Summary
Il protocollo descrive una lieve lesione cerebrale traumatica in un modello murino. In particolare, viene spiegato un protocollo passo-passo per indurre un lieve trauma cranico chiuso della linea mediana e la caratterizzazione del modello animale.
Abstract
Modelli animali altamente riproducibili di lesioni cerebrali traumatiche (TBI), con patologie ben definite, sono necessari per testare gli interventi terapeutici e comprendere i meccanismi di come un TBI altera la funzione cerebrale. La disponibilità di più modelli animali di TBI è necessaria per modellare i diversi aspetti e gravità del TBI osservati nelle persone. Questo manoscritto descrive l'uso di un trauma cranico chiuso della linea mediana (CHI) per sviluppare un modello murino di trauma cranico lieve. Il modello è considerato lieve perché non produce lesioni cerebrali strutturali basate sul neuroimaging o sulla perdita neuronale grossolana. Tuttavia, un singolo impatto crea abbastanza patologia che il deterioramento cognitivo è misurabile almeno 1 mese dopo l'infortunio. Un protocollo passo-passo per indurre un CHI nei topi utilizzando un impattatore elettromagnetico guidato stereotassicamente è definito nel documento. I vantaggi del modello CHI della linea mediana lieve includono la riproducibilità dei cambiamenti indotti da lesioni con bassa mortalità. Il modello è stato caratterizzato temporalmente fino a 1 anno dopo la lesione per cambiamenti neuroimaging, neurochimici, neuropatologici e comportamentali. Il modello è complementare ai modelli a cranio aperto di impatto corticale controllato utilizzando lo stesso dispositivo di impatto. Pertanto, i laboratori possono modellare sia TBI diffusi lievi che TBI focali da moderati a gravi con lo stesso impattatore.
Introduction
La lesione cerebrale traumatica (TBI) è causata da una forza esterna sul cervello, spesso associata a cadute, lesioni sportive, violenza fisica o incidenti stradali. Nel 2014, i Centers for Disease Control and Prevention hanno stabilito che 2,53 milioni di americani hanno visitato il pronto soccorso per cercare assistenza medica per incidenti correlati al TBI1. Poiché il TBI lieve (mTBI) rappresenta la maggior parte dei casi di TBI, negli ultimi decenni sono stati adottati più modelli di mTBI, che includono caduta di peso, trauma cranico chiuso guidato da pistone e impatto corticale controllato, lesione rotazionale, lieve lesione da percussione fluida e modelli di lesioni da esplosione 2,3. L'eterogeneità dei modelli mTBI è utile per affrontare le diverse caratteristiche associate all'mTBI osservate nelle persone e per aiutare a valutare i meccanismi cellulari e molecolari associati alla lesione cerebrale.
Tra i modelli comunemente usati di trauma cranico chiuso, uno dei primi e più utilizzati è il metodo della caduta di peso, in cui un oggetto viene lasciato cadere da un'altezza specifica sulla testa dell'animale (anestetizzato o sveglio)2,4. Nel metodo di caduta del peso, la gravità della lesione dipende da diversi parametri, tra cui craniotomia eseguita o meno, testa fissa o libera, e la distanza e il peso dell'oggetto che cade 2,4. Uno svantaggio di questo modello è l'elevata variabilità nella gravità della lesione e l'alto tasso di mortalità associato alla depressione respiratoria 5,6. Un'alternativa comune è quella di fornire l'impatto utilizzando un dispositivo pneumatico o elettromagnetico, che può essere fatto direttamente sulla dura esposta (impatto corticale controllato: CCI) o sul cranio chiuso (trauma cranico chiuso: CHI). Uno dei punti di forza della lesione guidata dal pistone è la sua elevata riproducibilità e bassa mortalità. Tuttavia, la CCI richiede craniotomia 7,8 e una craniotomia stessa induce infiammazione9. Invece, nel modello CHI, non c'è bisogno di craniotomia. Come già affermato, ogni modello ha delle limitazioni. Uno dei limiti del modello CHI descritto in questo documento è che l'intervento chirurgico viene eseguito utilizzando un telaio stereotassico e la testa dell'animale è immobilizzata. Mentre l'immobilizzazione completa della testa assicura la riproducibilità, non tiene conto del movimento dopo l'impatto che potrebbe contribuire alla lesione associata a un mTBI.
