Визуализация белков, секретируемых бактериями, со сверхвысоким разрешением с использованием расширения генетического кода
Summary
В этой статье представлен простой и понятный протокол для маркировки эффекторов, секретируемых сальмонеллой , с использованием расширения генетического кода (GCE) и визуализации субклеточной локализации секретируемых белков в клетках HeLa с использованием прямой стохастической оптической реконструкционной микроскопии (dSTORM)
Abstract
Системы секреции третьего типа (T3SS) позволяют грамотрицательным бактериям вводить батарею эффекторных белков непосредственно в цитозоль эукариотических клеток-хозяев. При входе введенные эффекторные белки совместно модулируют эукариотические сигнальные пути и перепрограммируют клеточные функции, обеспечивая проникновение и выживание бактерий. Мониторинг и локализация этих секретируемых эффекторных белков в контексте инфекций обеспечивает след для определения динамического интерфейса взаимодействий хозяина и патогена. Однако маркировка и визуализация бактериальных белков в клетках-хозяевах без нарушения их структуры/функции технически сложны.
Построение флуоресцентных слитых белков не решает эту проблему, потому что слитые белки заклинивают секреторный аппарат и, таким образом, не секретируются. Чтобы преодолеть эти препятствия, мы недавно применили метод сайт-специфической флуоресцентной маркировки эффекторов, секретируемых бактериями, а также других трудно маркируемых белков с использованием расширения генетического кода (GCE). В этой статье представлен полный пошаговый протокол маркировки эффекторов, секретируемых сальмонеллой , с использованием сайта GCE, за которым следуют указания по визуализации субклеточной локализации секретируемых белков в клетках HeLa с использованием прямой стохастической оптической реконструирующей микроскопии (dSTORM)
Недавние результаты свидетельствуют о том, что включение неканонических аминокислот (ncAA) через GCE с последующей биоортогональной маркировкой тетразинсодержащими красителями является жизнеспособным методом селективного мечения и визуализации бактериальных секретируемых белков и последующего анализа изображений в организме хозяина. Цель этой статьи — предоставить простой и понятный протокол, который может быть использован исследователями, заинтересованными в проведении визуализации сверхвысокого разрешения с использованием GCE для изучения различных биологических процессов в бактериях и вирусах, а также взаимодействия хозяина и патогена.
Introduction
Бактериальные инфекции долгое время считались серьезной опасностью для здоровья человека. Патогены используют высокоразвитые, чрезвычайно мощные и сложные защитные системы, а также различные факторы бактериальной вирулентности (называемые эффекторными белками) для уклонения от иммунных реакций хозяина и установления инфекций 1,2. Однако молекулярные механизмы, лежащие в основе этих систем, и роль отдельных эффекторных белков до сих пор в значительной степени неизвестны из-за отсутствия подходящих подходов для непосредственного отслеживания важнейших белковых компонентов и эффекторов в клетках-хозяевах во время патогенеза.
Одним из типичных примеров является Salmonella enterica serovar Typhimurium, который вызывает острый гастроэнтерит. Сальмонелла Typhimurium использует системы секреции третьего типа (T3SS) для инъекции различных эффекторных белков непосредственно в клетки-хозяева. Как только сальмонелла попадает в клетку-хозяина, она находится в кислом мембраносвязанном компартменте, называемом сальмонеллосодержащей вакуолью (SCV)3,4. Кислотный рН SCV активирует T3SS, кодируемый островком патогенности сальмонеллы 2 (SPI-2), и перемещает залп из 20 или более эффекторных белков через вакуолярную мембрану в цитозоль хозяина 5,6,7,8. Внутри хозяина эти сложные коктейли эффекторных белков координируют сигнальные пути клетки-хозяина, что приводит к образованию высокодинамичных, сложных трубчатых мембранных структур, простирающихся от SCV вдоль микротрубочек, называемых сальмонелла-индуцированными филаментами (SIF), которые позволяют сальмонеллам выживать и реплицироваться в клетках-хозяевах9,10,11.
