Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion

تصوير فائق الدقة للبروتينات المفرزة البكتيرية باستخدام توسيع الشفرة الوراثية

Published: February 10, 2023

doi:

Moirangthem Kiran Singh, Linda J. Kenney

¹Biochemistry & Molecular Biology,University of Texas Medical Branch

Summary

توفر هذه المقالة بروتوكولا مباشرا وواضحا لتسمية المستجيبات المفرزة للسالمونيلا باستخدام موقع توسيع الشفرة الوراثية (GCE) على وجه التحديد وتصوير التوطين تحت الخلوي للبروتينات المفرزة في خلايا هيلا باستخدام مجهر إعادة البناء البصري العشوائي المباشر (dSTORM)

Abstract

تمكن أنظمة الإفراز من النوع الثالث (T3SSs) البكتيريا سالبة الجرام من حقن بطارية من البروتينات المستجيبة مباشرة في السيتوسول للخلايا المضيفة حقيقية النواة. عند الدخول ، تقوم البروتينات المستجيبة المحقونة بتعديل مسارات الإشارات حقيقية النواة بشكل تعاوني وإعادة برمجة الوظائف الخلوية ، مما يتيح دخول البكتيريا وبقائها. توفر مراقبة وتوطين هذه البروتينات المستجيبة المفرزة في سياق العدوى بصمة لتحديد الواجهة الديناميكية للتفاعلات بين المضيف والممرض. ومع ذلك ، فإن وضع العلامات وتصوير البروتينات البكتيرية في الخلايا المضيفة دون تعطيل هيكلها / وظيفتها يمثل تحديا تقنيا.

إن بناء بروتينات الاندماج الفلورية لا يحل هذه المشكلة ، لأن بروتينات الاندماج تحشر الجهاز الإفرازي وبالتالي لا يتم إفرازها. للتغلب على هذه العقبات ، استخدمنا مؤخرا طريقة لوضع العلامات الفلورية الخاصة بالموقع على المستجيبات المفرزة البكتيرية ، بالإضافة إلى البروتينات الأخرى التي يصعب تصنيفها ، باستخدام توسيع الشفرة الوراثية (GCE). يوفر هذا البحث بروتوكولا كاملا خطوة بخطوة لتسمية المستجيبات المفرزة للسالمونيلا باستخدام موقع GCE على وجه التحديد ، متبوعا بتوجيهات لتصوير التوطين تحت الخلوي للبروتينات المفرزة في خلايا HeLa باستخدام مجهر إعادة البناء البصري العشوائي المباشر (dSTORM)

تشير النتائج الحديثة إلى أن دمج الأحماض الأمينية غير المتعارف عليها (ncAAs) عبر GCE ، متبوعا بوضع العلامات المتعامدة الحيوية مع الأصباغ المحتوية على التترازين ، هو تقنية قابلة للتطبيق لوضع العلامات الانتقائية وتصور البروتينات المفرزة البكتيرية وتحليل الصور اللاحقة في المضيف. الهدف من هذه المقالة هو توفير بروتوكول مباشر وواضح يمكن استخدامه من قبل الباحثين المهتمين بإجراء تصوير فائق الدقة باستخدام GCE لدراسة العمليات البيولوجية المختلفة في البكتيريا والفيروسات ، وكذلك التفاعلات بين المضيف والممرض.

Introduction

منذ فترة طويلة تعتبر الالتهابات البكتيرية خطرا خطيرا على صحة الإنسان. تستخدم مسببات الأمراض أنظمة دفاعية متطورة للغاية وقوية للغاية ومعقدة ، بالإضافة إلى مجموعة متنوعة من عوامل الفوعة البكتيرية (يشار إليها باسم البروتينات المستجيبة) للتهرب من الاستجابات المناعية للمضيف وإنشاء العدوى ^1,2. ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه الأنظمة ودور البروتينات المستجيبة الفردية لا تزال غير معروفة إلى حد كبير بسبب ندرة الأساليب المناسبة للمتابعة المباشرة لمكونات البروتين الحاسمة والمستجيبات في الخلايا المضيفة أثناء التسبب في المرض.

