Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion

Moirangthem Kiran Singh; Linda J. Kenney

doi:10.3791/64382

JoVE Journal > Biology

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biologia

Genetik Kod Genişlemesi Kullanılarak Bakteriyel Salgılanan Proteinlerin Süper Çözünürlüklü Görüntülenmesi

Published: February 10, 2023

doi:

10.3791/64382

Moirangthem Kiran Singh, Linda J. Kenney

¹Biochemistry & Molecular Biology,University of Texas Medical Branch

Summary

Bu makale, genetik kod genişlemesi (GCE) bölgesini kullanarak Salmonella salgılanan efektörlerini spesifik olarak etiketlemek ve doğrudan stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (dSTORM) kullanarak HeLa hücrelerinde salgılanan proteinlerin hücre altı lokalizasyonunu görüntülemek için basit ve açık bir protokol sunmaktadır

Abstract

Tip üç sekresyon sistemleri (T3SS’ler), gram-negatif bakterilerin bir efektör protein bataryasını doğrudan ökaryotik konakçı hücrelerin sitozolüne enjekte etmesini sağlar. Girişte, enjekte edilen efektör proteinler ökaryotik sinyal yollarını işbirliği içinde modüle eder ve hücresel fonksiyonları yeniden programlayarak bakteri girişini ve hayatta kalmasını sağlar. Bu salgılanan efektör proteinlerin enfeksiyonlar bağlamında izlenmesi ve lokalize edilmesi, konakçı-patojen etkileşimlerinin dinamik arayüzünü tanımlamak için bir ayak izi sağlar. Bununla birlikte, konakçı hücrelerdeki bakteri proteinlerinin yapılarını/işlevlerini bozmadan etiketlenmesi ve görüntülenmesi teknik olarak zordur.

Floresan füzyon proteinlerinin oluşturulması bu sorunu çözmez, çünkü füzyon proteinleri salgı aparatını sıkıştırır ve böylece salgılanmaz. Bu engellerin üstesinden gelmek için, yakın zamanda genetik kod genişlemesi (GCE) kullanarak, bakteriyel salgılanan efektörlerin ve diğer etiketlenmesi zor proteinlerin bölgeye özgü floresan etiketlemesi için bir yöntem kullandık. Bu makale, GCE bölgesini kullanarak Salmonella salgılanan efektörlerini etiketlemek için eksiksiz bir adım adım protokol ve ardından doğrudan stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (dSTORM) kullanarak HeLa hücrelerinde salgılanan proteinlerin hücre altı lokalizasyonunu görüntülemek için talimatlar sunmaktadır

Son bulgular, kanonik olmayan amino asitlerin (ncAA’lar) GCE yoluyla dahil edilmesinin, ardından tetrazin içeren boyalarla biyo-ortogonal etiketlemenin, bakteriyel salgılanan proteinlerin seçici etiketlenmesi ve görselleştirilmesi ve konakçıda müteakip görüntü analizi için uygun bir teknik olduğunu göstermektedir. Bu makalenin amacı, bakteri ve virüslerdeki çeşitli biyolojik süreçleri ve konakçı-patojen etkileşimlerini incelemek için GCE kullanarak süper çözünürlüklü görüntüleme yapmakla ilgilenen araştırmacılar tarafından kullanılabilecek basit ve net bir protokol sağlamaktır.

Introduction

Bakteriyel enfeksiyonlar uzun zamandır insan sağlığı için ciddi bir tehlike olarak kabul edilmektedir. Patojenler, konakçı bağışıklık tepkilerinden kaçınmak ve enfeksiyonları oluşturmak için oldukça gelişmiş, son derece güçlü ve karmaşık savunma sistemlerinin yanı sıra çeşitli bakteriyel virülans faktörlerini (efektör proteinler olarak adlandırılır) kullanırlar ^1,2. Bununla birlikte, bu sistemlerin altında yatan moleküler mekanizmalar ve bireysel efektör proteinlerin rolü, patogenez sırasında konakçı hücrelerdeki önemli protein bileşenlerini ve efektörlerini doğrudan takip etmek için uygun yaklaşımların yetersizliği nedeniyle hala büyük ölçüde bilinmemektedir.

