Extraction, marquage et purification de cellules spécifiques à la lignée à partir de follicules antraux humains
Summary
Ici, nous présentons des protocoles pour l’identification et la purification des cellules ovariennes des follicules antraux. Nous développons des méthodes de traitement des ovaires entiers pour la cryoconservation des bandes corticales tout en récoltant des follicules antraux intacts qui sont traités enzymatiquement pour libérer plusieurs types de cellules résidentes du follicule, y compris la granulosa, la thèque, les cellules endothéliales, hématopoïétiques et stromales.
Abstract
L’activation, la croissance, le développement et la maturation des ovocytes est un processus complexe qui est coordonné non seulement entre plusieurs types de cellules de l’ovaire, mais aussi à travers plusieurs points de contrôle dans le circuit hypothalamique / hypophysaire / ovarien. Dans l’ovaire, plusieurs types de cellules spécialisées se développent en étroite association avec l’ovocyte dans les follicules ovariens. La biologie de ces cellules a été bien décrite aux stades ultérieurs, lorsqu’elles sont facilement récupérées en tant que sous-produits des traitements de procréation assistée. Cependant, l’analyse approfondie des petits follicules antraux isolés directement de l’ovaire n’est pas couramment effectuée en raison de la rareté du tissu ovarien humain et de l’accès limité à l’ovaire chez les patientes subissant des traitements de procréation assistée.
Ces méthodes de traitement des ovaires entiers pour la cryoconservation de bandelettes corticales avec l’identification/isolement simultané de cellules ovariennes résidentes permettent l’analyse à haute résolution des premiers stades du développement du follicule antral. Nous démontrons des protocoles pour isoler des types de cellules discrètes en traitant les follicules antraux par voie enzymatique et en séparant les cellules granulosa, thèques, endothéliales, hématopoïétiques et stromales. L’isolement des cellules des follicules antraux à différentes tailles et stades de développement permet l’analyse complète des mécanismes cellulaires et moléculaires qui entraînent la croissance des follicules et la physiologie ovarienne et fournit une source de cellules viables qui peuvent être cultivées in vitro pour récapituler le microenvironnement du follicule.
Introduction
Les principaux éléments fonctionnels de l’ovaire humain sont les follicules, qui régissent la croissance et le développement des ovocytes. Les protocoles d’isolement des cellules folliculaires ont été bien établis dans le contexte de la fécondation in vitro , mais ils ne sont appropriés que pour le prélèvement de cellules à partir de follicules lutéinisés au point de prélèvement ovocytaire1. Nous avons développé un protocole qui permet d’isoler des populations cellulaires discrètes à partir de follicules antraux à différents stades de développement provenant d’ovaires natifs ou de tissu ovarien xénotransplanté2. Bien qu’il existe un consensus sur le fait que les contributions des cellules résidentes du follicule à la culture de l’ovocyte sont très importantes, peu d’études ont identifié et extrait de manière prospective les sous-types phénotypiques uniques présents dans les follicules au stade antral. Une meilleure compréhension de la hiérarchie de différenciation et de la transduction du signal entre les cellules spécialisées au cours des différents stades de développement pourrait élargir notre compréhension de la physiologie ovarienne dans des conditions homéostatiques et pathologiques. De plus, la discrimination des sous-types cellulaires discrets et leurs contributions moléculaires à la croissance / maturation des follicules peuvent fournir un moyen de générer des substituts ex vivo qui reconstruisent la fonction ovarienne pour favoriser la maturation ovocytaire et / ou traiter le dysfonctionnement endocrinien.
Chaque type de cellule unique dans l’ovaire contribue à la fonction complexe du follicule, qui fonctionne efficacement comme un mini-organe discret pour favoriser la croissance et la maturation de l’ovocyte qu’il contient. L’ovocyte, la pièce maîtresse du follicule, est directement enveloppé par une couche continue de cellules de la granulosa (GC), les cellules thèques (TC) formant une couche secondaire de cellules qui se combinent avec l’ovocyte et les GC pour composer l’unité folliculaire. Bien que classés en deux groupes, les CG et les CT contiennent de nombreux sous-types. Les GC sont classés en fonction de leur position dans le follicule; Les GC qui entourent l’ovocyte par rapport à celles qui sont adjacentes à la membrane basale sont désignées comme des GC oophores et murales, respectivement, et ces sous-types présentent des signatures transcriptomiques uniques. Les CT ont de nombreux sous-types qui fonctionnent pour fournir un soutien stéroïdogène, métabolique et structurel. Les cellules endothéliales, périvasculaires et immunitaires jouent un rôle central dans le maintien d’une physiologie ovarienne normale. Le stroma ovarien sert non seulement de substrat pour la croissance des follicules, mais fournit également probablement une source de progéniteurs qui donnent lieu à des TC. Ce complexe multicouche de sous-types cellulaires dans l’ovaire est ce qui lui permet de fonctionner à la fois comme organe endocrinien et reproducteur.