أحد الأمثلة النموذجية هو السالمونيلا المعوية المصلية التيفية ، والتي تسبب التهاب المعدة والأمعاء الحاد. السالمونيلا يستخدم التيفيموريوم أنظمة إفراز من النوع الثالث (T3SS) لحقن مجموعة متنوعة من البروتينات المستجيبة مباشرة في الخلايا المضيفة. بمجرد دخول السالمونيلا إلى الخلية المضيفة ، فإنها تتواجد في حجرة حمضية مرتبطة بالغشاء ، تسمى الفجوة المحتوية على السالمونيلا (SCV) ^3,4. ينشط الرقم الهيدروجيني الحمضي ل SCV جزيرة السالمونيلا المسببة للأمراض 2 (SPI-2) المشفرة T3SS وينقل وابل من 20 أو أكثر من البروتينات المستجيبة عبر الغشاء الفراغي إلى السيتوسول المضيف⁵،⁶،⁷^،⁸. داخل المضيف ، تتلاعب هذه الكوكتيلات المعقدة من البروتينات المستجيبة بشكل منسق بمسارات إشارات الخلية المضيفة ، مما يؤدي إلى تكوين هياكل غشاء أنبوبي ديناميكية ومعقدة للغاية تمتد من SCV على طول الأنابيب الدقيقة ، والتي تسمى خيوط السالمونيلا التي يسببها (SIFs) ، والتي تمكن السالمونيلا من البقاء على قيد الحياة والتكاثر داخل الخلايا المضيفة⁹،¹⁰^،¹¹.

توفر طرق تصور وتتبع ومراقبة توطين المستجيبات البكتيرية ، وفحص الاتجار بها وتفاعلاتها داخل الخلايا المضيفة ، نظرة ثاقبة مهمة للآليات التي تقوم عليها الإمراضات البكتيرية. ثبت أن وضع العلامات وتوطين بروتينات المستجيب T3SS المفرزة في السالمونيلا داخل الخلايا المضيفة يمثل تحديا تقنيا^12,13 ؛ ومع ذلك ، فإن تطوير البروتينات الفلورية المشفرة وراثيا قد حول قدرتنا على دراسة وتصور البروتينات داخل الأنظمة الحية. ومع ذلك ، فإن حجم البروتينات الفلورية (~ 25-30 كيلو دالتون)15 غالبا ما يكون مشابها أو أكبر من حجم البروتين محل الاهتمام (POI ؛ على سبيل المثال ، ^13.65 كيلو دالتون ل SsaP ، 37.4 كيلو دالتون ل SifA). في الواقع ، غالبا ما يمنع وضع العلامات على البروتين الفلوري للمستجيبات إفراز المستجيب المسمى ويحشر T3SS¹⁴.

علاوة على ذلك ، فإن البروتينات الفلورية أقل استقرارا وتنبعث منها عدد قليل من الفوتونات قبل التبييض الضوئي ، مما يحد من استخدامها في التقنيات المجهرية فائقة الدقة¹⁶،¹⁷،¹⁸ ، لا سيما في الفحص المجهري لتوطين التنشيط الضوئي (PALM) ، STORM ^، والمجهر المستنفد للانبعاثات المحفزة (STED). في حين أن الخصائص الفيزيائية الضوئية للأصباغ الفلورية العضوية تتفوق على تلك الخاصة بالبروتينات الفلورية ، فإن الطرق / التقنيات مثل CLIP / SNAP^19,20 و Split-GFP 21 و ReAsH / FlAsH 22,23 و HA-Tags ^24,25 تتطلب بروتينا إضافيا أو ملحقا ببتيديا قد يضعف وظيفة بنية البروتين المستجيب محل الاهتمام من خلال التدخل في التعديل أو الاتجار بعد الترجمة. تتضمن الطريقة البديلة التي تقلل من تعديل البروتين الضروري دمج NCAAs في POI أثناء الترجمة من خلال GCE. NCAAs إما فلورية أو يمكن صنعها فلورية عن طريق النقر على الكيمياء^12،13،²⁶،²⁷^،²⁸.

