Summary
يصف هذا البروتوكول إجراء لإجراء كروماتوغرافيا استبعاد حجم الفلورسنت (FSEC) على البروتينات الغشائية لتقييم جودتها للتحليل الوظيفي والهيكلي النهائي. يتم عرض نتائج FSEC التمثيلية التي تم جمعها للعديد من المستقبلات المقترنة بالبروتين G (GPCRs) في ظل ظروف خالية من المنظفات وخالية من المنظفات.
Abstract
أثناء التوضيح الهيكلي للبروتين الغشائي والتوصيف الفيزيائي الحيوي ، من الشائع تجربة العديد من تركيبات البروتين التي تحتوي على علامات مختلفة ، واقتطاعات ، وحذف ، وإدخالات شريك الاندماج ، وطفرات التثبيت للعثور على واحدة لا يتم تجميعها بعد الاستخراج من الغشاء. علاوة على ذلك ، يعد الفحص العازل لتحديد المنظف أو المادة المضافة أو الليجند أو البوليمر الذي يوفر أكثر الظروف استقرارا لبروتين الغشاء ممارسة مهمة. يوفر التوصيف المبكر لجودة البروتين الغشائي بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد حجم الفلورسنت أداة قوية لتقييم وترتيب التركيبات أو الظروف المختلفة دون الحاجة إلى تنقية البروتين ، كما تقلل هذه الأداة من متطلبات العينة. يجب وضع علامة على البروتينات الغشائية بشكل فلوري ، عادة عن طريق التعبير عنها بعلامة GFP أو ما شابه ذلك. يمكن إذابة البروتين مباشرة من خلايا كاملة ثم توضيحه بشكل فظ عن طريق الطرد المركزي. بعد ذلك ، يتم تمرير البروتين إلى أسفل عمود استبعاد الحجم ، ويتم جمع أثر الفلورسنت. هنا ، يتم تقديم طريقة لتشغيل FSEC وبيانات FSEC التمثيلية على GPCR يستهدف مستقبلات سفينغوسين -1 فوسفات (S1PR1) ومستقبلات السيروتونين (5HT2AR).
Introduction
يستخدم كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) ، المعروف أيضا باسم كروماتوغرافيا ترشيح الهلام ، بشكل شائع في علم البروتين1. خلال SEC ، يتم فصل البروتينات بناء على نصف قطرها الهيدروديناميكي ، وهو دالة لحجم البروتين وشكله2. باختصار ، يتم تحقيق هذا الفصل من خلال تطبيق عينات البروتين تحت التدفق على طبقة معبأة من الخرز المسامي الذي يعمل كمنخل جزيئي. غالبا ما تكون الخرزات المستخدمة عبارة عن أغاروز متقاطع مع مجموعة محددة من أحجام المسام للسماح للبروتينات إما بالدخول أو الاستبعاد من مسام الخرز3،4،5،6،7. تقضي البروتينات ذات أنصاف الأقطار الهيدروديناميكية الأصغر نسبة أكبر من الوقت داخل المسام ، وبالتالي تتدفق عبر السرير المعبأ بمعدل أبطأ ، بينما تقضي البروتينات الأكبر نسبة أكبر من الوقت خارج الخرزات (الحجم المستبعد) وتتحرك عبر السرير المعبأ بمعدل أسرع. يمكن استخدام SEC كخطوة لتنقية البروتين عند استخدام عمود تحضيري1. عند استخدام عمود تحليلي ، يمكن استخدام SEC لتحليل جودة البروتين وخصائصه2. على سبيل المثال ، تميل مجاميع البروتين التي قد تكون موجودة في عينة وتشير إلى بروتين رديء الجودة إلى أن تكون كبيرة جدا ، مما يعني أنها تنتقل فقط في الحجم المستبعد ، وبالتالي ، يتم استخلاصها من العمود في أقرب نقطة ؛ يشار إلى هذا المجلد باسم العمود باطل أو مجلد باطل. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام معايير الوزن الجزيئي لمعايرة العمود ، مما يسمح باستيفاء الوزن الجزيئي المقدر للبروتين محل الاهتمام من منحنى قياسي.
عادة ، يتم استخدام امتصاص البروتين عند 280 نانومتر لمراقبة شطف البروتين من عمود استبعاد الحجم. هذا يقيد استخدام SEC كأداة تحليل حتى يصبح البروتين محل الاهتمام خاليا إلى حد كبير من البروتينات الملوثة ، على سبيل المثال ، في الخطوة الأخيرة من تنقية البروتين. ومع ذلك ، يستخدم SEC الفلوري (FSEC) بروتينا مثيرا للاهتمام يحمل علامة الفلورسنت. لذلك ، يمكن استخدام إشارة الفلورسنت لمراقبة شطف البروتين محل الاهتمام على وجه التحديد في وجود بروتينات أخرى أو حتى مخاليط خام 8,9. علاوة على ذلك ، نظرا لأن إشارات الفلورسنت حساسة للغاية ، يمكن إجراء تحليل ناجح على عينات ذات كميات منخفضة للغاية من البروتين. غالبا ما يتم تصنيف البروتين محل الاهتمام بالفلورسنت من خلال تضمين بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) أو علامة GFP المحسنة (eGFP) في بنية التعبير. يمكن بعد ذلك مراقبة إشارة الفلورسنت عن طريق الإثارة عند 395 نانومتر أو 488 نانومتر واكتشاف انبعاث الفلورسنت عند 509 نانومتر أو 507 نانومتر ل GFP أو eGFP ،على التوالي 10.
إن فائدة استخدام إشارة الفلورسنت لمراقبة شطف البروتين من عمود SEC تجعل FSEC أداة قيمة لتحليل عينات البروتين الغشائي عندما تكون مستويات التعبير ضعيفة بشكل خاص مقارنة بالبروتينات القابلة للذوبان. بشكل حاسم ، يمكن تحليل جودة وخصائص البروتينات الغشائية مباشرة بعد الذوبان من المحللين الخام دون الحاجة إلى تحسين عملية التنقية أولا11,12. لهذه الأسباب ، يمكن استخدام FSEC لتحليل جودة بروتين الغشاء بسرعة مع استكشاف العوامل المختلفة التي قد تكون مطلوبة لتحسين سلوك بروتين الغشاء في المحلول. على سبيل المثال ، من الشائع تجربة العديد من التركيبات التي تحتوي على علامات مختلفة ، واقتطاعات ، وحذف ، وإدخالات شريك الاندماج ، وطفرات التثبيت للعثور على واحدة لم يتم تجميعها بعد الاستخراج من الغشاء13,14. علاوة على ذلك ، فإن الغربلة العازلة لتحديد المنظفات أو المواد المضافة أو الرباط أو البوليمر التي توفر أكثر الظروف استقرارا لبروتين الغشاء يمكن أن تحدد أفضل تركيبة عازلة لتنقية البروتين أو لتوفير الاستقرار للاستخدامات النهائية ، مثل المقايسات الفيزيائية الحيوية أو التوصيف الهيكلي.
وبالتالي ، فإن الهدف العام لطريقة FSEC هو جمع ملف تعريف شطف عمود SEC لبروتين الغشاء المستهدف ذي الأهمية. علاوة على ذلك ، عند استخدام التألق ، يتم جمع تتبع SEC هذا في أقرب وقت ممكن في تحسين التركيبات والظروف قبل أي تنقية طويلة. يمكن استخدام تتبع FSEC كأداة مقارنة للحكم على احتمالية نجاح تنقية بروتين الغشاء بظروف عازلة مختلفة أو تركيبات بروتين غشائية. وبهذه الطريقة ، يمكن استخدام مجموعة ملفات تعريف FSEC كعملية تكرارية سريعة للوصول إلى تصميم البناء الأمثل وتكوين المخزن المؤقت قبل بذل الجهد لتوليد كميات البروتين النقي المطلوبة لطرق التحليل الأخرى.