Questo protocollo descrive un metodo di base per eseguire un impatto CHI con un dispositivo di impatto elettromagnetico disponibilein commercio 10 in un mouse. Questo protocollo dettaglia i parametri esatti coinvolti per ottenere una lesione altamente riproducibile. In particolare, lo sperimentatore ha un controllo preciso sui parametri (profondità della lesione, tempo di permanenza e velocità di impatto) per definire con precisione la gravità della lesione. Come descritto, questo modello CHI produce una lesione che si traduce in patologia bilaterale, sia diffusa che microscopica (cioè attivazione cronica della glia, danno assonale e vascolare) e fenotipi comportamentali 11,12,13,14,15. Inoltre, il modello descritto è considerato lieve in quanto non induce lesioni cerebrali strutturali basate sulla risonanza magnetica o lesioni macroscopiche sulla patologia anche 1 anno dopo la lesione16,17.
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Protocol
Gli esperimenti eseguiti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Kentucky, e durante lo studio sono state seguite sia le linee guida ARRIVE che la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.
1. Configurazione chirurgica
NOTA: I topi sono alloggiati in gruppi di 4-5 / gabbia, l'umidità nella stanza dell'alloggiamento è mantenuta al 43% -47% e la temperatura è mantenuta a 22-23 ° C. Ai topi viene dato accesso ad libitum a cibo e acqua ed esposti a un ciclo luce/buio di 12 ore / 12 ore (7:00/19:00).
- Utilizzare un'area chirurgica designata, come un cappuccio o una sala operatoria dedicata, per eseguire la chirurgia animale.
- Assicurarsi che l'area chirurgica includa una piastra riscaldante, un telaio stereotassico dotato di un impattatore elettromagnetico e una maschera per anestesia progettata per somministrare gas isoflurano (vedere Figura 1A).
- Assicurarsi che il chirurgo o il personale coinvolto nell'intervento chirurgico indossino un camice pulito, una maschera facciale, guanti e un cappuccio chirurgico.
- Utilizzare strumenti chirurgici sterili, applicatori sterili con punta di cotone e tamponi di garza. Utilizzare uno sterilizzatore a perline calde per sterilizzare gli strumenti tra i topi durante il giorno dell'intervento.
- Utilizzare una camera di induzione per anestesia per preparare il topo per l'intervento chirurgico in un'area pre-operatoria.
- Utilizzare cuscinetti riscaldanti per mantenere la temperatura dell'animale, pulire le gabbie post-operatorie per il mouse e timer per registrare il riflesso di raddrizzamento del topo dopo l'intervento chirurgico.
2. Procedura pre-operatoria
- Preparare l'apparato di supporto della testa (vedi figura 1B).
- Rimuovere la cresta terminale arrotolata da una lampadina a pipetta in lattice da 1 mL (estremità gonfiabile) (vedere figura 1C).
- Fissare la lampadina al tubo usando il parafilm (vedere Figura 1C).
- Collegare il tubo a una siringa da 10 mL utilizzando un rubinetto. Riempia la siringa con acqua (vedere Figura 1C).
NOTA: La lampadina in lattice da 1 mL verrà posizionata sotto la testa del mouse per spostare la forza d'impatto lontano dalle orecchie. Cerca di rimuovere quanta più aria possibile dalla lampadina prima dell'uso in modo che la lampadina sia riempita principalmente con acqua e non aria.
- Configurazione del dispositivo d'impatto.
- Selezionare la punta della sonda da 5 mm, avvitarla al pistone in basso al centro dell'attuatore (all'interno del cilindro più grande) e serrare delicatamente la sonda senza applicare una forza eccessiva. Stringere nuovamente la punta tra gli impatti (vedere Figura 1B).
- Prima di accendere il dispositivo di ricostruzione, assicurarsi che l'interruttore Estend/Retract sia posizionato in posizione Center Off. Quindi, collegare il cavo sull'attuatore al jack sul pannello anteriore della scatola di controllo del dispositivo d'urto e il cavo del sensore al jack sul pannello anteriore. Quindi, accendere l'interruttore di alimentazione sul pannello posteriore (vedere la Figura 1D).
NOTA: l'interruttore a levetta Estend/Retract deve rimanere in posizione centrale Off quando non è in uso. - Impostare la velocità d'impatto ruotando la manopola grande sul lato sinistro della scatola di controllo fino a quando sul display appare una velocità d'impatto di 5,0 ± 0,2 m/s (vedere la Figura 1D).
- Impostare il contatore di permanenza su 100 ms ruotando i quadranti fino a quando il dwell non legge 0,01 (vedere la Figura 1D).
NOTA: la permanenza è il tempo di contatto prima che si verifichi la retrazione automatica. - Posizionare l'attuatore del dispositivo d'urto su un impacco di ghiaccio per evitare che il cilindro di plastica si espanda, bloccando il cilindro in posizione, impedendo il movimento del cilindro e l'erogazione di impatti futuri (vedere Figura 1E).