باستخدام GCE ، يمكن إدخال NCAAs مع مجموعات صغيرة ووظيفية ومتعامدة حيويا (مثل مجموعة أزيد أو سيكلوبيروبين أو سيكلوكتين) في أي مكان تقريبا في البروتين المستهدف. في هذه الاستراتيجية، يتم تبديل كودون أصلي بكودون نادر مثل كودون توقف الكهرمان (TAG) في موضع محدد في جين POI. يتم التعبير عن البروتين المعدل لاحقا في الخلايا جنبا إلى جنب مع زوج متعامد من الأمينواسيل-الحمض النووي الريبي / الحمض النووي الريبي المتعامد. تم تصميم الموقع النشط لتخليق tRNA لاستقبال ncAA واحد معين فقط ، والذي يتم ربطه تساهميا بعد ذلك بنهاية 3′-end من tRNA الذي يتعرف على كودون العنبر. يتم إدخال ncAA ببساطة في وسط النمو ، ولكن يجب أن تمتصه الخلية وتصل إلى السيتوسول حيث يمكن ل aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) ربطه بالحمض النووي الريبي المتعامد. ثم يتم دمجها في نقطة الاهتمام في الموقع المحدد (انظر الشكل 1)¹². وبالتالي ، تتيح GCE دمج عدد كبير من المجموعات التفاعلية المتعامدة الحيوية مثل الكيتون ، والأزيد ، والألكاين ، والسيكلوكتين ، والترانسسيكلوكتين ، والتترازين ، والنوربونين ، و α ، والأميد غير المشبع β ، و bicyclo [6.1.0] -nonyne في نقطة الاهتمام ، مما قد يتغلب على قيود طرق وضع العلامات على البروتين التقليدية¹²،²⁶،²⁷^،²⁸.

فتحت الاتجاهات الناشئة الحديثة في تقنيات التصوير فائقة الدقة آفاقا جديدة للتحقيق في الهياكل البيولوجية على المستوى الجزيئي. على وجه الخصوص ، أصبحت STORM ، وهي تقنية أحادية الجزيء ، قائمة على التوطين ، فائقة الدقة ، أداة لا تقدر بثمن لتصور الهياكل الخلوية حتى ~ 20-30 نانومتر وهي قادرة على التحقيق في العمليات البيولوجية جزيء واحد في كل مرة ، وبالتالي اكتشاف أدوار الجزيئات داخل الخلايا التي لم تكن معروفة بعد في الدراسات التقليدية ذات المتوسط^{الجماعي 13} . تتطلب تقنيات الجزيء الواحد والدقة الفائقة علامة صغيرة مع فلوروفورات عضوية ساطعة وقابلة للضوء للحصول على أفضل دقة. لقد أثبتنا مؤخرا أنه يمكن استخدام GCE لدمج مجسات مناسبة للتصوير فائق الدقة¹².

اثنان من أفضل الخيارات لوضع العلامات على البروتين في الخلايا هما bicyclo [6.1.0] nonynelysine (BCN) و trans-cyclooctene-lysine (TCO ؛ كما هو موضح في الشكل 1) ، والتي يمكن ترميزها وراثيا باستخدام متغير من زوج tRNA / synthetase (يسمى هنا tRNA Pyl / PylRS^AF) ، حيث يمثل^Pyl pyrrolysine ، ويمثل AF متحولا مزدوجا مصمما بشكل عقلاني (Y306A ، Y384F) مشتقا من Methanosarcina mazei الذي يشفر بشكل طبيعي pyrrolysine¹² ^، 29,30,31. من خلال تفاعل Diels-Alder cycloaddition (SPIEDAC) العكسي المعزز بالإجهاد ، تتفاعل هذه الأحماض الأمينية بشكل انتقائي كيميائيا مع اتحادات التترازين (الشكل 1)¹²،³⁰^،³¹. تفاعلات الإضافة الحلقية هذه سريعة بشكل استثنائي ومتوافقة مع الخلايا الحية. قد تكون أيضا فلورية ، إذا تم تشغيل الفلوروفور المناسب مع مجموعة Tetrazine¹²،²⁶^،³². تقدم هذه الورقة بروتوكولا محسنا لمراقبة ديناميكيات المستجيبات البكتيرية التي يتم توصيلها إلى الخلايا المضيفة باستخدام GCE ، يليها توطين تحت الخلية للبروتينات المفرزة في خلايا HeLa باستخدام dSTORM. تشير النتائج إلى أن دمج NCAA عبر GCE ، متبوعا بتفاعل نقر مع الأصباغ الحاملة للتترازين الفلورية ، يمثل طريقة متعددة الاستخدامات لوضع العلامات الانتقائية ، وتصور البروتينات المفرزة ، والتوطين دون الخلوي اللاحق في المضيف. ومع ذلك ، يمكن تعديل جميع المكونات والإجراءات المفصلة هنا أو استبدالها بحيث يمكن تكييف نظام الحملة العالمية للتعليم للتحقيق في الأسئلة البيولوجية الأخرى.