Protocol
1. تحضير المنظفات والمخزن المؤقت ل FSEC
- تحضير محلول مخزون المنظفات.
- لتحضير محلول مرق سعة 20 مل ، قم بوزن 4 جم من مسحوق دوديسيل مالتوسيد (DDM) و 0.4 جم من مسحوق كوليستريل هيميسوتشينات (CHS) ، واجعله يصل إلى 20 مل باستخدام H2O المقطر من الدرجة المختبرية.
- بعد إضافة جميع المكونات ، اخلطها مع انعكاس طرف إلى طرف عند 4 درجات مئوية حتى تذوب المكونات تماما. يوصى بالخلط بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
- قم بتخزين مخزون المنظفات في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. إذا كانت هناك حاجة إلى استخدام المرق على الفور ، فقم بتخزين مخزون المنظفات على الجليد.
ملاحظة: كان مخزون المنظفات القياسي المستخدم في هذا العمل عبارة عن خليط DDM بنسبة 20٪ (وزن / حجم) و 2٪ (وزن / حجم) CHS (انظر جدول المواد). يمكن استخدام منظفات مختلفة (على سبيل المثال ، لوريل مالتوز نيوبنتيل جلايكول. LMNG) ، أو استخدام الاستخراج الخالي من المنظفات مع البوليمرات مثل حمض الستايرين الماليك (SMA). يجب تحديد ذلك عند تصميم الظروف التجريبية المراد اختبارها.
- إعداد العازلة للذوبان.
- قم بإعداد مخزن مؤقت للذوبان عن طريق الجمع بين الوزن أو الحجم الصحيح للمكونات لتحقيق تركيز نهائي قدره 100 mM HEPES و 200 mM NaCl و 20٪ (v / v) من الجلسرين و 1x كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني (انظر جدول المواد) في دورق.
ملاحظة: في هذه الدراسة ، كان تحضير 50 مل من محلول الذوبان كافيا لمعالجة خمس عينات. - أضف حجما 0.7 (على سبيل المثال ، 35 مل في حالة صنع 50 مل من المخزن المؤقت) من H2O المقطر من الدرجة المختبرية إلى الدورق.
- امزج على محرك مغناطيسي ، وباستخدام مقياس الأس الهيدروجيني ، اضبط درجة الحموضة العازلة إلى 7.5 عن طريق إضافة قطرة من NaOH المركزة.
- باستخدام أسطوانة قياس ، قم بتعبئة المخزن المؤقت إلى الحجم النهائي المطلوب باستخدام H2O المقطر من الدرجة المختبرية.
- قم بإعداد مخزن مؤقت للذوبان عن طريق الجمع بين الوزن أو الحجم الصحيح للمكونات لتحقيق تركيز نهائي قدره 100 mM HEPES و 200 mM NaCl و 20٪ (v / v) من الجلسرين و 1x كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني (انظر جدول المواد) في دورق.
- قم بإعداد المخزن المؤقت لتشغيل SEC.
- قم بإعداد المخزن المؤقت لتشغيل SEC من خلال الجمع بين الوزن أو الحجم الصحيح للمكونات لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 100 mM HEPES و 150 mM NaCl و 10٪ (v / v) من الجلسرين في دورق.
ملاحظة: في هذه الدراسة ، كان تحضير 600 مل من المخزن المؤقت SEC كافيا لتشغيل خمس عينات. - أضف حجما 0.7 (على سبيل المثال ، 420 مل في حالة صنع 600 مل من المخزن المؤقت) من H2O المقطر من الدرجة المختبرية إلى الدورق.
- امزج على محرك مغناطيسي ، وباستخدام مقياس الأس الهيدروجيني ، اضبط درجة الحموضة العازلة إلى 7.5 عن طريق إضافة قطرة من NaOH المركزة.
- باستخدام أسطوانة قياس ، قم بتعبئة المخزن المؤقت إلى الحجم النهائي المطلوب باستخدام H2O المقطر من الدرجة المختبرية.
- قم بتصفية المخزن المؤقت SEC من خلال مرشح مسام 0.45 ميكرومتر أعلى الزجاجة تحت فراغ (انظر جدول المواد).
- بمجرد مرور المخزن المؤقت عبر الفلتر ، قم بتفريغه عن طريق تركه تحت الفراغ حتى لا تظهر المزيد من الفقاعات عند اهتزازه.
- أضف تركيزا نهائيا بنسبة 0.03٪ (وزن / حجم) DDM و 0.003٪ (وزن / حجم) CHS إلى المخزن المؤقت SEC عن طريق إضافة الحجم المطلوب من مخزون المنظفات المحضر في الخطوة 1 (على سبيل المثال ، 0.9 مل في حالة صنع 600 مل من المخزن المؤقت SEC).
- قم بتبريد المخزن المؤقت مسبقا قبل الاستخدام.
ملاحظة: يمكن استخدام مخازن مؤقتة مختلفة حسب الظروف التي تم اختبارها. على سبيل المثال ، إذا تم اختبار تأثير المنظفات المختلفة على البروتين محل الاهتمام ، فمن الأفضل عمل مخزن مؤقت بنفس المنظف المستخدم لإذابة البروتين. في حالة اختبار الظروف الخالية من المنظفات باستخدام SMA ، يجب حذف المنظف من المخزن المؤقت SEC تماما. ومع ذلك ، راجع قسم المناقشة للحصول على مزيد من التفاصيل حول تعديلات البروتوكول لفحص المنظفات.
- قم بإعداد المخزن المؤقت لتشغيل SEC من خلال الجمع بين الوزن أو الحجم الصحيح للمكونات لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 100 mM HEPES و 150 mM NaCl و 10٪ (v / v) من الجلسرين في دورق.
2. إعداد عينة ل FSEC
- تحضير الكريات الخلية.
ملاحظة: نقطة البداية للفحص هي حصاد حبيبات الخلية من ثقافة تعبير الخلية المعلقة للبروتين الموسوم ب GFP (أو أي بروتين آخر يحمل علامة الفلورسنت) محل الاهتمام. تعتمد المواعيد والظروف الدقيقة للحصاد على البروتين الذي يتم التعبير عنه ، وخط الخلية المستخدم ، والظروف التي نمت فيها الخلايا ، والطريقة التي تم بها تحفيز التعبير عن البروتين. هذه التفاصيل خارج نطاق هذا البروتوكول. في هذه الدراسة ، تم استخدام 0.5-1 جم من حبيبات الخلايا Sf21 لكل حالة يتم اختبارها ، وهو ما يتوافق مع 25-50 مل من المزرعة بعد 2-3 أيام من الإصابة بحوالي 4 × 106 خلايا قابلة للحياة / مل من تخفيف 1:20 من الفيروس البقعي P2. يرجى ملاحظة أن البروتوكول الموصوف هنا قد تم اختباره ووجد أنه يعمل بشكل جيد على قدم المساواة مع الأوزان الرطبة المماثلة لكريات الخلايا من خطوط eukaryoticcell الأخرى (على سبيل المثال, HEK293E).- عندما تكون الخلايا من الثقافات المعلقة جاهزة للحصاد ، قم بنقل حصص الثقافة 25-50 مل إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مل.