Tipik bir örnek, akut gastroenterite neden olan Salmonella enterica serovar Typhimurium’dur. Salmonella Typhimurium, çeşitli efektör proteinleri doğrudan konakçı hücrelere enjekte etmek için tip üç sekresyon sistemlerini (T3SS) kullanır. Salmonella konakçı hücreye girer girmez, Salmonella içeren vakuol (SCV) ^3,4 olarak adlandırılan asidik membrana bağlı bir bölmede bulunur. SCV’nin asit pH’ı, Salmonella patojenite adası 2 (SPI-2) kodlu T3SS’yi aktive eder ve vakuolar membran boyunca 20 veya daha fazla efektör proteinden oluşan bir voleybolu konakçı sitosol ^5,6,7,8’e dönüştürür. Konağın içinde, efektör proteinlerin bu karmaşık kokteylleri, konakçı hücre sinyal yollarını koordine bir şekilde manipüle eder, bu da SCV’den mikrotübüller boyunca uzanan ve Salmonella’nın konakçı hücreler içinde hayatta kalmasını ve çoğalmasını sağlayan Salmonella kaynaklı filamentler (SIF’ler) olarak adlandırılan son derece dinamik, karmaşık boru şeklindeki membran yapılarının oluşmasına neden olur^9,10,11.

Bakteriyel efektör lokalizasyonlarını görselleştirmek, izlemek ve izlemek ve konakçı hücreler içindeki kaçakçılığını ve etkileşimlerini incelemek için kullanılan yöntemler, bakteriyel patogenezi destekleyen mekanizmalar hakkında kritik bilgiler sağlar. Salmonella salgılanan T3SS efektör proteinlerinin konakçı hücreler içinde etiketlenmesi ve lokalizasyonunun teknolojik bir zorluk olduğu kanıtlanmıştır^12,13; Bununla birlikte, genetik olarak kodlanmış floresan proteinlerinin gelişimi, canlı sistemler içindeki proteinleri inceleme ve görselleştirme yeteneğimizi dönüştürmüştür. Bununla birlikte, floresan proteinlerinin boyutu (~25-30 kDa)15 genellikle ilgilenilen proteininkiyle karşılaştırılabilir veya hatta ondan daha büyüktür (POI; örneğin, SsaP için ^13.65 kDa, SifA için 37.4 kDa). Aslında, efektörlerin floresan protein etiketlemesi genellikle etiketli efektörün salgılanmasını bloke eder ve T3SS^14’ü sıkıştırır.

Ayrıca, floresan proteinler daha az kararlıdır ve fotobeyazlatmadan önce düşük sayıda foton yayar, bu da süper çözünürlüklü mikroskobik tekniklerde^{kullanımlarını sınırlar 16,17,18}^, özellikle fotoaktivasyon lokalizasyon mikroskobu (PALM), STORM ve uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobu. Organik floresan boyaların fotofiziksel özellikleri floresan proteinlerinkinden daha üstün olsa da, CLIP / SNAP^19,20, Split-GFP 21, ReAsH / FlAsH 22,23 ve HA-Tags^24,25 gibi yöntemler / teknikler^, çeviri sonrası modifikasyona veya kaçakçılığa müdahale ederek ilgili efektör proteinin yapısını-işlevini bozabilecek ek bir protein veya peptit eki gerektirir. Gerekli protein modifikasyonunu en aza indiren alternatif bir yöntem, GCE yoluyla çeviri sırasında ncAA’ların bir POI’ye dahil edilmesini içerir. ncAA’lar ya floresandır ya da tıklama kimyası 12,13,26,27,28 ile floresan yapılabilir.