Protocol

1. بناء البلازميد استنساخ الجين الذي يعبر عن POI إلى تعبير بلازميد (على سبيل المثال ، pET28a-sseJ 10TAG) الذي يعبر عن POI في E. coli BL21 (DE3). تسهل هذه الخطوة تحديد أن المسوخ وظيفية. لتصور المستجيبات المفرزة السالمونيلا في الخلايا المضيفة ، قم ببناء تعبير بلازميد (pWSK29-sseJ-HA) ي…

Representative Results

تصف ورقة البروتوكول هذه طريقة قائمة على GCE لوضع العلامات الفلورية الخاصة بالموقع وتصور مستجيبات السالمونيلا المفرزة ، كما هو موضح في الشكل 1. يظهر التركيب الكيميائي للمجموعة المتعامدة الحيوية عبر السيكلوكتين (TCO) الحاملة ncAA وصبغة الفلورسنت في <strong clas…

Discussion

تم استخدام النهج الموصوف هنا لتتبع الموقع الدقيق للبروتينات المستجيبة التي يتم حقنها في الخلية المضيفة بواسطة T3SS البكتيرية بعد الإصابة. يتم استخدام T3SSs بواسطة مسببات الأمراض داخل الخلايا مثل السالمونيلا والشيغيلة واليرسينيا لنقل مكونات الفوعة إلى المضيف. أتاح تطوير تقنيا…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال أموال بدء التشغيل من الفرع الطبي بجامعة تكساس ، جالفستون ، تكساس ، وجائزة Texas STAR إلى LJ K. نشكر البروفيسور إدوارد ليمكي (مختبر البيولوجيا الجزيئية الأوروبي ، هايدلبرغ ، ألمانيا) على البلازميد pEVOL-PylRS-AF. تم إنشاء الصور في الشكل 1 باستخدام BioRender.