- موازنة الأنابيب ، واستخدام جهاز طرد مركزي على الطاولة في دلو متأرجح للخارج (انظر جدول المواد) عند 2000 × جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتكوير الخلايا.
- قم بإزالة وتجاهل طاف الثقافة عن طريق قلبه برفق بعيدا ، أو استخدم ماصة سعة 50 مل مع حشو ماصة إذا كانت حبيبات الخلية فضفاضة بشكل خاص.
- إذا كان سيتم استخدام الخلايا على الفور للتحليل ، فضع حبيبات الخلية على الثلج ، وانتقل مباشرة إلى الخطوة 5. إذا كان سيتم حفظ الخلايا لاستخدامها في مرحلة لاحقة ، فقم بتجميد الخلايا بوضعها عند -80 درجة مئوية.
- إذا تم تخزين حبيبات الخلية عند -80 درجة مئوية ، فقم بإذابتها بسرعة عن طريق حضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة أو حتى تختفي العينة من التجميد. انقل العينة على الفور إلى الثلج باتباع هذه الخطوة.
- أعد تعليق العينة وإذابتها.
- أضف 2 مل من المخزن المؤقت للذوبان (الخطوة 1.2) إلى حبيبات الخلية.
- احتضانها مع انعكاس طرف على طرف عند 4 درجات مئوية لمدة 15-30 دقيقة حتى تصبح متجانسة.
- أضف مخزون المنظفات سابقة الخلط (الخطوة 1.1) (على سبيل المثال ، 100 ميكرولتر من 20٪ DDM / 2٪ مخزون CHS) للحصول على تركيز نهائي بنسبة 1٪ DDM / 0.1٪ CHS.
- يذوب لمدة 30 دقيقة مع انعكاس طرف إلى طرف عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: إذا كان ذلك مرغوبا فيه ، يمكن اختبار حالات متعددة بالتوازي. يعتمد عدد العينات المتوازية التي يمكن معالجتها مرة واحدة على النظام المتاح لتشغيل تجربة SEC. في الإعداد الموضح هنا ، كان من الممكن معالجة ما يصل إلى خمس عينات في وقت واحد.
- قم بإجراء خطوة طرد مركزي منخفضة السرعة.
- أجهزة الطرد المركزي العينة في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا (4 درجات مئوية) في دلو متأرجح للخارج عند 2000 × جم لمدة 15 دقيقة.
- قم بإجراء خطوة طرد مركزي عالية السرعة.
- انقل المادة الطافية بعناية من جهاز الطرد المركزي منخفض السرعة إلى أنابيب الطرد المركزي الفائقة (على سبيل المثال ، أنابيب 0.5-2 مل) باستخدام إبرة حادة متصلة بحقنة سعة 5 مل ، مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات من الدوران منخفض السرعة.
- وازن أزواج الأنابيب في حدود 0.05 جم ، وضعها في دوار طرد مركزي فائق الزاوية ثابت الزاوية (انظر جدول المواد).
- أجهزة الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة عند 250000 × جم.
3. كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC)
- قم بإعداد نظام كروماتوغرافيا البروتين السائل السريع (FPLC) ، وموازنة العمود.
- قم بإعداد النظام باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد) ، على سبيل المثال ، عن طريق ملء النظام بمخزن مؤقت SEC وتطهير مضخات الهواء.
- قم بتوصيل عمود SEC ب FPLC ، مما يضمن عدم دخول الهواء إلى العمود. يتم تحقيق ذلك عن طريق تطبيق الضغط الخلفي على عمود SEC باستخدام حقنة مملوءة بالماء (متصلة بأسفل العمود) من أجل إجراء اتصال قطرة إلى إسقاط مع مسار التدفق لنظام FPLC.
- قم بموازنة عمود SEC مسبقا عن طريق غسله أولا في أحجام عمود 1.5 (36 مل لعمود 24 مل) من H2O المقطر والمصفى من الدرجة المختبرية ، متبوعا بأحجام 1.5 عمود من المخزن المؤقت SEC بمعدل التدفق والضغط الموصى بهما للعمود (انظر جدول المواد).
ملاحظة: كان نظام FPLC المستخدم في هذه الدراسة لأداء FSEC في بيئة باردة ويحتوي على صمام حلقة بخمسة مواضع ومجمع كسر لوحة بستة مواضع. يسمح هذا الإعداد بتحميل خمس عينات وتشغيلها بالتتابع أسفل نفس العمود بطريقة آلية دون الحاجة إلى تدخل يدوي بين عمليات التشغيل. لإجراء تجارب SEC ، تم استخدام عمود 24 مل معبأ مسبقا متاح تجاريا (انظر جدول المواد) ، والذي يحتوي على راتنج يسمح بحل البروتينات في نطاق الوزن الجزيئي من 10-600 كيلو دالتون. إذا كان البروتين محل الاهتمام كبيرا بشكل خاص ، فيمكن استخدام مصفوفة عمود بديلة بدلا من ذلك ، مما يسمح بفصل البروتينات حتى 5000 كيلو دالتون في الوزن الجزيئي. يرجى ملاحظة أن وجود المذيلة المنظف / الدهون سيزيد من الحجم الكلي لبروتين الغشاء بمقدار 150 كيلو دالتون > ، اعتمادا على البروتين والمنظف المستخدم.
- قم بتطبيق العينة على العمود، وقم بتشغيل تجربة SEC.
- انقل المادة الطافية من خطوة الطرد المركزي عالية السرعة إلى حقنة سعة 1 مل باستخدام إبرة حادة متصلة بالمحقنة. هذا يسمح باستعادة العينة من أنبوب الطرد المركزي دون إزعاج الحبيبات.
- اضبط حلقة العينة على التحميل. قم بملء حلقة عينة 500 ميكرولتر عن طريق حقن 600-700 ميكرولتر من العينة من المحقنة في منفذ التحميل. اعتمادا على النظام المستخدم ، يمكن برمجة خطوة التحميل هذه في الطريقة لضمان عدم ارتكاب أي أخطاء.
- أثناء الطريقة ، قم بحقن العينة من الحلقة في العمود عن طريق إفراغها ب 4 مل من المخزن المؤقت SEC بمعدل التدفق والضغط الموصى بهما للعمود (انظر جدول المواد).
- قم بتشغيل العمود بنفس معدل التدفق حتى يتم تمرير 1.5 وحدة تخزين عمود (36 مل لعمود 24 مل) من المخزن المؤقت.
- عند 0.25 من حجم العمود (6 مل لعمود 24 مل) ، ابدأ في جمع كسور 0.2 مل لجمع 90 كسرا.
ملاحظة: نظرا لأنه من المتوقع أن يكون حجم الفراغ للعمود 0.3 حجم عمود ، فإن بدء جمع الكسور قبل ذلك مباشرة يضمن مراقبة شطف كل البروتين ، بما في ذلك أي بروتين موجود في حجم الفراغ.
4. جمع وتحليل أثر الفلورسنت
- انقل العينات من مجمع الكسر (الخطوة 3.2.5) إلى لوحة 96 بئرا ، واقرأ إشارة الفلورسنت.
- قبل أخذ قراءة مضان ، قم بتخفيف العينات التي تم جمعها. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، انقل 90 ميكرولتر من H2O المقطر من الدرجة المختبرية من خزان إلى كل بئر من صفيحة قاع مسطحة غير شفافة ذات 96 بئرا (انظر جدول المواد).