- Preparare il mouse per la chirurgia.
- Ispezionare visivamente il topo prima dell'intervento chirurgico ed eliminare il topo dallo studio se si osserva una delle seguenti condizioni: cattive condizioni del mantello, letargia o scarso peso (<20 g) per un topo di 4 mesi.
- Anestetizzare il topo con isoflurano al 4% -5% in ossigeno al 100% utilizzando una camera di induzione posta su una piastra riscaldante per 1-2 minuti.
- Rasare la pelliccia dal sito operativo usando un tagliacapelli elettrico.
- Pulire la testa con tamponi sterili per la preparazione all'alcool e applicare un anestetico topico sul cuoio capelluto rasato almeno 15 minuti prima dell'inizio dell'intervento.
- Riportare il topo in una gabbia di contenimento pulita prima dell'intervento. Iniziare l'intervento chirurgico dopo almeno 15 minuti di applicazione topica dell'anestetico (tempo di induzione).
NOTA: Il tempo per l'anestesia potrebbe variare a seconda dell'anestetico utilizzato nella procedura.
- Verificare ancora una volta che la cornice stereotassica, il dispositivo d'urto e il display stereotassico digitale (vedere la Figura 1F) siano pronti per l'uso.
- Riportare il mouse nella camera di induzione dell'isoflurano con isoflurano al 4%-5% in ossigeno al 100% per circa 3 minuti.
- Fissare il mouse nella fase di testa.
3. Procedura chirurgica
- Fissare il mouse nella struttura stereotassica utilizzando barre auricolari coniche in resina acetalica leggera, una barra del morso e una maschera per anestesia del topo (vedere Figura 1G,H). Il gas isoflurano viene erogato al 2%-3% nell'aria ambiente a 100-200 ml/min. Monitorare attentamente la respirazione del mouse per garantire la profondità dell'anestesia e regolare il livello di gas secondo necessità.
- Applicare lubrificante per gli occhi sterile sugli occhi per prevenire l'essiccazione corneale.
- Sterilizzare il cuoio capelluto con tamponi di povidone-iodio e tamponi sterili di alcool tre volte.
- Assicurati che il mouse sia profondamente anestetizzato verificando la mancanza di una risposta al pizzico del piede.
- Praticare un'incisione del cuoio capelluto della linea mediana di circa 1 cm tra gli occhi e il collo usando un bisturi, esponendo il cranio (vedi Figura 1I).
- Lasciare asciugare il cranio per 1-2 minuti.
- Identificare il bregma (il punto di intersezione delle suture coronale e sagittale) e lambda (l'intersezione delle suture sagittali e lambdoidi) (vedi Figura 1J).
NOTA: Un atlante del cervello del topo potrebbe essere utilizzato come riferimento. - Posizionare l'apparato di supporto della testa sotto la testa e gonfiare il bulbo con acqua fino a quando non preme contro il fondo della testa del topo ma non solleva la testa lontano dalla barra del morso.
NOTA: Questo passaggio è essenziale per ridurre possibili problemi all'orecchio dal CHI. Qualsiasi animale con danni all'orecchio dalle barre auricolari, con conseguente rotolamento o sanguinamento, deve essere eliminato dallo studio e sottoposto a eutanasia. - Spostare il dispositivo d'urto in posizione sopra la testa dell'animale.
- Estendere il dispositivo di simulazione posizionando l'interruttore a levetta Estendi /Retrazione (sulla casella di controllo del dispositivo di ricostruzione) su Estendi.
NOTA: assicurarsi di verificare che la punta sia completamente estesa tirando verso il basso la punta. - Allineare il dispositivo d'urto fino a centrarlo sul bregma (vedi Figura 1K).
- Reimpostare le coordinate x e y stereotassiche digitali nel lettore stereotassico su 0 (sul controllo touch screen)
- Allineare la sonda sul luogo dell'impatto spostando la sonda dal bregma alle coordinate target: mediale-laterale = 0,0 mm, antero-posteriore = −1,6 mm.
- Aggancia il sensore di contatto all'orecchio dell'animale.
- Abbassare lentamente la punta della sonda con la sonda estesa fino al primo contatto con la superficie. Fermati al segnale acustico.
- Reimpostare le coordinate z stereotassiche digitali nel lettore stereotassico su 0.
- Ispezionare attentamente se la punta è a filo con il cranio (piani mediale-laterale e anteriore-posteriore).
