Aqui, apresentamos protocolos para a identificação e purificação de células ovarianas de folículos antrais. Elaboramos métodos de processamento de ovários inteiros para a criopreservação de tiras corticais e também colhemos de folículos antrais intactos que são tratados enzimaticamente para liberar vários tipos de células residentes de folículos, incluindo células granulosas, tecais, endoteliais, hematopoiéticas e estromais.
A ativação, crescimento, desenvolvimento e maturação dos ovócitos é um processo complexo que é coordenado não apenas entre vários tipos celulares do ovário, mas também através de múltiplos pontos de controle dentro do circuito hipotálamo/hipófise/ovariano. Dentro do ovário, vários tipos de células especializadas crescem em estreita associação com o ovócito dentro dos folículos ovarianos. A biologia dessas células tem sido bem descrita nos estágios mais avançados, quando são facilmente recuperadas como subprodutos de tratamentos de reprodução assistida. No entanto, a análise aprofundada de pequenos folículos antrais isolados diretamente do ovário não é comumente realizada devido à escassez de tecido ovariano humano e ao acesso limitado ao ovário em pacientes submetidas a tratamentos de reprodução assistida.
Estes métodos de processamento de ovários inteiros para a criopreservação de tiras corticais com a identificação/isolamento concomitante de células residentes nos ovários permitem a análise de alta resolução dos estágios iniciais do desenvolvimento dos folículos antrais. Demonstramos protocolos para isolar tipos celulares discretos através do tratamento enzimaticamente dos folículos antrais e separação das células granulosas, tecais, endoteliais, hematopoéticas e estromais. O isolamento de células dos folículos antrais em vários tamanhos e estágios de desenvolvimento permite a análise abrangente dos mecanismos celulares e moleculares que conduzem o crescimento dos folículos e a fisiologia ovariana e fornece uma fonte de células viáveis que podem ser cultivadas in vitro para recapitular o microambiente folicular.
Os principais elementos funcionais do ovário humano são os folículos, que governam o crescimento e desenvolvimento dos ovócitos. Protocolos para o isolamento de células foliculares estão bem estabelecidos no contexto da fertilização in vitro , mas são apropriados apenas para a coleta de células de folículos luteinizados no ponto de recuperação oocitária1. Desenvolvemos um protocolo que permite o isolamento de populações celulares discretas de folículos antrais em diferentes estágios de desenvolvimento que surgem de ovários nativos ou tecido ovariano xenotransplantado2. Embora haja consenso de que as contribuições das células residentes nos folículos para o cultivo do ovócito são de grande importância, poucos estudos identificaram e extraíram prospectivamente os subtipos fenotípicos únicos presentes nos folículos em estágio antral. Uma compreensão mais profunda da hierarquia de diferenciação e transdução de sinal entre células especializadas durante os diferentes estágios de desenvolvimento poderia ampliar nossa compreensão da fisiologia ovariana sob condições homeostáticas e patológicas. Além disso, a discriminação de subtipos celulares discretos e suas contribuições moleculares para o crescimento/maturação dos folículos podem fornecer um meio de gerar substitutos ex vivo que reconstroem a função ovariana para promover a maturação oocitária e/ou tratar a disfunção endócrina.
Cada tipo de célula única dentro do ovário contribui para a função complexa do folículo, que funciona efetivamente como um mini-órgão discreto para promover o crescimento e a maturação do ovócito que contém. O ovócito, peça central do folículo, é diretamente envolvido por uma camada contínua de células da granulosa (GCs), com as células da teca (CTs) formando uma camada secundária de células que se combinam com o ovócito e os GCs para compor a unidade folicular. Embora classificados em dois grupos, os GCs e CTs contêm vários subtipos. Os GCs são classificados de acordo com sua posição dentro do folículo; Os GCs que circundam o ovócito versus aqueles adjacentes à membrana basal são designados como GCs oóforos e murais, respectivamente, e esses subtipos exibem assinaturas transcriptômicas únicas. Os CTs têm vários subtipos que funcionam para fornecer suporte esteroidogênico, metabólico e estrutural. Células endoteliais, perivasculares e imunes desempenham um papel central na manutenção da fisiologia ovariana normal. O estroma ovariano serve não apenas como substrato para o crescimento dos folículos, mas também provavelmente fornece uma fonte de progenitores que dão origem aos CTs. Este complexo multicamadas de subtipos celulares dentro do ovário é o que permite sua função como um órgão endócrino e reprodutivo.
