मानव एंट्रल फॉलिकल्स से वंश-विशिष्ट कोशिकाओं का निष्कर्षण, लेबलिंग और शुद्धिकरण
Summary
यहां, हम एंट्रल रोम से डिम्बग्रंथि कोशिकाओं की पहचान और शुद्धि के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हम कॉर्टिकल स्ट्रिप्स के क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए पूरे अंडाशय को संसाधित करने के तरीकों पर विस्तार से बताते हैं, जबकि बरकरार एंट्रल फॉलिकल्स की कटाई भी करते हैं जिन्हें ग्रैनुलोसा, थेका, एंडोथेलियल, हेमटोपोइएटिक और स्ट्रोमल कोशिकाओं सहित कई कूप निवासी कोशिका प्रकारों को मुक्त करने के लिए एंजाइमेटिक रूप से इलाज किया जाता है।
Abstract
अंडाणुओं की सक्रियता, वृद्धि, विकास और परिपक्वता एक जटिल प्रक्रिया है जो न केवल अंडाशय के कई सेल प्रकारों के बीच समन्वित होती है, बल्कि हाइपोथैलेमिक / पिट्यूटरी / डिम्बग्रंथि सर्किट के भीतर नियंत्रण के कई बिंदुओं पर भी होती है। अंडाशय के भीतर, डिम्बग्रंथि के रोम के भीतर अंडाणु के साथ घनिष्ठ संबंध में कई विशेष कोशिका प्रकार बढ़ते हैं। इन कोशिकाओं के जीव विज्ञान को बाद के चरणों में अच्छी तरह से वर्णित किया गया है, जब वे आसानी से सहायक प्रजनन उपचार के उपोत्पाद के रूप में पुनर्प्राप्त किए जाते हैं। हालांकि, अंडाशय से सीधे अलग किए गए छोटे एंट्रल रोम का गहन विश्लेषण आमतौर पर मानव डिम्बग्रंथि के ऊतकों की कमी और सहायक प्रजनन उपचार से गुजरने वाले रोगियों में अंडाशय तक सीमित पहुंच के कारण नहीं किया जाता है।
अंडाशय निवासी कोशिकाओं की समवर्ती पहचान / अलगाव के साथ कॉर्टिकल स्ट्रिप्स के क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए पूरे अंडाशय को संसाधित करने के ये तरीके एंट्रल कूप विकास के शुरुआती चरणों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन विश्लेषण को सक्षम करते हैं। हम एंट्रल फॉलिकल्स को एंजाइमेटिक रूप से इलाज करके और ग्रैनुलोसा, थेका, एंडोथेलियल, हेमटोपोइएटिक और स्ट्रोमल कोशिकाओं को अलग करके असतत सेल प्रकारों को अलग करने के लिए प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं। विभिन्न आकारों और विकास के चरणों में एंट्रल फॉलिकल्स से कोशिकाओं का अलगाव सेलुलर और आणविक तंत्र के व्यापक विश्लेषण को सक्षम बनाता है जो कूप विकास और डिम्बग्रंथि शरीर विज्ञान को चलाता है और व्यवहार्य कोशिकाओं का एक स्रोत प्रदान करता है जिसे कूप माइक्रोएन्वायरमेंट को पुन: उत्पन्न करने के लिए विट्रो में सुसंस्कृत किया जा सकता है।
Introduction
मानव अंडाशय के प्राथमिक कार्यात्मक तत्व रोम हैं, जो अंडाणुओं के विकास और विकास को नियंत्रित करते हैं। इन विट्रो निषेचन के संदर्भ में कूपिक कोशिकाओं के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल अच्छी तरह से स्थापित किए गए हैं, लेकिन ये केवल अंडाणु पुनर्प्राप्ति1 के बिंदु पर ल्यूटिनाइज्ड रोम से कोशिकाओं के संग्रह के लिए उपयुक्त हैं। हमने एक प्रोटोकॉल विकसित किया है जो विभिन्न विकास चरणों में एंट्रल रोम से असतत कोशिका आबादी के अलगाव को सक्षम बनाता है जो देशी अंडाशय या क्सीनट्रांसप्लांट्ड डिम्बग्रंथि ऊतक2 से उत्पन्न होते हैं। यद्यपि इस बात पर आम सहमति है कि अंडाणु की खेती में कूप निवासी कोशिकाओं का योगदान अत्यधिक