following fecal microbiota transfer in mice models: age, kinetic and microbial status matter. Frontiers in Microbiology. 9, 3289 (2019).
- Sun, J., et al. Fecal microbiota transplantation alleviated Alzheimer’s disease-like pathogenesis in APP/PS1 transgenic mice. Translation Psychiatry. 9 (1), 189 (2019).
- Kim, M., et al. Critical role for the microbiota in CX(3)CR1(+) intestinal mononuclear phagocyte regulation of intestinal T cell responses. Immunity. 49 (3), 151-163 (2018).
- Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
- Wilde, E., et al. Tail-cuff technique and its influence on central blood pressure in the mouse. Journal of the American Heart Association. 6 (6), 005204 (2017).
- Liu, X., et al. High-fiber diet mitigates maternal obesity-induced cognitive and social dysfunction in the offspring via gut-brain axis. Cell Metabolism. 33 (5), 923-938 (2021).
