Extraktion, Markierung und Reinigung von linienspezifischen Zellen aus humanen Antralfollikeln
Summary
Hier stellen wir Protokolle für die Identifizierung und Reinigung von Ovarialzellen aus Antralfollikeln vor. Wir erarbeiten Methoden zur Verarbeitung ganzer Eierstöcke für die Kryokonservierung von kortikalen Streifen bei gleichzeitiger Entnahme intakter Antralfollikel, die enzymatisch behandelt werden, um mehrere follikelresidente Zelltypen freizusetzen, darunter Granulosa-, Theka-, Endothel-, hämatopoetische und Stromazellen.
Abstract
Die Aktivierung, das Wachstum, die Entwicklung und die Reifung von Eizellen ist ein komplexer Prozess, der nicht nur zwischen mehreren Zelltypen des Eierstocks, sondern auch über mehrere Kontrollpunkte innerhalb des Hypothalamus-/Hypophysen-/Eierstockkreislaufs koordiniert wird. Innerhalb des Eierstocks wachsen mehrere spezialisierte Zelltypen in enger Verbindung mit der Eizelle innerhalb der Eierstockfollikel. Die Biologie dieser Zellen ist in den späteren Stadien gut beschrieben, wenn sie leicht als Nebenprodukte von assistierten Reproduktionsbehandlungen wiederhergestellt werden können. Die eingehende Analyse kleiner Antralfollikel, die direkt aus dem Eierstock isoliert wurden, wird jedoch aufgrund des Mangels an menschlichem Eierstockgewebe und des eingeschränkten Zugangs zum Eierstock bei Patientinnen, die sich einer assistierten Reproduktionsbehandlung unterziehen, in der Regel nicht durchgeführt.
Diese Methoden zur Aufbereitung ganzer Eierstöcke für die Kryokonservierung kortikaler Streifen bei gleichzeitiger Identifizierung/Isolierung von Ovarialzellen ermöglichen die hochauflösende Analyse der frühen Stadien der Antralfollikelentwicklung. Wir demonstrieren Protokolle zur Isolierung diskreter Zelltypen durch enzymatische Behandlung von Antralfollikeln und Trennung der Granulosa-, Theka-, Endothel-, hämatopoetischen und Stromazellen. Die Isolierung von Zellen aus den Antralfollikeln in verschiedenen Größen und Entwicklungsstadien ermöglicht die umfassende Analyse der zellulären und molekularen Mechanismen, die das Follikelwachstum und die Physiologie der Eierstöcke antreiben, und bietet eine Quelle lebensfähiger Zellen, die in vitro kultiviert werden können, um die Mikroumgebung der Follikel zu rekapitulieren.
Introduction
Die wichtigsten funktionellen Elemente des menschlichen Eierstocks sind die Follikel, die das Wachstum und die Entwicklung der Eizellen steuern. Protokolle für die Isolierung von Follikelzellen sind im Zusammenhang mit der In-vitro-Fertilisation gut etabliert, aber diese sind nur für die Entnahme von Zellen aus luteinisierten Follikeln zum Zeitpunkt der Eizellentnahme geeignet1. Wir haben ein Protokoll entwickelt, das die Isolierung diskreter Zellpopulationen aus Antralfollikeln in verschiedenen Entwicklungsstadien ermöglicht, die aus nativen Eierstöcken oder xenotransplantiertem Ovarialgewebe entstehen2. Obwohl Konsens darüber besteht, dass der Beitrag follikelresidenter Zellen zur Kultivierung der Eizelle von großer Bedeutung ist, haben nur wenige Studien prospektiv die einzigartigen phänotypischen Subtypen identifiziert und extrahiert, die in Follikeln im Antralstadium vorhanden sind. Ein tieferes Verständnis der Differenzierungshierarchie und der Signaltransduktion zwischen spezialisierten Zellen während der verschiedenen Entwicklungsstadien könnte unser Verständnis der Physiologie der Eierstöcke unter homöostatischen und pathologischen Bedingungen erweitern. Darüber hinaus kann die Unterscheidung diskreter zellulärer Subtypen und ihrer molekularen Beiträge zum Follikelwachstum/zur Follikelreifung eine Möglichkeit bieten, ex vivo Surrogate zu erzeugen, die die Ovarialfunktion rekonstruieren, um die Eizellreifung zu fördern und/oder endokrine Dysfunktionen zu behandeln.