GCE kullanarak, küçük, işlevsel, biyo-ortogonal gruplara (azid, siklopropen veya siklooktin grubu gibi) sahip ncAA’lar, bir hedef proteinin hemen hemen her yerine sokulabilir. Bu stratejide, doğal bir kodon, POI’nin geninde belirli bir konumda amber (TAG) durdurma kodonu gibi nadir bir kodon ile değiştirilir. Modifiye protein daha sonra ortogonal aminoasil-tRNA sentetaz / tRNA çifti ile birlikte hücrelerde eksprese edilir. tRNA sentetaz aktif bölgesi, yalnızca belirli bir ncAA’yı alacak şekilde tasarlanmıştır, bu daha sonra kehribar kodonu tanıyan tRNA’nın 3′ ucuna kovalent olarak bağlanır. ncAA basitçe büyüme ortamına sokulur, ancak hücre tarafından alınmalı ve aminoasil-tRNA sentetazın (aaRS) ortogonal tRNA’ya bağlayabileceği sitozole ulaşmalıdır; daha sonra belirtilen konumdaki İÇN’ye dahil edilir (bkz. Şekil 1)¹². Böylece, GCE, keton, azid, alkin, siklooktin, transsiklookten, tetrazin, norbonen, α, β-doymamış amid ve bicyclo [6.1.0]-nonyne gibi biyo-ortogonal reaktif grupların bolluğunun bir POI’ye bölgeye özgü olarak dahil edilmesini sağlar^ve potansiyel olarak geleneksel protein etiketleme yöntemlerinin sınırlamalarının üstesinden gelir 12,26,27,28.

Süper çözünürlüklü görüntüleme tekniklerinde son zamanlarda ortaya çıkan eğilimler, biyolojik yapıları moleküler düzeyde araştırmak için yeni yollar açmıştır. Özellikle, tek moleküllü, lokalizasyon tabanlı, süper çözünürlüklü bir teknik olan STORM, ~ 20-30 nm’ye kadar hücresel yapıları görselleştirmek için paha biçilmez bir araç haline gelmiştir ve biyolojik süreçleri bir seferde bir molekül araştırabilmekte ve böylece geleneksel topluluk ortalamalı çalışmalarda henüz bilinmeyen hücre içi moleküllerin rollerini keşfedebilmektedir¹³ . Tek moleküllü ve süper çözünürlüklü teknikler, en iyi çözünürlük için parlak, fotoğraflanabilir organik floroforlara sahip küçük bir etiket gerektirir. Yakın zamanda GCE’nin süper çözünürlüklü görüntüleme¹² için uygun probları dahil etmek için kullanılabileceğini gösterdik.

Hücrelerde protein etiketleme için en iyi seçeneklerden ikisi, bisiklo [6.1.0] nonynelysine (BCN) ve trans-siklookten-lizindir (TCO; Şekil 1’de gösterilmiştir), burada Pyl pirolizin temsil eder ve AF, doğal olarak pirolizin ^12’yi kodlayan Methanosarcina labirentinden türetilen rasyonel olarak tasarlanmış bir çift mutantı (Y306A, Y384F) temsil eder^. 29,30,31. Suş destekli ters elektron talebi Diels-Alder sikloekleme (SPIEDAC) reaksiyonu sayesinde, bu amino asitler tetrazin konjugatları ile kemoselektif olarak reaksiyona girer (Şekil 1)12,30,31. Bu tür sikloekleme reaksiyonları son derece hızlıdır ve canlı hücrelerle uyumludur; Ayrıca, tetrazin moiety 12,26,32 ile uygun bir florofor işlevselleştirilirse^, florojenik olabilirler. Bu yazıda, GCE kullanılarak konakçı hücrelere verilen bakteriyel efektörlerin dinamiklerini izlemek için optimize edilmiş bir protokol ve ardından dSTORM kullanılarak HeLa hücrelerinde salgılanan proteinlerin hücre altı lokalizasyonu sunulmaktadır. Sonuçlar, GCE yoluyla bir ncAA’nın dahil edilmesinin, ardından florojenik tetrazin taşıyan boyalarla bir tıklama reaksiyonunun, seçici etiketleme, salgılanan proteinlerin görselleştirilmesi ve ardından konakçıda hücre altı lokalizasyonu için çok yönlü bir yöntemi temsil ettiğini göstermektedir. Bununla birlikte, burada ayrıntılı olarak açıklanan tüm bileşenler ve prosedürler, GCE sisteminin diğer biyolojik soruları araştırmak için uyarlanabilmesi için ayarlanabilir veya değiştirilebilir.