Методы визуализации, отслеживания и мониторинга локализации бактериальных эффекторов, а также изучения их трафика и взаимодействия внутри клеток-хозяев дают критическое представление о механизмах, лежащих в основе бактериального патогенеза. Маркировка и локализация секретируемых сальмонеллой эффекторных белков T3SS внутри клеток-хозяев оказалась технологической проблемой12,13; Тем не менее, разработка генетически кодируемых флуоресцентных белков изменила нашу способность изучать и визуализировать белки в живых системах. Однако размер флуоресцентных белков (~25-30 кДа)15 часто сопоставим или даже больше, чем размер интересующего белка (POI; например, 13,65 кДа для SsaP, 37,4 кДа для SifA). Фактически, флуоресцентная белковая маркировка эффекторов часто блокирует секрецию меченого эффектора и заклинивает T3SS14.
Кроме того, флуоресцентные белки менее стабильны и испускают небольшое количество фотонов перед фотообесцвечиванием, что ограничивает их использование в микроскопических методах сверхвысокого разрешения16,17,18, особенно в фотоактивационной локализационной микроскопии (PALM), STORM и микроскопии с истощением стимулированного излучения (STED). В то время как фотофизические свойства органических флуоресцентных красителей превосходят свойства флуоресцентных белков, методы/методы, такие как CLIP/SNAP19,20, Split-GFP 21, ReAsH/FlAsH 22,23 и HA-Tags24,25, требуют дополнительного белкового или пептидного придатка, который может нарушить структурно-функциональную функцию интересующего эффекторного белка, препятствуя посттрансляционной модификации или транспортировке. Альтернативный метод, который сводит к минимуму необходимую модификацию белка, включает включение ncAA в POI во время трансляции через GCE. ncAA либо флуоресцентны, либо могут быть сделаны флуоресцентными с помощью клик-химии 12,13,26,27,28.
Используя GCE, ncAA с крошечными функциональными биоортогональными группами (такими как азид, циклопропен или циклооктинная группа) могут быть введены практически в любое место в целевом белке. В этой стратегии нативный кодон заменяется редким кодоном, таким как янтарный (TAG) стоп-кодон в определенной позиции в гене POI. Модифицированный белок впоследствии экспрессируется в клетках вместе с ортогональной парой аминоацил-тРНК-синтетаза/тРНК. Активный сайт тРНК-синтетазы предназначен для получения только одного конкретного ncAA, который затем ковалентно присоединяется к 3′-концу тРНК, распознающему янтарный кодон. ncAA просто вводится в питательную среду, но он должен быть поглощен клеткой и достичь цитозоля, где аминоацил-тРНК-синтетаза (aaRS) может связать его с ортогональной тРНК; затем он включается в POI в указанном месте (см. рис. 1)12. Таким образом, GCE позволяет сайт-специфическое включение множества биоортогональных реакционноспособных групп, таких как кетон, азид, алкин, циклооктин, трансциклоктен, тетразин, норбонен, α, β-ненасыщенный амид и бицикло [6.1.0]-нонин в POI, потенциально преодолевая ограничения традиционных методов маркировки белков 12,26,27,28.
Последние тенденции в методах визуализации сверхвысокого разрешения открыли новые возможности для исследования биологических структур на молекулярном уровне. В частности, STORM, одномолекулярный метод сверхвысокого разрешения, основанный на локализации, стал бесценным инструментом для визуализации клеточных структур с длиной волны до ~ 20-30 нм и способен исследовать биологические процессы по одной молекуле за раз, тем самым открывая роли внутриклеточных молекул, которые еще неизвестны в традиционных исследованиях, усредненных по ансамблю13 . Для одномолекулярных методов и методов сверхвысокого разрешения требуется небольшая метка с яркими, фотостабильными органическими флуорофорами для наилучшего разрешения. Недавно мы продемонстрировали, что GCE можно использовать для включения подходящих зондов для получения изображений сверхвысокого разрешения12.