- إذا تم جمع الكسور في كتلة 96 بئرا خلال الخطوة 3.2.5 ، فاستخدم ماصة متعددة القنوات لنقل 10 ميكرولتر من كسور SEC من الكتلة إلى لوحة 96 بئرا ذات القاع المسطح غير الشفاف ، واخلطها عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. خلاف ذلك ، إذا تم جمع أجزاء SEC في أنابيب فردية خلال الخطوة 3.2.5 ، فقم بنقل 10 ميكرولتر من كل جزء إلى الصفيحة ذات القاع المسطح غير الشفاف المكونة من 96 بئرا واحدة تلو الأخرى ، مع سحب السحب لأعلى ولأسفل في كل مرة لخلط العينات.
- ضع اللوحة ذات القاع المسطح غير الشفاف ذات 96 بئرا في قارئ اللوحة ، وقم بقياس التألق. إذا كان GFP هو ملصق الفلورسنت (المستخدم هنا) ، فاضبط الإثارة في أقرب وقت ممكن إلى 488 نانومتر ، واكتشف انبعاث الفلورسنت في أقرب وقت ممكن من 507 نانومتر.
ملاحظة: يعتمد التخفيف المطلوب قبل أخذ قراءة التألق على الكمية الإجمالية للبروتين محل الاهتمام الموجود في ثقافة التعبير وحساسية قارئ اللوحة المستخدم. في الأمثلة الموضحة في هذه الدراسة ، تم تخفيف العينات 10 أضعاف في الماء. كاقتراح لنقطة البداية ، يجب تخفيف الكسور من 5 إلى 10 أضعاف في الماء أو المخزن المؤقت قبل اكتشافها. إذا كانت إشارة تتبع FSEC المسجلة منخفضة بشكل خاص ، فيمكن استخدام تخفيفات أصغر أو حتى عينة غير مخففة بدلا من ذلك. كان الجهاز المستخدم للكشف في هذه الدراسة عبارة عن قارئ صفائح قادر على الإثارة عند 488 نانومتر والكشف عن انبعاث الفلورسنت عند 507 نانومتر (انظر جدول المواد).
- ارسم آثار FSEC.
- تصدير البيانات من قارئ اللوحة بتنسيق خام (نص خام أو ملف قيم مفصولة بفواصل). سيتم رسم هذه البيانات الأولية على المحور Y لتتبع FSEC.
- بالنسبة للمحور X ، احسب الحجم الذي تم فيه جمع كل كسر. يجب أن يكون البئر الأول هو حجم الشطف الذي تم فيه جمع الكسر الأول لحساب تأخير التجزئة (6 مل في هذا المثال). يجب أن تزيد الكسور بعد ذلك بالتتابع بمقدار حجم الكسر المجمع (0.2 مل في هذا المثال).
- بمجرد حساب بيانات المحور X والمحور Y ، انسخ البيانات والصقها في برنامج الرسوم البيانية (انظر جدول المواد) من أجل رسم إشارة الفلورسنت في كل بئر مقابل الحجم الذي استخرجت به من العمود.
ملاحظة: يوضح الشكل 1 تمثيلا تخطيطيا للخطوات المطلوبة لتشغيل تجربة FSEC.
- تحليل آثار FSEC.
- قم بتقييم كمية شطف البروتين عند حجم الفراغ (حوالي 8 مل لعمود 24 مل) ، مما يشير إلى أن البروتين كبير جدا في الحجم ومن المحتمل أن يكون مكشوفا / مجمعا.
- قم بتقييم كمية البروتين الملتوية في أي قمم لاحقة ، والتي تشير إلى البروتين المطوي. من المتوقع أن يكون هذا بين 10 مل و 16 مل لعمود 24 مل اعتمادا على حجم البروتين (عندما يرتبط بمنظف / مذيلة دهنية). انتبه جيدا لشكل الذروة ، خاصة إذا كانت قمة عريضة أو مقسمة تمتد أكبر من 3-4 مل (لعمود 24 مل) ، لأن هذا يشير إلى عينة متعددة التشتت.
- احسب النسبة بين ارتفاع الذروة الأحادية وارتفاع ذروة الفراغ بقسمة أقصى إشارة مسجلة في قمة المونومر على أقصى إشارة في قمة الفراغ.
ملاحظة: تمثل هذه القيمة مؤشر التشتت الأحادي وتسمح بقياس كمي لجودة البروتين ؛ تشير القيم الأكبر إلى أفضل جودة ممكنة ، بينما تشير القيم الأقل من 1 إلى عينات إشكالية ، لأنها تحتوي على بروتين مجمع أكثر من البروتين المطوي. - إذا كان سيتم مقارنة عمليات تشغيل FSEC المتعددة وكانت الميزة الأكثر أهمية هي كمية المونومر في كل حالة ، فقم برسم الآثار كإشارة أولية مسجلة بواسطة قارئ اللوحة (على سبيل المثال ، RFU).
ملاحظة: إذا كانت مقارنة كمية المونومر مقارنة بالبروتين غير المطوي أكثر أهمية ، فيجب تطبيع الإشارة إلى نسبة مئوية من إجمالي الإشارة باستخدام القراءات الدنيا والقصوى في التتبع ، مما سيبرز الاختلافات في النسبة بين البروتين المجمع والأحادي بين الآثار.
الشكل 1: تمثيل تخطيطي للخطوات المطلوبة لإجراء تجربة FSEC. (1) الخلايا التي تعبر عن البروتين الموسوم بالفلورسنت محل الاهتمام قابلة للذوبان. (2) يتم توضيح الذوبان الخام أولا بدوران منخفض السرعة ، يليه (3) دوران عالي السرعة. (4) يتم تحميل طاف العينة الموضح وتشغيله على عمود SEC مناسب ، و (5) يتم جمع الكسور. (6) يتم نقل عينات من الكسور إلى لوحة 96 بئرا ، ويتم الكشف عن إشارة فلورسنت GFP باستخدام قارئ لوحة ل (7) رسم تتبع FSEC. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Representative Results
أولا ، تم التحقيق في النطاق الديناميكي والحدود الدنيا للكشف عن eGFP لقارئ اللوحة المستخدم في هذه الدراسة. تم تخفيف معيار eGFP المنقى للتركيز المعروف في حجم نهائي 50 ميكرولتر إلى 50 نانوغرام · ميكرولتر − 1 ، 25 نانوغرام · ميكرولتر − 1 ، 12.5 نانوغرام · ميكرولتر − 1 ، 6.25 نانوغرام · ميكرولتر − 1 ، 3.125 نانوغرام · ميكرولتر − 1 ، 0.78125 نانوغرام · ميكرولتر − 1 ، و 0.390625 نانوغرام · ميكرولتر − 1 ، وتمت قراءة التألق باستخدام إثارة 488 نانومتر وانبعاث 507 نانومتر (الشكل 2 ). أشارت هذه التجربة إلى أن قارئ الألواح لديه حد اكتشاف أقل يبلغ 30 نانوغرام من البروتين المسمى eGFP لكل بئر ونطاق ديناميكي يصل إلى 500 نانوغرام من البروتين المسمى eGFP لكل بئر قبل تشبع الإشارة. باستخدام قيمة الحد الأدنى وبافتراض أن شطف البروتين يقتصر على 0.33 من حجم العمود ، يلزم أقل من 1.28 ميكروغرام من البروتين المسمى eGFP محل الاهتمام لتحميل عمود SEC من أجل ملاحظة إشارة FSEC قابلة للاكتشاف.