Jeder einzelne Zelltyp innerhalb des Eierstocks trägt zur komplexen Funktion des Follikels bei, der effektiv als eigenständiges Miniorgan fungiert, um das Wachstum und die Reifung der darin enthaltenen Eizelle zu fördern. Die Eizelle, das Herzstück des Follikels, ist direkt von einer kontinuierlichen Schicht von Granulosazellen (GCs) umgeben, wobei die Thekazellen (TCs) eine sekundäre Zellschicht bilden, die sich mit der Eizelle und den GCs verbinden, um die follikuläre Einheit zu bilden. Obwohl sie in zwei Gruppen eingeteilt werden, enthalten GCs und TCs zahlreiche Subtypen. GCs werden nach ihrer Position innerhalb des Follikels klassifiziert. GCs, die die Eizelle umgeben, im Gegensatz zu denen, die an die Basalmembran angrenzen, werden als oophore bzw. murale GCs bezeichnet, und diese Subtypen weisen einzigartige transkriptomische Signaturen auf. TCs haben zahlreiche Subtypen, die steroidogene, metabolische und strukturelle Unterstützung bieten. Endothel-, Perivaskulär- und Immunzellen spielen eine zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung einer normalen Physiologie der Eierstöcke. Das Ovarialstroma dient nicht nur als Substrat für das Follikelwachstum, sondern stellt wahrscheinlich auch eine Quelle für Vorläuferzellen dar, aus denen TCs entstehen. Dieser vielschichtige Komplex von zellulären Subtypen im Eierstock ermöglicht seine Funktion sowohl als endokrines als auch als Fortpflanzungsorgan.
In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Identifizierung und Reinigung von Granulosa-, Theka-, Stroma-, Endothel- und hämatopoetischen Zellen aus Antralfollikeln vorgestellt. Wir haben dieses Protokoll verwendet, um diese Eierstockzellen zu isolieren und sie mittels Einzelzellsequenzierung zu analysieren, gefolgt von einer spezifischen Färbung in Follikeln verschiedener Entwicklungsstadien. Das Protokoll bietet eine unkomplizierte Methodik, die replizierbar ist und die hochauflösende Analyse sowohl der Physiologie als auch der Pathologie des Eierstocks ermöglicht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine bessere Auflösung der zellulären Vielfalt innerhalb der Eierstockfollikel ist aus mehreren Gründen klinisch wichtig. Bei der Anwendung des obigen Protokolls auf die Isolierung der einzigartigen phänotypischen Subtypen, die sich in den Follikeln des Antralstadiums befinden, sollten mehrere Faktoren berücksichtigt werden. Erstens ist die Gesundheit und Lebensfähigkeit des Eierstockgewebes, aus dem der Antralfollikel gewonnen wird, entscheidend für die Qualität der Zellen und den Erfolg nachgelagerter Anwendung…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken für die Unterstützung durch den Queenie Victorina Neri Research Scholar Award (D.J.) und den Hung-Ching Liu Research Scholar Award (L.M.). N.L.G wird durch das NYSTEM Stem Cell and Regenerative Medicine Postdoctoral Training Grant unterstützt.
Materials
| Chemicals, reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Anti-Anti |
| Antifade Mountant solution | Thermo Fisher Scientific | P36930 | ProLong Gold |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C 2674 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dispase II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D 2650 | Dimethyl sulfoxide |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Enzyme Cell Detachment Medium | Thermo Fisher Scientific | 00-4555-56 | Accutase |
| Fetal Bovine Serum, heat-inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10438026 | |
| Hanks′ Balanced Salt solution | Thermo Fisher Scientific | 14175079 | no calcium, no magnesium, no phenol red |
| Leibovitz’s L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Normal Saline | Quality Biological | 114-055-101 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S 1888 | |
| Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter) | |||
| – 69.64 mL of Leibovitz's L-15 | |||
| – 17.66 mL of fetal bovine serum | |||
| – 3.42 g of sucrose | |||
| – 10.65 mL of DMSO | |||
| – 1 mL of antibiotic-antimycotic | |||
| Lab Plasticware and Supplies | |||
| 6-well Clear Flat Bottom Not Treated | Corning | 351146 | Falcon |
| Cell Strainer 100 µm | Fisher scientific | 352360 | Corning, Falcon |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 377267 | CryoTube 1.8 mL |
| Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm | Millipore Sigma | CLS430599 | 60EA |
| Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL | Fisher scientific | 352235 | Corning, Falcon |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 µm | Corning | 431154 | |
| Antibodies | |||
| ANPEP | BioLegend | 301703 | |
| CD34 | R&D Systems | FAB7227A | |
| CD45 | BioLegend | 304019 | |
| CD55 | BioLegend | 311306 | |
| CD 99 | BioLegend | 371308 | |
| PVRL | BioLegend | 340404 | |
| Surgical tools | |||
| long forceps (~150 mm length) | Fisherbrand | 12-000-128 | Fisher Scientific |
| medium forceps (~110 mm length) | Fisherbrand | 12-000-157 | Fisher Scientific |
| number 21 scalpel | Andwin Scientific | EF7281H | Fisher Scientific |
| number 11 scalpel | Andwin Scientific | FH/CX7281A | Fisher Scientific |
| sharp fine curved scissors | Roboz Surgical | RS-5881 | |
| Instruments | |||
| FACSJazz Flourescence activated cell sorter | BD | ||
| LSM 710 META Confocal microscope | Zeiss |
Referências
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- Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).
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