Двумя лучшими вариантами мечения белков в клетках являются бицикло [6.1.0] нонинлизин (BCN) и транс-циклооктен-лизин (TCO; показан на рисунке 1), которые могут быть генетически кодированы с использованием варианта пары тРНК/синтетаза (здесь называемой тРНК Pyl/PylRS AF), гдеPyl представляет собой пирролизин, а AF представляет собой рационально разработанный двойной мутант (Y306A, Y384F), полученный из Methanosarcina mazei, который естественным образом кодирует пирролизин12. 29,30,31. В ходе реакции циклоприсоединения Дильса-Альдера с обратным электронным спросом (SPIEDAC) эти аминокислоты хемоселективно реагируют с конъюгатами тетразина (рис. 1)12,30,31. Такие реакции циклоприсоединения исключительно быстры и совместимы с живыми клетками; Они также могут быть флюорогенными, если соответствующий флуорофор функционализирован с тетразиновым фрагментом12,26,32. В данной работе представлен оптимизированный протокол мониторинга динамики бактериальных эффекторов, доставляемых в клетки-хозяева с помощью GCE, с последующей субклеточной локализацией секретируемых белков в клетках HeLa с использованием dSTORM. Результаты показывают, что включение ncAA через GCE с последующей реакцией щелчка с флуорогенными тетразинсодержащими красителями представляет собой универсальный метод селективной маркировки, визуализации секретируемых белков и последующей субклеточной локализации в организме хозяина. Однако все компоненты и процедуры, описанные здесь, могут быть скорректированы или заменены таким образом, чтобы система GCE могла быть адаптирована для исследования других биологических вопросов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Подход, описанный в настоящем описании, был использован для отслеживания точного местоположения эффекторных белков, введенных в клетку-хозяина бактериальным T3SS после инфицирования. T3SS используются внутриклеточными патогенами, такими как сальмонелла, шигелла и иерсиния</em…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана стартовыми фондами медицинского отделения Техасского университета в Галвестоне, штат Техас, и наградой Texas STAR для L.J.K. Мы благодарим профессора Эдварда Лемке (Европейская лаборатория молекулярной биологии, Гейдельберг, Германия) за плазмиду pEVOL-PylRS-AF. Изображения на рисунке 1 были созданы с помощью BioRender.
Materials
| 10x Tris/Glycine SDS running buffer | BIO-RAD | 1610732 | |
| Ammonium chloride | Fischer Scientific | A661-500 | |
| Ammonium sulphate | Fischer Scientific | BP212R-1 | |
| Ampicillin Sodium | Sigma-Aldrich | A0166 | 5 g |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermiFischer Scientific | 15240096 | |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | 500 g |
| Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge) | Beckman Coulter | ||
| Bacto-Agar | BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA | 214010 | |
| BDP-FL-tetrazine | Lumiprobe (USA) | 2.14E+02 | |
| β-mercaptoethanol | Millipore | 444203 | 250 mL |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B8026 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503 | 500 g |
| Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en – L – Lysine (TCO*A) | SiChem GmbH | SC-8008 | Size: 500 mg |
| DAPI (Hoechst33342) | Invitrogen | H3570 | |
| DeNovix DS-11+ Spectrophotometer | DeNovix | ||
| DMEM* | Corning | 10-013-CV | * Used for maintaining HeLa Cell |
| DMEM** | Gibco | 11965-092 | **Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | 250 g |
| Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody | Invitrogen | A-31572 | |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
| E. coli strain BL21 (DE3) | Novagen (Madison, WI) | ||
| EMCCD Camera | Andor | iXon Ultra 897-BV | |
| Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30123.328 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fischer | 10082147 | |
| Fisherbrand Syringe Filters – Sterile (PVDF 0.22 µm) | Fischer Scientific | 97203 | Pack of 100 |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | BIO-RAD | 1652660 | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1272 | 10 mL |
| Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x | Fischer Scientific | 25-030-081 | |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7141-50KU | |
| Glycerol | Fischer Scientific | BF229-4 | |
| HeLa cells | ATTC | CCL-2 | |
| HEPES Buffer | Corning | 25-060-C1 | 100 mL |
| Hydrocloric acid | Fischer Scientific | A144-212 | |