Protocol

1. Plazmid konstrüksiyonu POI’yi ifade eden geni, E. coli BL21’deki (DE3) POI’yi ifade eden bir ekspresyon plazmidine (örneğin, pET28a-sseJ 10TAG) klonlayın. Bu adım, mutantların işlevsel olduğunu belirlemeyi kolaylaştırır. Konakçı hücrelerde Salmonella salgılanan efektörlerin görselleştirilmesi için, önceki raporlarda açıklandığı gibi, yerel promotörünün kontrolü altında hedef POI SseJ’yi ifade eden bir ekspresyon plazmidi (pWS…

Representative Results

Bu protokol belgesinde, Şekil 1’de gösterildiği gibi, bölgeye özgü floresan etiketleme ve Salmonella salgılanan efektörlerin görselleştirilmesi için GCE tabanlı bir yöntem açıklanmaktadır. ncAA taşıyan trans-siklookten biyoortogonal grubunun (TCO) kimyasal yapısı ve floresan boya Şekil 1A’da gösterilmiştir. SseJ etiketlemesi, GCE teknolojisi ile ortogonal aminoasil-tRNA sentetaz / tRNA çi…

Discussion

Burada açıklanan yaklaşım, enfeksiyondan sonra bakteriyel T3SS tarafından konakçı hücreye enjekte edilen efektör proteinlerin kesin yerini izlemek için kullanılmıştır. T3SS’ler, virülans bileşenlerini konakçıya taşımak için Salmonella, Shigella ve Yersinia gibi hücre içi patojenler tarafından kullanılır. Süper çözünürlüklü görüntüleme teknolojilerinin geliştirilmesi, virülans faktörlerini daha önce hayal bile edilemeyen bir çözünürlükte görselleşti…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Teksas Üniversitesi Tıp Fakültesi, Galveston, TX’den başlangıç fonları ve L.J.K.’ya Texas STAR ödülü ile desteklendi. Prof. Edward Lemke’ye (Avrupa Moleküler Biyoloji Laboratuvarı, Heidelberg, Almanya) plazmid pEVOL-PylRS-AF için teşekkür ederiz. Şekil 1’deki görüntüler BioRender kullanılarak oluşturulmuştur.