महत्वपूर्ण है, कुछ अध्ययनों ने एंट्रल-स्टेज फॉलिकल्स में मौजूद अद्वितीय फेनोटाइपिक उपप्रकारों को भावी प्रभाव से पहचाना और निकाला है। विभिन्न विकास चरणों के दौरान विशेष कोशिकाओं के बीच भेदभाव पदानुक्रम और सिग्नल ट्रांसडक्शन की गहरी समझ होमियोस्टैटिक और पैथोलॉजिकल स्थितियों के तहत डिम्बग्रंथि शरीर विज्ञान की हमारी समझ को व्यापक बना सकती है। इसके अलावा, असतत सेलुलर उपप्रकारों का भेदभाव और कूप विकास / परिपक्वता में उनके आणविक योगदान एक्स विवो सरोगेट्स उत्पन्न करने का एक साधन प्रदान कर सकते हैं जो अंडाणु परिपक्वता को बढ़ावा देने और / या अंतःस्रावी शिथिलता का इलाज करने के लिए डिम्बग्रंथि समारोह का पुनर्निर्माण करते हैं।
अंडाशय के भीतर प्रत्येक अद्वितीय कोशिका प्रकार कूप के जटिल कार्य में योगदान देता है, जो प्रभावी रूप से अंडाणु के विकास और परिपक्वता को बढ़ावा देने के लिए एक असतत मिनी-अंग के रूप में कार्य करता है। कूप का केंद्र बिंदु, अंडाणु सीधे ग्रैनुलोसा कोशिकाओं (जीसी) की एक निरंतर परत से घिरा होता है, जिसमें थेका कोशिकाएं (टीसी) कोशिकाओं की एक द्वितीयक परत बनाती हैं जो कूपिक इकाई की रचना करने के लिए अंडाणु और जीसी के साथ गठबंधन करती हैं। हालांकि दो समूहों में वर्गीकृत, जीसी और टीसी में कई उपप्रकार होते हैं। जीसी को कूप के भीतर उनकी स्थिति के अनुसार वर्गीकृत किया जाता है; जीसी जो अंडाणु को घेरते हैं बनाम जो तहखाने की झिल्ली से सटे होते हैं, उन्हें क्रमशः ओफोरस और भित्ति जीसी के रूप में नामित किया जाता है, और ये उपप्रकार अद्वितीय ट्रांसक्रिप्टोमिक हस्ताक्षर प्रदर्शित करते हैं। टीसी में कई उपप्रकार हैं जो स्टेरॉयडजेनिक, चयापचय और संरचनात्मक सहायता प्रदान करने के लिए कार्य करते हैं। एंडोथेलियल, पेरिवास्कुलर और प्रतिरक्षा कोशिकाएं सामान्य डिम्बग्रंथि शरीर विज्ञान को बनाए रखने में एक केंद्रीय भूमिका निभाती हैं। डिम्बग्रंथि स्ट्रोमा न केवल कूप विकास के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है, बल्कि संभवतः पूर्वजों का एक स्रोत भी प्रदान करता है जो टीसी को जन्म देते हैं। अंडाशय के भीतर सेलुलर उपप्रकारों का यह बहुस्तरीय परिसर है जो अंतःस्रावी और प्रजनन अंग दोनों के रूप में इसके कार्य को सक्षम बनाता है।
यह पेपर एंट्रल रोम से ग्रैनुलोसा, थेका, स्ट्रोमल, एंडोथेलियल और हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं की पहचान और शुद्धिकरण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। हमने इस प्रोटोकॉल का उपयोग इन डिम्बग्रंथि कोशिकाओं को अलग करने और एकल-कोशिका अनुक्रमण का उपयोग करके उनका विश्लेषण करने के लिए किया है, इसके बाद विभिन्न विकास चरणों के रोम में विशिष्ट धुंधलापन है। प्रोटोकॉल एक सरल पद्धति प्रदान करता है जो प्रतिकृति है और अंडाशय के शरीर विज्ञान और विकृति दोनों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन विश्लेषण को सक्षम करेगा।
Protocol
Representative Results
Discussion