الشكل 2: المنحنى القياسي eGFP. الرسم البياني المبعثر للإشارة الفلورية لمعيار eGFP المنقى المخفف إلى 50 ng·μL−1 و 25 ng·μL−1 و 12.5 ng·μL−1 و 6.25 ng·μL−1 و 3.125 ng·μL−1 و 1.5625 ng·μL−1 و 0.390625 ng·μL−1. (أ) تعرض جميع التخفيفات، بما في ذلك التخفيفات ذات الإشارة المشبعة. (B) رسم بياني مبعثر مكبر، يتضمن فقط المعايير التي تقع في النطاق الديناميكي لقارئ اللوحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ثانيا ، تمت معايرة عمود 24 مل المستخدم في هذه الدراسة بمعايير الوزن الجزيئي. باستخدام نفس ظروف المخزن المؤقت والتشغيل المستخدمة في تحليل FSEC ، تم حقن معايير الوزن الجزيئي الأزرق ديكستران (>2000 كيلو دالتون) ، والفيريتين (440 كيلو دالتون) ، والألدولاز (158 كيلو دالتون) ، والكونالبومين (75 كيلو دالتون) ، والبيضاوي (43 كيلو دالتون) بشكل فردي وتشغيله عبر العمود ، وتم جمع آثار الشطف عند امتصاص 280 نانومتر. كانت أحجام الشطف المسجلة 8.9 مل و 12.4 مل و 15.2 مل و 16.9 مل و 18 مل على التوالي. عندما تم تحويل أحجام الشطف هذه إلى Kav (المعادلة 1) ورسمها مقابل الأوزان الجزيئية اللوغاريتمية ، يمكن أن يكون المنحنى القياسي مناسبا. وقد سمح ذلك بتقدير الوزن الجزيئي ل GPCRs التي تم اختبارها في هذه الدراسة عن طريق استيفاء المنحنى القياسي (الشكل 3). على سبيل المثال ، أشار تتبع FSEC لمستقبلات السيروتونين GPCR 2A (5HT2AR) بعد الذوبان في المنظف DDM إلى حجم شطف يبلغ 13.4 مل. يقع حجم الشطف 5HT2AR بين أحجام الشطف المسجلة للفيريتين والألدولاز ويوفر وزنا جزيئيا يقدر بحوالي 300 كيلو دالتون. يبلغ حجم بنية 5HT 2A R المستخدمة في هذه الدراسة حوالي 50 كيلو دالتون (بما في ذلك علامة eGFP) ، مما يعني أنه إذا افترض أن 5HT2AR أحادي الحجم ، فيمكن أن يعزى250كيلو دالتون من الوزن الجزيئي إلى مذيلة المنظفات / الدهون DDM. معادلة تحويل أحجام الشطف هي كما يلي (المعادلة 1):
(المعادلة 1)
حيث V e هو حجم الشطف ، V0 هو حجم فراغ العمود ، و Vc هو إجمالي حجم العمود.
الشكل 3: منحنى معايرة عمود SEC باستخدام معايير الوزن الجزيئي. (أ) تتبع FSEC تمثيلي ل 5HT2AR قابل للذوبان في DDM ، مع مواضع الشطف النسبية لمعايير الوزن الجزيئي الأزرق ديكستران (باطل) ، فيريتين ، ألدولاز ، كونالبومين ، وألبومين البيضاوي ملحوظ. يتم تلوين الفيريتين والألدولاز والكونالبومين والبيضاوي باللون الأخضر والأرجواني والأحمر والسماوي على التوالي. (B) منحنى معايرة الوزن الجزيئي باستخدام مواضع الشطف للمعايير بعد التحويل إلى Kav (المعادلة 1) المرسومة مقابل الوزن الجزيئي اللوغاريتمي (Mr). تم استيفاء Mr من 5HT2AR في DDM من المنحنى باستخدام Kav ويتم عرضه على المنحنى (المربع الأزرق). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ثم تم استخدام FSEC لتقييم جودة وخصائص مستقبلات GPCR sphingosine-1-phosphate (S1PR1)15. تمت معالجة خلايا الحشرات التي تعبر عن S1PR 1 البشري الموسوم ب GFP من أجل FSEC كما هو موضح في البروتوكول (الشكل 1).
أولا ، تم استكشاف ظروف استخراج الغشاء المثلى من خلال اختبار المنظفات DDM و LMNG ضد الاستخراج الخالي من المنظفات باستخدام SMA (الشكل 4A). تم استخدام مؤشر التشتت الأحادي لتقييم جودة عينة البروتين والنسبة بين البروتين في الفراغ (~ 8 مل احتفاظ العمود) مقارنة بالعينة أحادية التشتت (14-15 مل احتفاظ العمود). أظهرت العينة القابلة للذوبان في LMNG ملف تعريف FSEC متفوقا مع شكل ذروة مونومر أفضل وذروة إجمالية أقل للبروتين ، مما يشير إلى أن الذوبان والتنقية في LMNG كانا أكثر الظروف استقرارا لهذا البروتين الغشائي. في المقابل ، كان للعينة القابلة للذوبان في DDM ملف تعريف FSEC أفقر نسبيا ، مع ذروة إجمالية أكبر وقمة أحادية أوسع ، مما يشير إلى تعدد التشتت في العينة.
ثانيا ، تم فحص تأثير إضافة الربيطة على ملف FSEC عن طريق إضافة sphingosine-1-phosphate (S1P) إلى العينة أثناء الذوبان. في هذه الحالة ، تم استخدام DDM ككاشف للذوبان ، وتمت مقارنة آثار FSEC ل S1PR1 في وجود وغياب S1P (الشكل 4B). أظهرت العينة القابلة للذوبان في وجود S1P تتبع FSEC متفوقا مع تجميع منخفض. يشير هذا إلى أن التنقية في وجود ليجند كانت مفيدة لتحسين جودة عينة البروتين عن طريق تثبيت المستقبل في المحلول ولكنها كانت مفيدة أيضا كعلامة بديلة لنشاط البروتين ، حيث أشارت النتائج إلى أن البروتين مطوي بشكل صحيح ومختص بربط الرباط.
الشكل 4: FSEC باستخدام مستخلص خام من S1PR 1 يشير إلى ظروف استخراج الغشاء المثلى وربط الليجند. (أ) مقارنة آثار FSEC ل S1PR1 المذاب في البوليمر المشترك لحمض الستايرين والماليك (SMA؛ أزرق)، لوريل مالتوز نيوبنتيل جلايكول (LMNG؛ أحمر)، أو دوديسيل مالتوسيد (DDM؛ أسود). (B) مقارنة آثار FSEC ل S1PR 1 القابلة للذوبان في DDM في وجود (أحمر) أو غياب (أسود) لناهض سفينغوسين-1-فوسفات (S1P). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم استخدام FSEC أيضا للتحقيق في الاستقرار طويل المدى ل 5HT2AR في ظل ظروف مختلفة. تم إذابة 5HT 2A R البشري الموسوم ب GFP من أغشية خلايا الحشرات إما في المنظفات (DDM) أو بوليمرSMAوتم تحليلها بواسطة FSEC في عدة نقاط زمنية بعد التخزين عند 4 درجات مئوية أو درجة حرارة الغرفة (الشكل 5). بعد عدة أيام من الحضانة ، أظهر 5HT2AR في DDM انخفاضا كبيرا في ارتفاع الذروة الأحادية عند أي من درجتي الحرارة ، ولوحظت زيادات كبيرة في الذروة الكلية. في المقابل ، لم يظهر 5HT 2A R في جسيمات الدهونSMA(SMALP) انخفاضا كبيرا في ارتفاع الذروة الأحادية على مدار التجربة ، مما يشير إلى أن البروتين في SMALP ظل مستقرا لفترة أطول ، حتى في درجات الحرارة غير المواتية. قد يكون هذا مهما عند النظر في الاستعدادات البروتينية للتطبيقات الفيزيائية الحيوية النهائية مثل تجارب رنين البلازمون السطحي (SPR) التي تتطلب أن تكون العينة مستقرة ونشطة على مدى فترة زمنية طويلة لإكمال تجارب الربط بنجاح.