Materials

10x Tris/Glycine SDS running buffer	BIO-RAD	1610732
Ammonium chloride	Fischer Scientific	A661-500
Ammonium sulphate	Fischer Scientific	BP212R-1
Ampicillin Sodium	Sigma-Aldrich	A0166	5 g
Antibiotic-Antimycotic (100x)	ThermiFischer Scientific	15240096
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256	500 g
Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge)	Beckman Coulter
Bacto-Agar	BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA	214010
BDP-FL-tetrazine	Lumiprobe (USA)	2.14E+02
β-mercaptoethanol	Millipore	444203	250 mL
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B8026
BSA	Sigma-Aldrich	A4503	500 g
Casein	Sigma-Aldrich	C8654
Catalase	Sigma-Aldrich	C9322
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C1919
Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en – L – Lysine (TCO*A)	SiChem GmbH	SC-8008	Size: 500 mg
DAPI (Hoechst33342)	Invitrogen	H3570
DeNovix DS-11+ Spectrophotometer	DeNovix
DMEM*	Corning	10-013-CV	* Used for maintaining HeLa Cell
DMEM**	Gibco	11965-092	**Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4.
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	250 g
Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody	Invitrogen	A-31572
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV
E. coli strain BL21 (DE3)	Novagen (Madison, WI)
EMCCD Camera	Andor	iXon Ultra 897-BV
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean)	Eppendorf, Hamburg, Germany	30123.328
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fischer	10082147
Fisherbrand Syringe Filters – Sterile (PVDF 0.22 µm)	Fischer Scientific	97203	Pack of 100
Gene Pulser Xcell Electroporator	BIO-RAD	1652660
Gentamycin	Sigma-Aldrich	G1272	10 mL
Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x	Fischer Scientific	25-030-081
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G7141-50KU
Glycerol	Fischer Scientific	BF229-4
HeLa cells	ATTC	CCL-2
HEPES Buffer	Corning	25-060-C1	100 mL
Hydrocloric acid	Fischer Scientific	A144-212
ImageJ			Image processing and analysis: http://rsbweb.nih.gov/ij
IntantBlue	Expedeon	ISB1L	Coomassie-based stain
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	I5502
Janelia Fluoro 646-tetrazine	Tocris Bioscience	7279
Kanamycin	Sigma-Aldrich	60615	5 g
LB Broth	BD Difco	244620	500 g
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876
μManager (v. 1.4.2)			https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release
MES	Sigma-Aldrich	M3671	250 g
Micro pulser cuvette	BIO-RAD	165-2086	0.2 cm electrode gap, pkg. of 50
Nikon N-STORM	Nikon Instruments Inc.		https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution
Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks	ThermiFischer Scientific	156499
Omnipur Casamino Acid	Calbiochem	2240	500 g
Paraformaldehhyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences	15710
PBS (10x)	Roche	11666789001
Penicillin-Streptomycin Solution (100x)	GenDEPOT	CA005-010	100 mL
pEVOL-PylRS-AF			For plasmid construction and map see following references 1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.
Plasmid Mini-prep Kit	Qiagen	27106
plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA			Ref.: elife. 2021, 10, e67789.
plasmid pWSK29-sseJ-HA			Ref.: elife. 2021, 10, e67789. Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/
Pluronic F-127	Millipore	540025	Protein grade, 10% Solution
Potassium phosphate monobasic	Fischer Scientific	P285-500
Potassium sulphate	Acros Organic	424220250
Protease Inhibitor Cocktail Set I – Calbiochem	Sigma-Aldrich	539131	100x Solution
Rabbit anti-HA primary antibody	Sigma-Aldrich	H6908
S. enterica. serovar Typhimurium 14028s			Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.
Saponin	Sigma-Aldrich	47036-50G-F
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771
Sodium hydroxide	Fischer Scientific	SS255-1
Sodium Pyruvate (100 mM), 100x	Corning	25-060-C1	100 mL
Sonic Dismembrator Model 100	Fischer Scientific	24932
STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system)	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany		https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/
ThunderSTORM			https://zitmen.github.io/thunderstorm/
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503
Trypsin-EDTA (1x), 0.25%	GenDEPOT	CA014-010
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416	100 mL
X-well tissue culture chamber slides	SARSTEDT	94.6190.802