Materials

10x Tris/Glycine SDS running buffer	BIO-RAD	1610732
Ammonium chloride	Fischer Scientific	A661-500
Ammonium sulphate	Fischer Scientific	BP212R-1
Ampicillin Sodium	Sigma-Aldrich	A0166	5 g
Antibiotic-Antimycotic (100x)	ThermiFischer Scientific	15240096
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256	500 g
Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge)	Beckman Coulter
Bacto-Agar	BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA	214010
BDP-FL-tetrazine	Lumiprobe (USA)	2.14E+02
β-mercaptoethanol	Millipore	444203	250 mL
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B8026
BSA	Sigma-Aldrich	A4503	500 g
Casein	Sigma-Aldrich	C8654
Catalase	Sigma-Aldrich	C9322
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C1919
Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en – L – Lysine (TCO*A)	SiChem GmbH	SC-8008	Size: 500 mg
DAPI (Hoechst33342)	Invitrogen	H3570
DeNovix DS-11+ Spectrophotometer	DeNovix
DMEM*	Corning	10-013-CV	* Used for maintaining HeLa Cell
DMEM**	Gibco	11965-092	**Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4.
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	250 g
Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody	Invitrogen	A-31572
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV
E. coli strain BL21 (DE3)	Novagen (Madison, WI)
EMCCD Camera	Andor	iXon Ultra 897-BV
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean)	Eppendorf, Hamburg, Germany	30123.328
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fischer	10082147
Fisherbrand Syringe Filters – Sterile (PVDF 0.22 µm)	Fischer Scientific	97203	Pack of 100
Gene Pulser Xcell Electroporator	BIO-RAD	1652660
Gentamycin	Sigma-Aldrich	G1272	10 mL
Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x	Fischer Scientific	25-030-081
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G7141-50KU
Glycerol	Fischer Scientific	BF229-4
HeLa cells	ATTC	CCL-2
HEPES Buffer	Corning	25-060-C1	100 mL
Hydrocloric acid	Fischer Scientific	A144-212
ImageJ			Image processing and analysis: http://rsbweb.nih.gov/ij
IntantBlue	Expedeon	ISB1L	Coomassie-based stain
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	I5502
Janelia Fluoro 646-tetrazine	Tocris Bioscience	7279
Kanamycin	Sigma-Aldrich	60615	5 g
LB Broth	BD Difco	244620	500 g
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876
μManager (v. 1.4.2)			https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release
MES	Sigma-Aldrich	M3671	250 g
Micro pulser cuvette	BIO-RAD	165-2086	0.2 cm electrode gap, pkg. of 50
Nikon N-STORM	Nikon Instruments Inc.		https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution
Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks	ThermiFischer Scientific	156499
Omnipur Casamino Acid	Calbiochem	2240	500 g
Paraformaldehhyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences	15710
PBS (10x)	Roche	11666789001
Penicillin-Streptomycin Solution (100x)	GenDEPOT	CA005-010	100 mL
pEVOL-PylRS-AF			For plasmid construction and map see following references 1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.
Plasmid Mini-prep Kit	Qiagen	27106
plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA			Ref.: elife. 2021, 10, e67789.
plasmid pWSK29-sseJ-HA			Ref.: elife. 2021, 10, e67789. Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/
Pluronic F-127	Millipore	540025	Protein grade, 10% Solution
Potassium phosphate monobasic	Fischer Scientific	P285-500
Potassium sulphate	Acros Organic	424220250
Protease Inhibitor Cocktail Set I – Calbiochem	Sigma-Aldrich	539131	100x Solution
Rabbit anti-HA primary antibody	Sigma-Aldrich	H6908
S. enterica. serovar Typhimurium 14028s			Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.
Saponin	Sigma-Aldrich	47036-50G-F
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771
Sodium hydroxide	Fischer Scientific	SS255-1
Sodium Pyruvate (100 mM), 100x	Corning	25-060-C1	100 mL
Sonic Dismembrator Model 100	Fischer Scientific	24932
STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system)	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany		https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/
ThunderSTORM			https://zitmen.github.io/thunderstorm/
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503
Trypsin-EDTA (1x), 0.25%	GenDEPOT	CA014-010
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416	100 mL
X-well tissue culture chamber slides	SARSTEDT	94.6190.802