الشكل 5: تأثير الوقت ودرجة الحرارة على جودة 5HT 2A R المستخرجة من الغشاء باستخدام DDM أو SMALP ، كما تم تحليلها بواسطة FSEC. (A) آثار FSEC التمثيلية ل 5HT2AR قابلة للذوبان في DDM وتخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة يوم واحد (رمادي) أو يومين (أخضر) أو 5 أيام (أزرق). (ب) الرسوم البيانية لارتفاع الذروة الأحادي الطبيعي لعينات DDM المخزنة عند 4 درجات مئوية (أزرق) أو RT (أخضر) مقارنة بعينات SMALP المخزنة عند 4 درجات مئوية (رمادي) أو RT (أسود). أشرطة الخطأ تمثل SEM. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
تسمح الأساليب المنهجية العامة لفحص الحالة باستخدام FSEC المعروضة هنا بالتحسين السريع لمعلمات الذوبان والتنقية لإنتاج بروتينات الغشاء. وهذا يعني أنه يمكن إنتاج البروتينات الغشائية المستقرة والنشطة وظيفيا بسرعة للدراسات الفيزيائية الحيوية والهيكلية. علاوة على ذلك ، يمكن تشغيل FSEC باستخدام معدات المختبرات التي من المحتمل أن تكون موجودة بالفعل في مختبرات البروتين الغشائي ، وبالتالي ، لا توجد حاجة لشراء أداة متخصصة لتشغيل المقايسات.
خطوات حاسمة
الوقت المستغرق بين نقطة الذوبان من الخلايا في المنظفات إلى النقطة التي يتم فيها تمرير العينة إلى أسفل عمود SEC (الخطوات 2.1.5-3.2.5) حرج من الوقت ، ويجب ألا يكون هناك توقف مؤقت بين هذه الخطوات. يجب إجراء جميع الخطوات عند 4 درجات مئوية أو على الجليد ، ويجب الحفاظ على الوقت المستغرق لتنفيذ هذه الخطوات عند الحد الأدنى الممكن. هذه القيود الزمنية ودرجة الحرارة ضرورية من أجل تسجيل ملف تعريف FSEC لبروتين الغشاء قبل أي تكشف أو تدهور محتمل. بعد إذابة البروتين الغشائي ، هناك خطر أكبر من التكشف والتجميع والتدهور ، حتى عند 4 درجات مئوية. من الناحية المثالية ، يجب أن تمر أي عينات تتم مقارنة آثار FSEC لها إلى أسفل عمود SEC في نفس المدة الزمنية بعد خطوة الذوبان. من الناحية العملية ، هذا صعب ، خاصة إذا تم تمرير العينات بالتتابع أسفل عمود واحد ، ولكن من الممكن جمع ما يصل إلى خمسة آثار SEC في غضون 3 ساعات من بعضها البعض ، وفي هذا الإطار الزمني ، لا ينبغي أن يكون هناك تدهور كبير.
استكشاف الاخطاء
إذا كانت هناك إشارة فلورسنت منخفضة أو معدومة عند إجراء تجربة FSEC ، فمن المحتمل أن البروتين الغشائي المعني لم يعبر عن خط الخلية المختار ، أو لديه تعبير منخفض جدا عن خط الخلية المختار ، أو لم يتم إذابته في المنظف المختار. إذا تم تخفيف العينات قبل جمع إشارة التألق وتسجيل تتبع FSEC ، فإن الخطوة الأولى البسيطة هي تجربة تخفيف أقل أو عدم تخفيف كسور SEC. إذا كان هذا لا يزال لا ينتج عنه أثر FSEC قابل للتفسير ، فيجب التحقق من تعبير البروتين وذوبانه.
يمكن تحقيق تحليل تعبير البروتين عن طريق التحقق من مضان العينة بعد الخطوة 2.2.2. إذا كانت هناك إشارة فلورسنت منخفضة جدا أو معدومة من هذه العينة (على سبيل المثال ، إشارة قريبة جدا من الخلفية) ، فمن المحتمل أن تكون هناك مشكلة في تعبير البروتين. يمكن اتخاذ خطوات لتحسين مستويات التعبير عن بروتين الغشاء ، مثل التبديل إلى خط خلية بديل أو ضبط ظروف النمو ، وتحريض التعبير ، والوقت بين الحث / العدوى / النقل والحصاد. ومع ذلك ، يمكن أن يشير تعبير البروتين الضعيف بشكل خاص إلى بروتين غشاء غير مستقر ، وبالتالي ، اختيار بناء ضعيف.
إذا تم فحص التعبير وكانت هناك إشارة فلورسنت واضحة فوق الخلفية قبل FSEC ، فيمكن التحقق من كفاءة الذوبان عن طريق قياس إشارة الفلورسنت المتبقية للعينة بعد الخطوة 2.4.3 (بروتين الغشاء القابل للذوبان) مقارنة بالعينة بعد الخطوة 2.2.2 (البروتين الكلي). من الشائع أن تكون كفاءة الذوبان 20٪ -30٪ ولا تزال تسمح بالتحليل الناجح وتنقية بروتين الغشاء. ومع ذلك ، إذا كانت كفاءة الذوبان أقل من 20٪ ، فقد تكون هناك حاجة إلى منظف مختلف للذوبان أو ظروف ذوبان مختلفة. إذا لم تنجح محاولات تحسين الذوبان ، فقد يشير ذلك إلى بروتين غشائي غير مستقر بشكل خاص ، وبالتالي ، اختيار بناء ضعيف.
إذا لوحظت ذروة استخلاص متأخرة جدا في تتبع FSEC (على سبيل المثال ، 18-24 مل) ، فهذا يشير إلى أن البروتين الفلوري له وزن جزيئي للبروتين أقل بكثير من المتوقع. يمكن أن يحدث هذا بسبب تحلل البروتين الغشائي محل الاهتمام ، مما يؤدي إلى GFP "مجاني". يجب على المرء التحقق مما إذا كان البروتين سليما قبل وبعد الذوبان باستخدام مضان GFP في الهلام. إذا بدا أن البروتين محل الاهتمام يتحلل أو يتحلل بالبروتين ، فيمكن زيادة كمية مثبطات الأنزيم البروتيني مرتين إلى أربعة أضعاف. ومع ذلك ، فإن الحساسية العالية للبروتياز أو البروتين المتحلل حتى قبل الذوبان يمكن أن تشير إلى بروتين غير مستقر بشكل خاص ، وبالتالي ، اختيار بناء ضعيف.
التعديلات والتطبيقات الإضافية ل FSEC
عادة ما تكون علامة الفلورسنت المستخدمة في FSEC هي GFP أو eGFP ، كما هو موضح في هذا البروتوكول. ومع ذلك ، تتوفر العديد من علامات البروتين الفلوري المختلفة. يعتمد اختيار علامة الفلورسنت المراد استخدامها على وجود قارئ لوحة يمكنه تحقيق معلمات الإثارة والانبعاث الصحيحة لتسجيل إشارة الفلورسنت لعلامة الفلورسنت المحددة ووجود فلوروفور مع تغيير طفيف أو معدوم في العائد الكمي في الظروف البيئية المختلفة. علاوة على ذلك ، لا يقتصر FSEC على البروتينات الفلورية ولكن يمكنه أيضا العمل بشكل جيد مع البروتين الذي تم تمييزه بصبغة فلورية. على سبيل المثال ، يمكن استخدام صبغة NTA ، والتي من شأنها أن ترتبط بشكل إيجابي بتركيبات البروتين الغشائي الموسومة بالهستيدين. علاوة على ذلك ، إما أن الجسم المضاد المسمى بالفلورسنت المسمى كيميائيا بصبغة فلورية ومحدد لربط بروتين الغشاء محل الاهتمام أو علامة تنقية مضمنة في بنية بروتين الغشاء يمكن أن يصنف بشكل غير مباشر هدفا ل FSEC.