| ImageJ | Image processing and analysis: http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
| IntantBlue | Expedeon | ISB1L | Coomassie-based stain |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| Janelia Fluoro 646-tetrazine | Tocris Bioscience | 7279 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | 5 g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| μManager (v. 1.4.2) | https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release | ||
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 250 g |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2086 | 0.2 cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Nikon N-STORM | Nikon Instruments Inc. | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution | |
| Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks | ThermiFischer Scientific | 156499 | |
| Omnipur Casamino Acid | Calbiochem | 2240 | 500 g |
| Paraformaldehhyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution (100x) | GenDEPOT | CA005-010 | 100 mL |
| pEVOL-PylRS-AF | For plasmid construction and map see following references 1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70. |
||
| Plasmid Mini-prep Kit | Qiagen | 27106 | |
| plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA | Ref.: elife. 2021, 10, e67789. | ||
| plasmid pWSK29-sseJ-HA | Ref.: elife. 2021, 10, e67789. Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/ | ||
| Pluronic F-127 | Millipore | 540025 | Protein grade, 10% Solution |
| Potassium phosphate monobasic | Fischer Scientific | P285-500 | |
| Potassium sulphate | Acros Organic | 424220250 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Set I – Calbiochem | Sigma-Aldrich | 539131 | 100x Solution |
| Rabbit anti-HA primary antibody | Sigma-Aldrich | H6908 | |
| S. enterica. serovar Typhimurium 14028s | Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116. | ||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036-50G-F | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium hydroxide | Fischer Scientific | SS255-1 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM), 100x | Corning | 25-060-C1 | 100 mL |
| Sonic Dismembrator Model 100 | Fischer Scientific | 24932 | |
| STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/ | |
| ThunderSTORM | https://zitmen.github.io/thunderstorm/ | ||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypsin-EDTA (1x), 0.25% | GenDEPOT | CA014-010 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 100 mL |
| X-well tissue culture chamber slides | SARSTEDT | 94.6190.802 |
Referências
- Marlovits, T. C., et al. Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex. Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).
- Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science. 280 (5363), 602-605 (1998).
- LaRock, D. L., Chaudhary, A., Miller, S. I. Salmonellae interactions with host processes. Nature Reviews Microbiology. 13 (4), 191-205 (2015).
- Galan, J. E., Waksman, G. Protein-injection machines in bacteria. Cell. 172 (6), 1306-1318 (2018).
- Feng, X., Oropeza, R., Kenney, L. J. Dual regulation by phospho-OmpR of ssrA/B gene expression in Salmonella pathogenicity island 2. Molecular Microbiology. 48 (4), 1131-1143 (2003).
- Walthers, D., et al. Salmonella enterica response regulator SsrB relieves H-NS silencing by displacing H-NS bound in polymerization mode and directly activates transcription. Journal of Biological Chemistry. 286 (3), 1895-1902 (2011).
- Chakraborty, S., Mizusaki, H., Kenney, L. J. A FRET-based DNA biosensor tracks OmpR-dependent acidification of Salmonella during macrophage infection. PLoS Biology. 13 (4), e1002116 (2015).
- Liew, A. T. F., et al. Single cell, super-resolution imaging reveals an acid pH-dependent conformational switch in SsrB regulates SPI-2. eLife. 8, e45311 (2019).
- Knuff, K., Finlay, B. B. What the SIF is happening-the role of intracellular Salmonella-induced filaments. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 335 (2017).
- Drecktrah, D., et al. Dynamic behavior of Salmonella-induced membrane tubules in epithelial cells. Traffic. 9 (12), 2117-2129 (2008).
- Garcia del-Portillo, F., Zwick, M. B., Leung, K. Y., Finlay, B. B. Salmonella induces the formation of filamentous structures containing lysosomal membrane glycoproteins in epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10544-10548 (1993).
