マウス糞便分離と微生物叢移植
1Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine Vanderbilt University Medical Center and Department of Molecular Physiology and Biophysics,Vanderbilt University, 2Division of Pediatric Nephrology Department of Pediatrics,Vanderbilt University Medical Center, 3Department of Pathology, Microbiology, and Immunology,Vanderbilt University Medical Center
Summary
ここでの目標は、心血管疾患における嚥下障害のメカニズムを調査するためのプロトコルの概要を説明することです。本稿では、マウスの糞便を無菌的に採取・移植し、腸管を分離し、「スイスロール」法を用いて消化管の変化を調べる免疫染色法について論じる。
Abstract
腸内細菌叢の嚥下障害は、心血管および代謝障害の病態生理学において役割を果たしていますが、そのメカニズムはよく理解されていません。糞便微生物叢移植(FMT)は、疾患の病態生理学における微生物叢または単離種全体の直接的な役割を描写するための貴重なアプローチです。再発性 クロストリジウム・ディフィシル 感染症の患者にとって安全な治療選択肢です。前臨床試験では、腸内細菌叢を操作することが、嚥下障害と疾患の間の機構的関連を研究するための有用なツールであることが示されています。糞便微生物叢移植は、心代謝疾患の管理と治療のための新しい腸内細菌叢標的治療法の解明に役立つ可能性があります。げっ歯類での高い成功率にもかかわらず、移植に関連する翻訳変化が残っています。ここでの目標は、実験的な心血管疾患における腸内細菌叢の影響を研究する際のガイダンスを提供することです。この研究では、マウス研究における糞便微生物叢の収集、取り扱い、処理、および移植のための詳細なプロトコルについて説明します。収集と処理の手順は、ヒトとげっ歯類の両方のドナーについて説明されています。最後に、スイスローリング技術と免疫染色技術を組み合わせて使用して、心血管疾患および関連する腸内細菌叢メカニズムにおける腸特異的な形態と完全性の変化を評価する方法について説明します。
Introduction
心臓病や脳卒中などの心血管代謝障害は、世界の主要な死因です1。身体的不活動、栄養不良、加齢、および遺伝学は、これらの障害の病態生理学を調節します。証拠の蓄積は、腸内細菌叢が2型糖尿病2、肥満3、高血圧4などの心血管障害および代謝障害に影響を与えるという概念を支持しており、これらの疾患に対する新しい治療アプローチの開発の鍵を握る可能性があります。
微生物叢が病気を引き起こす正確なメカニズムはまだ不明であり、現在の研究は方法論の違いもあって非常に多様です。糞便微生物叢移植(FMT)は、疾患の病態生理学における微生物叢または単離種全体の直接的な役割を描写するための貴重なアプローチです。FMTは、表現型を誘導または抑制するために動物実験で広く使用されています。例えば、カロリー摂取量およびグルコース代謝は、糞便物質を病気のドナーから健康なレシピエントに移すことによって調節することができる5,6。ヒトでは、FMTは再発性クロストリジウム・ディフィシル感染症の患者にとって安全な治療選択肢であることが示されています7。心血管疾患管理におけるその使用を裏付ける証拠が浮上しています。たとえば、痩せ症候群患者からメタボリックシンドローム患者へのFMTは、インスリン感受性を改善します8。腸内細菌叢症は、ヒトとげっ歯類の両方の研究で高血圧にも関連しています9,10,11。無菌マウスに高塩食を与えられたマウスからのFMTは、レシピエントを炎症および高血圧にかかりやすくする12。
げっ歯類におけるFMTの成功率が高いにもかかわらず、翻訳上の課題は残っています。肥満およびメタボリックシンドロームを治療するためにFMTを使用する臨床試験は、これらの障害に対する影響が最小限またはまったくないことを示しています13、14、15。したがって、心代謝障害の治療のために腸内細菌叢を標的とする追加の治療手段を特定するには、より多くの研究が必要です。腸内細菌叢と心血管疾患に関する入手可能な証拠のほとんどは連想的です。記載されたプロトコルは、FMTとスイスローリング技術の組み合わせを利用して、疾患と腸内細菌叢との関連の両方を示し、腸腸のすべての部分の完全性を直接評価する方法について説明しています16、17、18。
この方法の全体的な目標は、実験的心血管疾患における腸内細菌叢の影響を研究するためのガイダンスを提供することです。このプロトコルは、生理学的翻訳を促進し、所見の厳密さと再現性を高めるために、実験デザインにおけるより詳細と重要な考慮事項を提供します。
Protocol
ヴァンダービルト大学の施設動物管理および使用委員会は、この原稿に記載されているすべての手順を承認しました。ジャクソン研究所から購入した生後3か月のC57B1 / 6雄マウスを、実験動物の世話と使用のためのガイドに従って飼育および世話をしました。 1. ヒト糞便検体の採取・保管・加工 被験者が診療所にいる場合は、滅菌容器を使用して便サ…
Representative Results
上記の手順を 図 1 にまとめます。マウス盲腸内容物またはヒト糞便を滅菌生理食塩水に再懸濁してスラリーを調製し、無菌マウス(100μL)に経管栄養により、まず3日間連続して、次いで3日に1回ずつ与えます。プロトコルの最後に、血圧をテールカフ法で測定し、マウスを安楽死させ、腸内細菌叢の変化と心血管および代謝の変化を評価するために組織を採取します。…
Discussion