Referências

Marlovits, T. C., et al. Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex. Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).
Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science. 280 (5363), 602-605 (1998).
LaRock, D. L., Chaudhary, A., Miller, S. I. Salmonellae interactions with host processes. Nature Reviews Microbiology. 13 (4), 191-205 (2015).
Galan, J. E., Waksman, G. Protein-injection machines in bacteria. Cell. 172 (6), 1306-1318 (2018).
Feng, X., Oropeza, R., Kenney, L. J. Dual regulation by phospho-OmpR of ssrA/B gene expression in Salmonella pathogenicity island 2. Molecular Microbiology. 48 (4), 1131-1143 (2003).
Walthers, D., et al. Salmonella enterica response regulator SsrB relieves H-NS silencing by displacing H-NS bound in polymerization mode and directly activates transcription. Journal of Biological Chemistry. 286 (3), 1895-1902 (2011).
Chakraborty, S., Mizusaki, H., Kenney, L. J. A FRET-based DNA biosensor tracks OmpR-dependent acidification of Salmonella during macrophage infection. PLoS Biology. 13 (4), e1002116 (2015).
Liew, A. T. F., et al. Single cell, super-resolution imaging reveals an acid pH-dependent conformational switch in SsrB regulates SPI-2. eLife. 8, e45311 (2019).
Knuff, K., Finlay, B. B. What the SIF is happening-the role of intracellular Salmonella-induced filaments. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 335 (2017).
Drecktrah, D., et al. Dynamic behavior of Salmonella-induced membrane tubules in epithelial cells. Traffic. 9 (12), 2117-2129 (2008).
Garcia del-Portillo, F., Zwick, M. B., Leung, K. Y., Finlay, B. B. Salmonella induces the formation of filamentous structures containing lysosomal membrane glycoproteins in epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10544-10548 (1993).
Singh, M. K., Zangoui, P., Yamanaka, Y., Kenney, L. J. Genetic code expansion enables visualization of Salmonella type three secretion system components and secreted effectors. elife. 10, e67789 (2021).
Singh, M. K., Kenney, L. J. Super-resolution imaging of bacterial pathogens and visualization of their secreted effectors. FEMS Microbiology Reviews. 45 (2), fuaa050 (2020).
Akeda, Y., Galan, J. E. Chaperone release and unfolding of substrates in type III secretion. Nature. 437 (7060), 911-915 (2005).
Su, W. W. Fluorescent proteins as tools to aid protein production. Microbial Cell Factories. 4 (1), 12 (2005).
Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8452-8457 (2014).
Ghodke, H., Caldas, V. E. A., Punter, C. M., van Oijen, A. M., Robinson, A. Single-molecule specific mislocalization of red fluorescent proteins in live Escherichia coli. Biophysical Journal. 111 (1), 25-27 (2016).
Gahlmann, A., Moerner, W. E. Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging. Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).
Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemical Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
Young, A. M., Minson, M., McQuate, S. E., Palmer, A. E. Optimized fluorescence complementation platform for visualizing Salmonella effector proteins reveals distinctly different intracellular niches in different cell types. ACS Infectious Diseases. 3 (8), 575-584 (2017).
Martin, B. R., Giepmans, B. N., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Mammalian cell-based optimization of the biarsenical-binding tetracysteine motif for improved fluorescence and affinity. Nature Biotechnology. 23 (10), 1308-1314 (2005).
Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).
Gao, Y., Spahn, C., Heilemann, M., Kenney, L. J. The pearling transition provides evidence of force-driven endosomal tubulation during Salmonella infection. mBio. 9 (3), e01083-e01018 (2018).
Brumell, J. H., Goosney, D. L., Finlay, B. B. SifA, a type III secreted effector of Salmonella typhimurium, directs Salmonella-induced filament (Sif) formation along microtubules. Traffic. 3 (6), 407-415 (2002).
Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
Davis, L., Chin, J. W. Designer proteins: applications of genetic code expansion in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 168-182 (2012).
Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
Kipper, K., et al. Application of noncanonical amino acids for protein labeling in a genomically recoded Escherichia coli. ACS Synthetic Biology. 6 (2), 233-255 (2017).
Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. Journal of American Chemical Society. 137 (14), 4602-4605 (2015).
Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angewandte Chemie International Edition. 51 (17), 4166-4170 (2012).
Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. Journal of the American Chemical Society. 134 (25), 10317-10320 (2012).
Xu, H., et al. Re-exploration of the codon context effect on amber codon-guided incorporation of noncanonical amino acids in Escherichia coli by the blue-white screening assay. ChemBioChem. 17 (13), 1250-1256 (2016).
Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Research. 28 (1), 292 (2000).
Spahn, C., et al. Sequential super-resolution imaging of bacterial regulatory proteins: the nucleoid and the cell membrane in single, fixed E. coli cells. Methods in Molecular Biology. 1624, 269-289 (2017).
Grimm, J., English, B., Chen, J., et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).
Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81 (1), 12-46 (2017).
Meineke, B., Heimgärtner, J., Eirich, J., Landreh, M., Elsässer, S. J. Site-specific incorporation of two ncAAs for two-color bioorthogonal labeling and crosslinking of proteins on live mammalian cells. Cell Reports. 31 (12), 107811 (2020).
Bessa-Neto, D., et al. Bioorthogonal labeling of transmembrane proteins with non-canonical amino acids unveils masked epitopes in live neurons. Nature Communications. 12 (1), 6715 (2021).
Beliu, G., et al. Bioorthogonal labeling with tetrazine-dyes for super-resolution microscopy. Communication Biology. 2, 261 (2019).
Arsić, A., Hagemann, C., Stajković, N., Schubert, T., Nikić-Spiegel, I. Minimal genetically encoded tags for fluorescent protein labeling in living neurons. Nature Communications. 13 (1), 314 (2022).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artigo

Singh, M. K., Kenney, L. J. Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion. J. Vis. Exp. (192), e64382, doi:10.3791/64382 (2023).