डिम्बग्रंथि के रोम के भीतर सेलुलर विविधता का बेहतर समाधान कई कारणों से चिकित्सकीय रूप से महत्वपूर्ण है। उपरोक्त प्रोटोकॉल को अद्वितीय फेनोटाइपिक उपप्रकारों के अलगाव के लिए लागू करने में जो एंट्रल स?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक क्वीनी विक्टोरिया नेरी रिसर्च स्कॉलर अवार्ड (डीजे) और हंग-चिंग लियू रिसर्च स्कॉलर अवार्ड (एलएम) से समर्थन स्वीकार करते हैं। एनएलजी को एनवाईएसटीईएम स्टेम सेल और पुनर्योजी चिकित्सा पोस्टडॉक्टरल प्रशिक्षण अनुदान द्वारा समर्थित किया गया है।
Materials
| Chemicals, reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Anti-Anti |
| Antifade Mountant solution | Thermo Fisher Scientific | P36930 | ProLong Gold |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C 2674 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dispase II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D 2650 | Dimethyl sulfoxide |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Enzyme Cell Detachment Medium | Thermo Fisher Scientific | 00-4555-56 | Accutase |
| Fetal Bovine Serum, heat-inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10438026 | |
| Hanks′ Balanced Salt solution | Thermo Fisher Scientific | 14175079 | no calcium, no magnesium, no phenol red |
| Leibovitz’s L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Normal Saline | Quality Biological | 114-055-101 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S 1888 | |
| Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter) | |||
| – 69.64 mL of Leibovitz's L-15 | |||
| – 17.66 mL of fetal bovine serum | |||
| – 3.42 g of sucrose | |||
| – 10.65 mL of DMSO | |||
| – 1 mL of antibiotic-antimycotic | |||
| Lab Plasticware and Supplies | |||
| 6-well Clear Flat Bottom Not Treated | Corning | 351146 | Falcon |
| Cell Strainer 100 µm | Fisher scientific | 352360 | Corning, Falcon |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 377267 | CryoTube 1.8 mL |
| Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm | Millipore Sigma | CLS430599 | 60EA |
| Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL | Fisher scientific | 352235 | Corning, Falcon |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 µm | Corning | 431154 | |
| Antibodies | |||
| ANPEP | BioLegend | 301703 | |
| CD34 | R&D Systems | FAB7227A | |
| CD45 | BioLegend | 304019 | |
| CD55 | BioLegend | 311306 | |
| CD 99 | BioLegend | 371308 | |
| PVRL | BioLegend | 340404 | |
| Surgical tools | |||
| long forceps (~150 mm length) | Fisherbrand | 12-000-128 | Fisher Scientific |
| medium forceps (~110 mm length) | Fisherbrand | 12-000-157 | Fisher Scientific |
| number 21 scalpel | Andwin Scientific | EF7281H | Fisher Scientific |
| number 11 scalpel | Andwin Scientific | FH/CX7281A | Fisher Scientific |
| sharp fine curved scissors | Roboz Surgical | RS-5881 | |
| Instruments | |||
| FACSJazz Flourescence activated cell sorter | BD | ||
| LSM 710 META Confocal microscope | Zeiss |
Referências
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