Referências

Marlovits, T. C., et al. Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex. Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).
Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science. 280 (5363), 602-605 (1998).
LaRock, D. L., Chaudhary, A., Miller, S. I. Salmonellae interactions with host processes. Nature Reviews Microbiology. 13 (4), 191-205 (2015).
Galan, J. E., Waksman, G. Protein-injection machines in bacteria. Cell. 172 (6), 1306-1318 (2018).
Feng, X., Oropeza, R., Kenney, L. J. Dual regulation by phospho-OmpR of ssrA/B gene expression in Salmonella pathogenicity island 2. Molecular Microbiology. 48 (4), 1131-1143 (2003).
Walthers, D., et al. Salmonella enterica response regulator SsrB relieves H-NS silencing by displacing H-NS bound in polymerization mode and directly activates transcription. Journal of Biological Chemistry. 286 (3), 1895-1902 (2011).
Chakraborty, S., Mizusaki, H., Kenney, L. J. A FRET-based DNA biosensor tracks OmpR-dependent acidification of Salmonella during macrophage infection. PLoS Biology. 13 (4), e1002116 (2015).
Liew, A. T. F., et al. Single cell, super-resolution imaging reveals an acid pH-dependent conformational switch in SsrB regulates SPI-2. eLife. 8, e45311 (2019).
Knuff, K., Finlay, B. B. What the SIF is happening-the role of intracellular Salmonella-induced filaments. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 335 (2017).
Drecktrah, D., et al. Dynamic behavior of Salmonella-induced membrane tubules in epithelial cells. Traffic. 9 (12), 2117-2129 (2008).
Garcia del-Portillo, F., Zwick, M. B., Leung, K. Y., Finlay, B. B. Salmonella induces the formation of filamentous structures containing lysosomal membrane glycoproteins in epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10544-10548 (1993).
Singh, M. K., Zangoui, P., Yamanaka, Y., Kenney, L. J. Genetic code expansion enables visualization of Salmonella type three secretion system components and secreted effectors. elife. 10, e67789 (2021).
Singh, M. K., Kenney, L. J. Super-resolution imaging of bacterial pathogens and visualization of their secreted effectors. FEMS Microbiology Reviews. 45 (2), fuaa050 (2020).
Akeda, Y., Galan, J. E. Chaperone release and unfolding of substrates in type III secretion. Nature. 437 (7060), 911-915 (2005).
Su, W. W. Fluorescent proteins as tools to aid protein production. Microbial Cell Factories. 4 (1), 12 (2005).
Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8452-8457 (2014).
Ghodke, H., Caldas, V. E. A., Punter, C. M., van Oijen, A. M., Robinson, A. Single-molecule specific mislocalization of red fluorescent proteins in live Escherichia coli. Biophysical Journal. 111 (1), 25-27 (2016).
Gahlmann, A., Moerner, W. E. Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging. Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).
Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemical Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
Young, A. M., Minson, M., McQuate, S. E., Palmer, A. E. Optimized fluorescence complementation platform for visualizing Salmonella effector proteins reveals distinctly different intracellular niches in different cell types. ACS Infectious Diseases. 3 (8), 575-584 (2017).
Martin, B. R., Giepmans, B. N., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Mammalian cell-based optimization of the biarsenical-binding tetracysteine motif for improved fluorescence and affinity. Nature Biotechnology. 23 (10), 1308-1314 (2005).
Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).
Gao, Y., Spahn, C., Heilemann, M., Kenney, L. J. The pearling transition provides evidence of force-driven endosomal tubulation during Salmonella infection. mBio. 9 (3), e01083-e01018 (2018).
Brumell, J. H., Goosney, D. L., Finlay, B. B. SifA, a type III secreted effector of Salmonella typhimurium, directs Salmonella-induced filament (Sif) formation along microtubules. Traffic. 3 (6), 407-415 (2002).
Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
Davis, L., Chin, J. W. Designer proteins: applications of genetic code expansion in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 168-182 (2012).
Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
Kipper, K., et al. Application of noncanonical amino acids for protein labeling in a genomically recoded Escherichia coli. ACS Synthetic Biology. 6 (2), 233-255 (2017).
Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. Journal of American Chemical Society. 137 (14), 4602-4605 (2015).
Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angewandte Chemie International Edition. 51 (17), 4166-4170 (2012).
Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. Journal of the American Chemical Society. 134 (25), 10317-10320 (2012).
Xu, H., et al. Re-exploration of the codon context effect on amber codon-guided incorporation of noncanonical amino acids in Escherichia coli by the blue-white screening assay. ChemBioChem. 17 (13), 1250-1256 (2016).
Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Research. 28 (1), 292 (2000).
Spahn, C., et al. Sequential super-resolution imaging of bacterial regulatory proteins: the nucleoid and the cell membrane in single, fixed E. coli cells. Methods in Molecular Biology. 1624, 269-289 (2017).
Grimm, J., English, B., Chen, J., et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).
Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81 (1), 12-46 (2017).
Meineke, B., Heimgärtner, J., Eirich, J., Landreh, M., Elsässer, S. J. Site-specific incorporation of two ncAAs for two-color bioorthogonal labeling and crosslinking of proteins on live mammalian cells. Cell Reports. 31 (12), 107811 (2020).
Bessa-Neto, D., et al. Bioorthogonal labeling of transmembrane proteins with non-canonical amino acids unveils masked epitopes in live neurons. Nature Communications. 12 (1), 6715 (2021).
Beliu, G., et al. Bioorthogonal labeling with tetrazine-dyes for super-resolution microscopy. Communication Biology. 2, 261 (2019).
Arsić, A., Hagemann, C., Stajković, N., Schubert, T., Nikić-Spiegel, I. Minimal genetically encoded tags for fluorescent protein labeling in living neurons. Nature Communications. 13 (1), 314 (2022).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artigo

Singh, M. K., Kenney, L. J. Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion. J. Vis. Exp. (192), e64382, doi:10.3791/64382 (2023).