心血管疾患および代謝性疾患における腸内細菌叢の因果的役割を研究するための貴重なアプローチは、全微生物叢または選択した関心のある種を無菌マウスに移すことです。ここでは、高血圧性疾患における腸内細菌叢の役割を研究するために、ヒトおよび従来飼育マウスから無菌マウスに糞便サンプルを収集するプロトコルについて説明します。
マウスでは、無菌的?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立トランスレーショナルサイエンス推進センターからのヴァンダービルト臨床およびトランスレーショナルサイエンス賞助成金UL1TR002243(A.K.へ)によってサポートされました。アメリカ心臓協会助成金POST903428(JAIへ);国立心臓肺血液研究所助成金K01HL13049、R03HL155041、R01HL144941(AKへ)、およびNIH助成金1P01HL116263(VKへ)。 図 1 は Biorender を使用して作成されました。
Materials
| Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost | ThermoFisher | B40932 | |
| Anaerobic chamber | COY | 7150220 | |
| Apolipoprotein AI | Novus Biologicals | NBP2-52979 | |
| Artery Scissors – Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Bleach solution | Fisher Scientific | 14-412-53 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | B14 | |
| CD3 antibody | ThermoFisher | 14-0032-82 | |
| CD68 monoclonal antibody | ThermoFisher | 14-0681-82 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-221 | |
| CODA high throughput monitor | Kent Scientic Corporation | CODA-HT8 | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Disposable graduate transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119AM | |
| Disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-2A | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AA33361M1 | |
| Feeding Needle | Fine Science Tools | 18061-38 | |
| Filter (30 µm) | Fisher Scientific | NC0922459 | |
| Filter paper sheet | Fisher Scientific | 09-802 | |
| Formalin (10%) | Fisher Scientific | 23-730-581 | |
| High salt diet | Teklad | TD.03142 | |
| OMNIgene.GUT | DNAgenotek | OM-200+ACP102 | |
| Osmotic mini-pumps | Alzet | MODEL 2002 | |
| PAP Pen | Millipore Sigma | Z377821-1EA | |
| Petri dish | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 21-236-18C | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| Serile Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | AAJ61196AP | |
| Smart spatula | Fisher Scientific | NC0133733 | |
| Stool collection device | Fisher Scientific | 50-203-7255 | |
| TBS Buffer | Fisher Scientific | R017R.0000 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | 9036-19-5 |
|
| Varimix platform rocker | Fisher Scientific | 09047113Q | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-41 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 1330-20-7, 100-41-4 |
Referências
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Citar este artigo
Ishimwe, J. A., Zhong, J., Kon, V., Kirabo, A. Murine Fecal Isolation and Microbiota Transplantation. J. Vis. Exp. (195), e64310, doi:10.3791/64310 (2023).