- Singh, M. K., Zangoui, P., Yamanaka, Y., Kenney, L. J. Genetic code expansion enables visualization of Salmonella type three secretion system components and secreted effectors. elife. 10, e67789 (2021).
- Singh, M. K., Kenney, L. J. Super-resolution imaging of bacterial pathogens and visualization of their secreted effectors. FEMS Microbiology Reviews. 45 (2), fuaa050 (2020).
- Akeda, Y., Galan, J. E. Chaperone release and unfolding of substrates in type III secretion. Nature. 437 (7060), 911-915 (2005).
- Su, W. W. Fluorescent proteins as tools to aid protein production. Microbial Cell Factories. 4 (1), 12 (2005).
- Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8452-8457 (2014).
- Ghodke, H., Caldas, V. E. A., Punter, C. M., van Oijen, A. M., Robinson, A. Single-molecule specific mislocalization of red fluorescent proteins in live Escherichia coli. Biophysical Journal. 111 (1), 25-27 (2016).
- Gahlmann, A., Moerner, W. E. Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging. Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).
- Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
- Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemical Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
- Young, A. M., Minson, M., McQuate, S. E., Palmer, A. E. Optimized fluorescence complementation platform for visualizing Salmonella effector proteins reveals distinctly different intracellular niches in different cell types. ACS Infectious Diseases. 3 (8), 575-584 (2017).
- Martin, B. R., Giepmans, B. N., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Mammalian cell-based optimization of the biarsenical-binding tetracysteine motif for improved fluorescence and affinity. Nature Biotechnology. 23 (10), 1308-1314 (2005).
- Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).
- Gao, Y., Spahn, C., Heilemann, M., Kenney, L. J. The pearling transition provides evidence of force-driven endosomal tubulation during Salmonella infection. mBio. 9 (3), e01083-e01018 (2018).
- Brumell, J. H., Goosney, D. L., Finlay, B. B. SifA, a type III secreted effector of Salmonella typhimurium, directs Salmonella-induced filament (Sif) formation along microtubules. Traffic. 3 (6), 407-415 (2002).
- Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
- Davis, L., Chin, J. W. Designer proteins: applications of genetic code expansion in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 168-182 (2012).
- Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
- Kipper, K., et al. Application of noncanonical amino acids for protein labeling in a genomically recoded Escherichia coli. ACS Synthetic Biology. 6 (2), 233-255 (2017).
- Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. Journal of American Chemical Society. 137 (14), 4602-4605 (2015).
- Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angewandte Chemie International Edition. 51 (17), 4166-4170 (2012).
- Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. Journal of the American Chemical Society. 134 (25), 10317-10320 (2012).
- Xu, H., et al. Re-exploration of the codon context effect on amber codon-guided incorporation of noncanonical amino acids in Escherichia coli by the blue-white screening assay. ChemBioChem. 17 (13), 1250-1256 (2016).
- Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Research. 28 (1), 292 (2000).
- Spahn, C., et al. Sequential super-resolution imaging of bacterial regulatory proteins: the nucleoid and the cell membrane in single, fixed E. coli cells. Methods in Molecular Biology. 1624, 269-289 (2017).
- Grimm, J., English, B., Chen, J., et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).
- Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81 (1), 12-46 (2017).
- Meineke, B., Heimgärtner, J., Eirich, J., Landreh, M., Elsässer, S. J. Site-specific incorporation of two ncAAs for two-color bioorthogonal labeling and crosslinking of proteins on live mammalian cells. Cell Reports. 31 (12), 107811 (2020).
- Bessa-Neto, D., et al. Bioorthogonal labeling of transmembrane proteins with non-canonical amino acids unveils masked epitopes in live neurons. Nature Communications. 12 (1), 6715 (2021).
- Beliu, G., et al. Bioorthogonal labeling with tetrazine-dyes for super-resolution microscopy. Communication Biology. 2, 261 (2019).
- Arsić, A., Hagemann, C., Stajković, N., Schubert, T., Nikić-Spiegel, I. Minimal genetically encoded tags for fluorescent protein labeling in living neurons. Nature Communications. 13 (1), 314 (2022).