NOTA: Il posizionamento della punta della sonda è il passo più cruciale di questo processo per prevenire fratture del cranio e danni all'orecchio. - Ritrarre il dispositivo di simulazione posizionando l'interruttore a levetta sulla casella di controllo in posizione Retract. La punta si ritira e non ha più contatto con la testa dell'animale fino al momento dell'impatto.
- Impostare la profondità d'impatto regolando la profondità dorsale-ventrale a -1,2 mm.
NOTA: la profondità dell'impatto influisce sulla gravità della lesione. La profondità deve essere titolata per diverse età, pesi e ceppi di topi alla gravità della lesione desiderata. Potrebbe essere necessario regolare/rititolare la profondità nel tempo per mantenere una gravità costante della lesione. La gravità può essere valutata neuropatologicamente: microglia e astrociti (IHC), e comportamentale: il labirinto d'acqua del braccio radiale e il test di evitamento attivo. - Monitorare attentamente la respirazione del mouse per garantire la profondità dell'anestesia e regolare il livello del gas secondo necessità.
NOTA: Spesso, la percentuale di gas isoflurano deve essere abbassata o spenta per 10-20 s prima dell'impatto. Osserva attentamente che la respirazione acceleri leggermente. Se la respirazione è troppo lenta al momento dell'impatto, l'animale può morire entro i primi 60 secondi dopo l'impatto da apnea. Ciò può essere evitato regolando la profondità dell'anestesia nei secondi precedenti l'impatto. - Indurre l'impatto premendo l'interruttore a levetta destro per l'impatto. La punta della sonda scende alla velocità visualizzata, quindi rimane giù per il tempo di permanenza impostato e si ritrae.
NOTA: i topi fittizi ricevono una manipolazione identica ai topi CHI, ma l'impatto non viene fornito. - Avviare il timer immediatamente dopo l'impatto CHI per registrare i tempi di raddrizzamento (tempo per tornare dalla posizione laterale alla posizione prona) o avviare il timer quando il mouse viene rimosso dal frame stereotassico per i topi fittizi. Il tempo medio del riflesso raddrizzante è di 5-15 min.
NOTA: I tempi del riflesso di raddrizzamento possono variare in base allo sforzo e all'età del mouse. - Valutare i topi per fratture del cranio visibili, emorragie e apnea. Escludere i topi con una frattura del cranio depressa o emorragia visibile dallo studio.
NOTA: Ci sono livelli graduati di fratture del cranio. Gli animali con fratture craniche decompresse, in cui l'osso preme in modo osservabile nel tessuto cerebrale, vengono eutanizzati (CO2 prima e decapitazione usata come metodo secondario). Se la punta del dispositivo d'urto è impostata correttamente, questi tipi di fratture del cranio sono estremamente rari. Se si verifica una frattura del cranio, la presentazione più comune è una piccola goccia di sangue sul cranio e una leggera sgrossatura tattile del cranio, spesso lungo la sutura che collega la punta posteriore dell'osso nasale. Questi topi sono noti come possibile frattura del cranio nei registri, ma non sono normalmente esclusi dallo studio. - Rimuovere l'animale dalla cornice stereotassica.
- Chiudere il cuoio capelluto pinzando la pelle insieme.
NOTA: Suture riassorbibili o non assorbibili potrebbero essere utilizzate per chiudere il cuoio capelluto in alternativa alle graffette. - Applicare un triplo unguento antibiotico con un applicatore sterile con punta di cotone all'incisione chiusa.
- Riportare il mouse in una gabbia di contenimento pulita per il recupero. Metà della gabbia di recupero si trova su una piastra riscaldante (impostazione bassa), fornendo la possibilità di allontanarsi dal calore quando è sveglio e mantenendo la temperatura dell'animale mentre è incosciente (vedi Figura 1L).
NOTA: il mouse è posizionato su un lato nella gabbia di recupero. Per evitare il soffocamento, mettere l'animale in una gabbia di recupero senza lettiera o su un fazzoletto se la lettiera è nella gabbia. - Riportare l'interruttore a levetta Estend/Retract in posizione Center/Off .
NOTA: la corrente continuerà a funzionare se l'interruttore viene lasciato in posizione di estensione o di ritrazione, causando il rigonfiamento del pistone. Il dispositivo di simulazione non sarà quindi funzionante fino a quando il pistone non si raffredda. - Rimuovere il dispositivo di simulazione dal supporto e posizionarlo delicatamente sull'impacco di ghiaccio.
NOTA: Mantenere il dispositivo d'urto su un impacco di ghiaccio aiuta a ridurre il potenziale gonfiore del dispositivo d'urto. - Monitorare l'animale fino a quando non si verifica il riflesso di raddrizzamento e documentare il tempo fino al raddrizzamento (vedere Figura 1M).