عند إجراء فحص المنظفات باستخدام FSEC ، يمكن اتخاذ قرار بشأن ما إذا كان المخزن المؤقت المستخدم لتشغيل عمود SEC يجب أن يحتوي على المنظف المطابق الذي تم إذابة البروتين فيه أو ما إذا كان يجب استخدام منظف قياسي في جميع عمليات التشغيل. سيتم الحصول على تمثيل أكثر دقة لسلوك البروتين إذا تم إجراء التجربة بأكملها باستخدام المنظف المطابق طوال الوقت. ومع ذلك ، يمكن أن يستغرق الأمر وقتا طويلا ومضيعة للمنظف إذا كان يجب إعادة توازن العمود في منظف جديد قبل تنفيذ كل تشغيل. علاوة على ذلك ، نظرا لأن الغرض الرئيسي من فحص المنظفات هو مقارنة الآثار ، فستظل الاتجاهات في الآثار حتى لو لم تكن الظروف مثالية. وبالتالي ، يمكن التوصل إلى حل وسط حيث يتم إذابة البروتين في المنظف محل الاهتمام ولكن يتم تشغيل العمود في مخزن مؤقت قياسي مع منظف واحد عبر جميع عمليات التشغيل (على سبيل المثال ، DDM) 11 ، مما يوفر الوقت والمواد الاستهلاكية للمنظفات.
من خلال تعديل معدات FLPC المستخدمة ، يمكن زيادة إنتاجية بروتوكول FSEC بشكل كبير ، ويمكن تقليل متطلبات العينة. على سبيل المثال ، يمكن تجهيز نظام FPLC أو HPLC بجهاز أخذ عينات تلقائي ، وعمود تحليلي أصغر حجما (مثل عمود SEC تحليلي 3.2 مل) ، وكاشف فلورسنت مضمن لمراقبة آثار FSEC المستمرة مباشرة من العمود. سيسمح الإعداد الناتج بإجراء المزيد من عمليات تشغيل FSEC في فترة زمنية أقصر وإزالة خطوة التخطيط اليدوي ، مما يسمح باختبار عدد أكبر من الشروط في إطار زمني أقصر. علاوة على ذلك ، سيتم تخفيض متطلبات العينة بشكل أكبر ، حيث سيتعين إعداد عدد أقل من العينات وتحميلها على عمود FSEC لكل تشغيل. وهذا من شأنه أن يفتح إمكانيات لاختزال ثقافات التعبير إلى شكل قائم على اللوحة، حيث ستكون هناك حاجة إلى القليل من المواد للتحليل.
نقاط القوة والضعف في FSEC مقارنة بالطرق الأخرى
عيب FSEC هو أن تركيبات البروتين الغشائي تحتاج إلى تصميم لإدخال ملصق الفلورسنت ، وعند المقدمة ، هناك احتمال ضئيل أن يتداخل وضع الملصق مع وظيفة أو طي بروتين الغشاء محل الاهتمام. بالإضافة إلى ذلك ، يراقب بروتوكول FSEC ، كما هو موضح هنا ، خصائص بروتين الغشاء في وجود تحلل الخلية ، وهو خليط خام من البروتينات. قد يختلف سلوك البروتين الغشائي في هذه البيئة عما هو عليه عندما يخضع البروتين الغشائي محل الاهتمام لعمود SEC تحضيري في نهاية التنقية عند عزله تماما عن البروتينات الأخرى. علاوة على ذلك ، يوفر FSEC مقياسا نوعيا إلى حد ما لجودة البروتين. ومع ذلك ، من خلال تحويل تتبع FSEC إلى مؤشر أحادي التشتت ، كما هو موضح في الخطوة 4.3.3 من البروتوكول ، يمكن الحصول على مقياس كمي لجودة البروتين.
FSEC ليست الطريقة الوحيدة التي يمكن استخدامها في التحليل المبكر لتركيبات البروتين الغشائي ، وظروف الذوبان ، وتكوين المخزن المؤقت للتنقية. النهج البديلة لها مزايا وعيوب على حد سواء على FSSEC. على سبيل المثال ، توجد مقايسات الثبات الحراري القائمة على الفلوروفور ، لا سيما استخدام الصبغة 7-diethylamino-3- (4′-maleimidylphenyl) -4-methylcoumarin (CPM) 16,17. ميزة هذه الطريقة هي أنه ، على عكس FSEC ، الذي يوفر مقياسا نوعيا لجودة البروتين ، توفر مقايسات الثبات الحراري مقياسا كميا في شكل درجة حرارة انصهار نسبية. علاوة على ذلك ، لا يوجد شرط لإدخال علامة الفلورسنت على بنية البروتين. ومع ذلك ، فإن عيوب مقايسات الثبات الحراري مقارنة ب FSEC هي أنه يجب استخدام البروتين المنقى وأن الفحص غير متوافق مع جميع تركيبات البروتين ، لأنه يعتمد على المواضع المفيدة لبقايا السيستين الأصلية في البروتين المطوي.
هناك طريقة أخرى لها أوجه تشابه مع كل من FSEC ومقايسات الثبات الحراري القائمة على الفلوروفور وهي الفحص الذي يقيس حساسية درجة حرارة بروتين الغشاء. في هذا الفحص ، يتم تحدي البروتين بدرجات حرارة مختلفة ، ويتم اكتشاف البروتين الذي يبقى في المحلول بعد الطرد المركزي. تم إجراء الكشف في هذه الطريقة بعدة طرق ، بما في ذلك قياس التألق في المحلول18 ، أو مضان شريط هلام SDS-PAGE19 ، أو شدة الإشارة في اللطخة الغربية20. ومع ذلك ، فإن العيب الكبير لهذه الأساليب هو أن الفحص كثيف العمالة وعرضة للضوضاء العالية في النتائج ، حيث يجب جمع كل نقطة درجة حرارة فردية بشكل مستقل.
أخيرا ، يمكن استخدام العديد من التقنيات الفيزيائية الحيوية الأكثر تقدما لتقييم جودة البروتين الغشائي بطريقة مماثلة ل FSEC ، على سبيل المثال ، تحليل التشتت الناجم عن التدفق21 ، أو الرحلان الحراري المجهري22 ، أو SPR. وعلى الرغم من أن هذه الأساليب قوية جدا، فإن مساوئها هي الحاجة إلى أدوات عالية التخصص لإجراء التحليلات.
في الختام ، يوفر FSEC أداة لا تقدر بثمن للاستخدام في حملات إنتاج البروتين الغشائي ، وعلى الرغم من أنه ليس الخيار الوحيد ، إلا أنه يتمتع بالعديد من المزايا المميزة مقارنة بالطرق الأخرى ، كما هو مذكور أعلاه. يوصى دائما بالتحقق من صحة النتائج عن طريق المقايسات المتعامدة ، ولا تستبعد أي من الطرق التي تمت مناقشتها أعلاه بعضها البعض.