Cet article présente un protocole pour l’identification et la purification des cellules granulosa, thèques, stromales, endothéliales et hématopoïétiques des follicules antraux. Nous avons utilisé ce protocole pour isoler ces cellules ovariennes et les analyser en utilisant le séquençage unicellulaire, suivi d’une coloration spécifique dans les follicules de différents stades de développement. Le protocole fournit une méthodologie simple qui est reproductible et permettra l’analyse à haute résolution de la physiologie et de la pathologie de l’ovaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une meilleure résolution de la diversité cellulaire dans les follicules ovariens est cliniquement importante pour plusieurs raisons. Lors de l’application du protocole ci-dessus à l’isolement des sous-types phénotypiques uniques qui résident dans les follicules de stade antral, plusieurs facteurs doivent être pris en compte. Premièrement, la santé et la viabilité du tissu ovarien à partir duquel le follicule antral est dérivé sont essentielles pour déterminer la qualité des cellules et le succès des ap…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le Queenie Victorina Neri Research Scholar Award (D.J.) et le Hung-Ching Liu Research Scholar Award (L.M.). N.L.G est soutenu par la subvention de formation postdoctorale NYSTEM Stem Cell and Regenerative Medicine.
Materials
| Chemicals, reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Anti-Anti |
| Antifade Mountant solution | Thermo Fisher Scientific | P36930 | ProLong Gold |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C 2674 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dispase II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D 2650 | Dimethyl sulfoxide |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Enzyme Cell Detachment Medium | Thermo Fisher Scientific | 00-4555-56 | Accutase |
| Fetal Bovine Serum, heat-inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10438026 | |
| Hanks′ Balanced Salt solution | Thermo Fisher Scientific | 14175079 | no calcium, no magnesium, no phenol red |
| Leibovitz’s L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Normal Saline | Quality Biological | 114-055-101 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S 1888 | |
| Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter) | |||
| – 69.64 mL of Leibovitz's L-15 | |||
| – 17.66 mL of fetal bovine serum | |||
| – 3.42 g of sucrose | |||
| – 10.65 mL of DMSO | |||
| – 1 mL of antibiotic-antimycotic | |||
| Lab Plasticware and Supplies | |||
| 6-well Clear Flat Bottom Not Treated | Corning | 351146 | Falcon |
| Cell Strainer 100 µm | Fisher scientific | 352360 | Corning, Falcon |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 377267 | CryoTube 1.8 mL |
| Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm | Millipore Sigma | CLS430599 | 60EA |
| Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL | Fisher scientific | 352235 | Corning, Falcon |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 µm | Corning | 431154 | |
| Antibodies | |||
| ANPEP | BioLegend | 301703 | |
| CD34 | R&D Systems | FAB7227A | |
| CD45 | BioLegend | 304019 | |
| CD55 | BioLegend | 311306 | |
| CD 99 | BioLegend | 371308 | |
| PVRL | BioLegend | 340404 | |
| Surgical tools | |||
| long forceps (~150 mm length) | Fisherbrand | 12-000-128 | Fisher Scientific |
| medium forceps (~110 mm length) | Fisherbrand | 12-000-157 | Fisher Scientific |
| number 21 scalpel | Andwin Scientific | EF7281H | Fisher Scientific |
| number 11 scalpel | Andwin Scientific | FH/CX7281A | Fisher Scientific |
| sharp fine curved scissors | Roboz Surgical | RS-5881 | |
| Instruments | |||
| FACSJazz Flourescence activated cell sorter | BD | ||
| LSM 710 META Confocal microscope | Zeiss |
Referências
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