Este trabalho apresenta um protocolo para identificação e purificação de células granulosas, tecais, estromais, endoteliais e hematopoéticas de folículos antrais. Utilizamos este protocolo para isolar essas células ovarianas e analisá-las usando sequenciamento unicelular, seguido de coloração específica em folículos de diferentes estágios de desenvolvimento. O protocolo fornece uma metodologia simples que é replicável e permitirá a análise de alta resolução da fisiologia e patologia do ovário.
A melhor resolução da diversidade celular dentro dos folículos ovarianos é clinicamente importante por várias razões. Na aplicação do protocolo acima para o isolamento dos subtipos fenotípicos únicos que residem nos folículos em estágio antral, vários fatores devem ser considerados. Em primeiro lugar, a saúde e a viabilidade do tecido ovariano do qual o folículo antral é derivado é fundamental para determinar a qualidade das células e o sucesso das aplicações a jusante. Isso pode ser otimizado minimiz…
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem o apoio do Queenie Victorina Neri Research Scholar Award (D.J.) e do Hung-Ching Liu Research Scholar Award (L.M.). O N.L.G é apoiado pela bolsa de treinamento de pós-doutorado em Células-Tronco e Medicina Regenerativa da NYSTEM.
Chemicals, reagents | |||
Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Anti-Anti |
Antifade Mountant solution | Thermo Fisher Scientific | P36930 | ProLong Gold |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C 2674 | |
DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
Dispase II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
DMSO | Millipore Sigma | D 2650 | Dimethyl sulfoxide |
DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
Enzyme Cell Detachment Medium | Thermo Fisher Scientific | 00-4555-56 | Accutase |
Fetal Bovine Serum, heat-inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10438026 | |
Hanks′ Balanced Salt solution | Thermo Fisher Scientific | 14175079 | no calcium, no magnesium, no phenol red |
Leibovitz’s L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
Normal Saline | Quality Biological | 114-055-101 | |
Sucrose | Millipore Sigma | S 1888 | |
Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter) | |||
– 69.64 mL of Leibovitz's L-15 | |||
– 17.66 mL of fetal bovine serum | |||
– 3.42 g of sucrose | |||
– 10.65 mL of DMSO | |||
– 1 mL of antibiotic-antimycotic | |||
Lab Plasticware and Supplies | |||
6-well Clear Flat Bottom Not Treated | Corning | 351146 | Falcon |
Cell Strainer 100 µm | Fisher scientific | 352360 | Corning, Falcon |
Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 377267 | CryoTube 1.8 mL |
Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm | Millipore Sigma | CLS430599 | 60EA |
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL | Fisher scientific | 352235 | Corning, Falcon |
Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 µm | Corning | 431154 | |
Antibodies | |||
ANPEP | BioLegend | 301703 | |
CD34 | R&D Systems | FAB7227A | |
CD45 | BioLegend | 304019 | |
CD55 | BioLegend | 311306 | |
CD 99 | BioLegend | 371308 | |
PVRL | BioLegend | 340404 | |
Surgical tools | |||
long forceps (~150 mm length) | Fisherbrand | 12-000-128 | Fisher Scientific |
medium forceps (~110 mm length) | Fisherbrand | 12-000-157 | Fisher Scientific |
number 21 scalpel | Andwin Scientific | EF7281H | Fisher Scientific |
number 11 scalpel | Andwin Scientific | FH/CX7281A | Fisher Scientific |
sharp fine curved scissors | Roboz Surgical | RS-5881 | |
Instruments | |||
FACSJazz Flourescence activated cell sorter | BD | ||
LSM 710 META Confocal microscope | Zeiss |