Isolamento fecale murino e trapianto di microbiota
Summary
L’obiettivo qui è quello di delineare un protocollo per studiare i meccanismi della disbiosi nelle malattie cardiovascolari. Questo documento discute come raccogliere e trapiantare asetticamente campioni fecali murini, isolare l’intestino e utilizzare il metodo “Swiss-roll”, seguito da tecniche di immunocolorazione per interrogare i cambiamenti nel tratto gastrointestinale.
Abstract
La disbiosi del microbiota intestinale svolge un ruolo nella fisiopatologia dei disturbi cardiovascolari e metabolici, ma i meccanismi non sono ben compresi. Il trapianto di microbiota fecale (FMT) è un approccio prezioso per delineare un ruolo diretto del microbiota totale o delle specie isolate nella fisiopatologia della malattia. È un’opzione di trattamento sicura per i pazienti con infezione ricorrente da Clostridium difficile . Studi preclinici dimostrano che la manipolazione del microbiota intestinale è uno strumento utile per studiare il legame meccanicistico tra disbiosi e malattia. Il trapianto di microbiota fecale può aiutare a chiarire nuove terapie mirate al microbiota intestinale per la gestione e il trattamento della malattia cardiometabolica. Nonostante un alto tasso di successo nei roditori, rimangono cambiamenti traslazionali associati al trapianto. L’obiettivo qui è quello di fornire una guida nello studio degli effetti del microbioma intestinale nella malattia cardiovascolare sperimentale. In questo studio, viene descritto un protocollo dettagliato per la raccolta, la manipolazione, l’elaborazione e il trapianto del microbiota fecale negli studi murini. Le fasi di raccolta e lavorazione sono descritte sia per i donatori umani che per i roditori. Infine, descriviamo l’utilizzo di una combinazione delle tecniche Swiss-rolling e immunostaining per valutare la morfologia specifica dell’intestino e i cambiamenti di integrità nelle malattie cardiovascolari e nei relativi meccanismi del microbiota intestinale.
Introduction
I disturbi cardiometabolici, tra cui malattie cardiache e ictus, sono le principali cause globali di morte1. L’inattività fisica, la cattiva alimentazione, l’avanzare dell’età e la genetica modulano la fisiopatologia di questi disturbi. L’accumulo di prove supporta il concetto che il microbiota intestinale influenzi i disturbi cardiovascolari e metabolici, tra cui il diabete di tipo 22, l’obesità3 e l’ipertensione4, che possono essere la chiave per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici per queste malattie.
I meccanismi esatti con cui il microbiota causa malattie sono ancora sconosciuti e gli studi attuali sono altamente variabili, in parte a causa delle differenze metodologiche. Il trapianto di microbiota fecale (FMT) è un approccio prezioso per delineare un ruolo diretto del microbiota totale o delle specie isolate nella fisiopatologia della malattia. FMT è ampiamente usato negli studi sugli animali per indurre o sopprimere un fenotipo. Ad esempio, l’apporto calorico e il metabolismo del glucosio possono essere modulati trasferendo materia fecale da un donatore malato a un ricevente sano 5,6. Nell’uomo, FMT ha dimostrato di essere un’opzione di trattamento sicuro per i pazienti con infezione ricorrente da Clostridium difficile 7. Stanno emergendo prove a sostegno del suo uso nella gestione delle malattie cardiovascolari; ad esempio, FMT da pazienti magri a pazienti con sindrome metabolica migliora la sensibilità all’insulina8. La disbiosi intestinale è anche associata ad alta pressione sanguigna negli studi sia sull’uomo che sui roditori 9,10,11. FMT da topi alimentati con una dieta ricca di sale in topi privi di germi predispone i riceventi all’infiammazione e all’ipertensione12.
Nonostante l’alto tasso di successo dell’FMT nei roditori, permangono sfide traslazionali. Gli studi clinici che utilizzano FMT per trattare l’obesità e la sindrome metabolica indicano effetti minimi o nulli su questi disturbi13,14,15. Pertanto, sono necessari ulteriori studi per identificare ulteriori vie terapeutiche mirate al microbiota intestinale per il trattamento dei disturbi cardiometabolici. La maggior parte delle prove disponibili sul microbiota intestinale e sulle malattie cardiovascolari è associativa. Il protocollo descritto discute come utilizzare una combinazione di FMT e la tecnica Swiss-rolling per mostrare sia un’associazione tra malattia e microbiota intestinale sia valutare direttamente l’integrità di tutte le parti dell’intestinointestinale 16,17,18.
L’obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire una guida per lo studio degli effetti del microbioma intestinale nella malattia cardiovascolare sperimentale. Questo protocollo fornisce maggiori dettagli e considerazioni chiave nel disegno sperimentale per promuovere la traduzione fisiologica e aumentare il rigore e la riproducibilità dei risultati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un valido approccio per studiare il ruolo causale del microbiota intestinale nelle malattie cardiovascolari e metaboliche è quello di trasferire il microbiota totale o selezionare le specie di interesse in topi privi di germi. Qui, descriviamo i protocolli per raccogliere campioni fecali da esseri umani e topi ospitati convenzionalmente in topi privi di germi per studiare il ruolo del microbiota intestinale nei disturbi ipertensivi.
Nei topi, usiamo contenuti cecali raccolti asetticamente ela…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato supportato dal Vanderbilt Clinical and Translational Science Award Grant UL1TR002243 (to A.K.) del National Center for Advancing Translational Sciences; American Heart Association Grant POST903428 (a J.A.I.); e National Heart, Lung, and Blood Institute Grants K01HL13049, R03HL155041, R01HL144941 (ad A.K.) e NIH grant 1P01HL116263 (a V.K.). La Figura 1 è stata creata utilizzando Biorender.
Materials
| Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost | ThermoFisher | B40932 | |
| Anaerobic chamber | COY | 7150220 | |
| Apolipoprotein AI | Novus Biologicals | NBP2-52979 | |
| Artery Scissors – Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Bleach solution | Fisher Scientific | 14-412-53 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | B14 | |
| CD3 antibody | ThermoFisher | 14-0032-82 | |
| CD68 monoclonal antibody | ThermoFisher | 14-0681-82 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-221 | |
| CODA high throughput monitor | Kent Scientic Corporation | CODA-HT8 | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Disposable graduate transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119AM | |
| Disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-2A | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AA33361M1 | |
| Feeding Needle | Fine Science Tools | 18061-38 | |
| Filter (30 µm) | Fisher Scientific | NC0922459 | |
| Filter paper sheet | Fisher Scientific | 09-802 | |
| Formalin (10%) | Fisher Scientific | 23-730-581 | |
| High salt diet | Teklad | TD.03142 | |
| OMNIgene.GUT | DNAgenotek | OM-200+ACP102 | |
| Osmotic mini-pumps | Alzet | MODEL 2002 | |
| PAP Pen | Millipore Sigma | Z377821-1EA | |
| Petri dish | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 21-236-18C | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| Serile Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | AAJ61196AP | |
| Smart spatula | Fisher Scientific | NC0133733 | |
| Stool collection device | Fisher Scientific | 50-203-7255 | |
| TBS Buffer | Fisher Scientific | R017R.0000 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | 9036-19-5 |
|
| Varimix platform rocker | Fisher Scientific | 09047113Q | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-41 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 1330-20-7, 100-41-4 |
Referências
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