Disclosures
Peak Proteins هي منظمة بحثية تعاقدية توفر تعبير البروتين وتنقيته وقياس الطيف الكتلي والتحديد الهيكلي مقابل رسوم.
Acknowledgments
نود أن نعترف بمساعدة ودعم فريق Peak Proteins بأكمله. من فريق علوم الخلية ، نود أن نعترف بإيان هامبتون لرؤيته وتوجيهاته القيمة في التعبير عن خلايا الحشرات. نود أن نشكر مارك أبوت على توفير الموارد والفرصة لمتابعة هذا المشروع.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL and 5 mL plastic syringes | Generic | - | Syringes for transfer of samples |
| 10x EDTA Free Protease inhibitor cocktail | Abcam | ab201111 | Protease inhibitors |
| 15 mL tubes | Generic | - | 15 mL tubes for pellet preparation and solubilisation |
| 2 mL ultra-centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344625 | Tubes for ultra-centrifuge rotor |
| 50 mL tubes | Generic | - | 50 mL tubes for cell harvest |
| 96 deep-well blocks | Greiner | 15922302 | For collecting 0.2 mL SEC fractions |
| ÄKTA V9-L loop valve | Cytiva | 29011358 | 5 posiiton loop valve for the ÄKTA FPLC system |
| ÄKTA F9-C fraction collector | Cytiva | 29027743 | 6 position plate fraction collector for the ÄKTA FPLC system |
| ÄKTA pure 25 L | Cytiva | 29018224 | FPLC system for running the experiment |
| Benchtop centrifuge (e.g. Fisherbrand GT4 3L) | Fisher Scientific | 15828722 | Centrifuge for low-speed spin |
| Blunt end filling needles | Generic | - | For transfer of samples |
| Bottle top vacuum filter | Corning | 10005490 | Bottle top vacuum filter for filtering SEC buffers |
| Cholesteryl hemisuccinate (CHS) | Generon | CH210-5GM | Additive for detergent solubilisation |
| Disposable multichannel reseviour | Generic | - | Resevior for addition of water or buffer to 96-well micro-plate |
| Dodecyl maltoside (DDM) | Glycon | D97002-C-25g | Detergent for solubilisation |
| eGFP protein standards | BioVision | K815-100 | eGFP standards for fluorescent calibration curve |
| Glycerol | Thermo Scientific | 11443297 | Glycerol for buffer preparation |
| HEPES | Thermo Scientific | 10411451 | HEPES for buffer preparation |
| High molecular weight SEC calibration standards kit | Cytiva | 28403842 | Molecular weight calibration kit for SEC |
| Lauryl maltose neopentylglycol (LMNG) | Generon | NB-19-0055-5G | Detergent for solubilisation |
| Low molecular weight SEC calibration standards kit | Cytiva | 28403841 | Molecular weight calibration kit for SEC |
| MLA-130 ultra-centrifuge rotor | Beckman Coulter | 367114 | Rotor for ultracentrifuge that fits 2 mL capacity tubes |
| Opaque 96-well flat-bottom micro-plate | Corning | 10656853 | 96-well for reading fluorescent signal in plate reader |
| Optima MAX-XP ultra-centrifuge | Beckman Coulter | 393315 | Centrifuge for high-speed spin |
| pH meter | Generic | - | For adjusting the pH of buffers during preparation |
| Prism | GraphPad | - | Graphing software for plotting traces |
| Rotary mixer | Fisher Scientific | 12027144 | Mixer for end over end mixing in the cold |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 10316943 | Sodium chloride for buffer preparation |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 10488790 | Sodium hydroxide for buffer preparation |
| Spectramax ID3 Plate Reader | Molecular Devices | 735-0391 | Micro-plate reader capable of reading fluorescence |
| Stirrer plate | Generic | - | For stirring buffers during preparation |
| Styrene maleic acid (SMA) | Orbiscope | SMALP 300 | Polymer for detergent free extraction |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | Cytiva | 28990944 | SEC column for running the experiment. The bed volume of this column is 24 mL. The recommended flow rate for this column in 0.9 ml/min (in water at 4 °C). The maximum pressure limit for this column is 5 MPa. |
| Vacuum pump | Sartorius | 16694-2-50-06 | For filtering and degassing buffers |
References
- Burgess, R. R. A brief practical review of size exclusion chromatography: Rules of thumb, limitations, and troubleshooting. Protein Expression and Purification. 150, 81-85 (2018).
- Erickson, H. P. Size and shape of protein molecules at the nanometer level determined by sedimentation, gel filtration, and electron microscopy. Biological Procedures Online. 11 (1), 32-51 (2009).
- Lathe, G. H., Ruthven, C. R. J. The separation of substances and estimation of their relative molecular sizes by the use of columns of starch in water. Biochemical Journal. 62 (4), 665-674 (1956).
- Lathe, G. H., Ruthven, C. R. The separation of substances on the basis of their molecular weights, using columns of starch and water. Biochemical Journal. 60 (4), (1955).
- Polson, A. Fractionation of protein mixtures on columns of granulated agar. Biochimica et Biophysica Acta. 50 (3), 565-567 (1961).
- Hjertén, S., Mosbach, R. 34;Molecular-sieve" chromatography of proteins on columns of cross-linked polyacrylamide. Analytical Biochemistry. 3 (2), 109-118 (1962).
- Porath, J., Flodin, P. Gel filtration: A method for desalting and group separation. Nature. 183 (4676), 1657-1659 (1959).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
- Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A Fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. Journal of Cellular and Comparative Physiology. 59 (3), 223-239 (1962).
- Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).
- Newstead, S., Kim, H., von Heijne, G., Iwata, S., Drew, D. High-throughput fluorescent-based optimization of eukaryotic membrane protein overexpression and purification in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 13936-13941 (2007).
- Vaidehi, N., Grisshammer, R., Tate, C. G. How can mutations thermostabilize G-protein-coupled receptors. Trends in Pharmacological Sciences. 37 (1), 37-46 (2016).
- Hardy, D., Bill, R. M., Jawhari, A., Rothnie, A. J. Overcoming bottlenecks in the membrane protein structural biology pipeline. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 838-844 (2016).
- Hanson, M. A., et al. Crystal structure of a lipid G protein-coupled receptor. Science. 335 (6070), 851-855 (2012).
- Alexandrov, A. I., Mileni, M., Chien, E. Y. T., Hanson, M. A., Stevens, R. C. Microscale fluorescent thermal stability assay for membrane proteins. Structure. 16 (3), 351-359 (2008).
- Harborne, S. P. D., King, M. S., Kunji, E. R. S. Thermostability assays: A generic and versatile tool for studying the functional and structural properties of membrane proteins in detergents. Biophysical Journal. 118 (4), 105-121 (2020).
- Nji, E., Chatzikyriakidou, Y., Landreh, M., Drew, D. An engineered thermal-shift screen reveals specific lipid preferences of eukaryotic and prokaryotic membrane proteins. Nature Communications. 9 (1), 4253 (2018).
- Harborne, S. P. D., et al. IMPROvER: The Integral Membrane Protein Stability Selector. Scientific Reports. 10 (1), 15165 (2020).
- Ashok, Y., Nanekar, R., Jaakola, V. -P. Defining thermostability of membrane proteins by western blotting. Protein Engineering Design and Selection. 28 (12), 539-542 (2015).
- Pedersen, M. E., Østergaard, J., Jensen, H. Flow-induced dispersion analysis (FIDA) for protein quantification and characterization. Methods Mol Biol. 1972, 109-123 (2019).
- Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nature Communications. 1 (1), 100 (2010).