NOTA: il riflesso di raddrizzamento è definito come il momento in cui il mouse ritorna in posizione prona. La gabbia deve essere lasciata indisturbata; Il mouse potrebbe correggere se la gabbia viene toccata, spostata o esposta a alcuni rumori. - Riportare i topi nella loro gabbia di casa quando sono svegli e vigili. Di solito, entro 1 ora dopo l'infortunio, gli animali sono pienamente coscienti e deambulanti. Inoltre, aggiungi del cibo umido sul fondo della gabbia.
4. Assistenza post-operatoria
- Monitorare gli animali per 5 giorni dopo l'intervento.
- Registra il loro peso e qualsiasi cambiamento fisico / comportamentale come la frequenza respiratoria (funzione respiratoria qualitativa), l'andatura, le condizioni del corpo e del pelo, mangiare, bere, defecare e minzione.
- Osservare il mouse per qualsiasi segno di disagio e la ferita chirurgica per gonfiore, essudati o bordi rossi, ordeiscenza. Contattare un veterinario se l'animale mostra segni di dolore e disagio (vocalizzazioni, non si muove, ipotermia, non beve o mangia).
- Rimuovere le graffette 7-10 giorni dopo l'intervento chirurgico in anestesia e su una piastra elettrica.
NOTA: Se vengono utilizzati punti di sutura non assorbibili, devono essere rimossi 7-10 giorni dopo l'intervento chirurgico in anestesia.
5. Pulizia
- Pulire e sterilizzare l'area chirurgica e gli strumenti.
- Pulire la punta della sonda dopo ogni utilizzo e alla fine della giornata con tamponi per la preparazione dell'alcool.
NOTA: Il dispositivo d'urto è calibrato in fabbrica e risulta stabile nel tempo e nell'uso. Non è necessaria alcuna calibrazione di routine. Tuttavia, il dispositivo d'urto e il telaio stereotassico devono essere ispezionati regolarmente. Inoltre, i perimetri degli endpoint del modello, come il raddrizzamento del tempo riflesso, la mortalità e la neuropatologia, dovrebbero essere monitorati per valutare la possibile deriva sperimentale.
6. Criteri di esclusione
- Escludere gli animali prima dell'intervento chirurgico con cattive condizioni di salute, come scarso peso <20 g per un topo di 4 mesi, letargia e cattive condizioni del mantello.
- Escludere gli animali con complicazioni durante l'intervento chirurgico come una frattura del cranio depressa, un'emorragia visibile correlata alla chirurgia o sanguinamento dell'orecchio.
- Escludere dallo studio gli animali con i seguenti sintomi post-chirurgici: incapacità di mangiare e / o di muoversi normalmente, vocalizzazioni insolite, perdita di peso o incapacità della ferita di guarire normalmente dopo l'intervento chirurgico.
NOTA: questo modello potrebbe essere utilizzato come modello ripetitivo di trauma cranico lieve. Se i topi ricevono il secondo intervento chirurgico a 24 ore di distanza dal primo, le graffette o la sutura potrebbero essere rimosse e la stessa incisione potrebbe essere utilizzata per esporre il cranio. Una nuova incisione deve essere fatta se trascorre un tempo più lungo tra gli interventi chirurgici.
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Representative Results
Questo dispositivo di impatto elettromagnetico stereotassico è versatile. Viene utilizzato sia per un impatto corticale controllato a cranio aperto (CCI) o per un intervento chirurgico di trauma cranico chiuso (CHI). Inoltre, la gravità della lesione può essere modulata modificando i parametri della lesione come la velocità dell'impatto, il tempo di permanenza, la profondità dell'impatto, la punta del dispositivo d'urto e l'obiettivo della lesione. Qui è descritto un intervento chirurgico CHI utilizzando un impattatore di punta in acciaio da 5,0 mm. Questa lesione è considerata lieve perché non ci sono lesioni cerebrali strutturali. Il tasso di mortalità nei topi adulti è inferiore allo 0,9%11,14 e aumenta leggermente per raggiungere ~ 2,5% nei topi più anziani (>8 mesi)11. La mortalità si verifica durante i primi 2 minuti a causa dell'apnea, che può essere in gran parte prevenuta monitorando attentamente la profondità dell'anestesia nei secondi precedenti l'impatto.
Il vantaggio di questo modello CHI è che l'impatto produce patologia diffusa bilaterale senza bisogno di esporre la superficie durale corticale (craniotomia). Un'altra caratteristica che rende questo modello TBI efficace è che meno dell'1% dei topi è escluso dallo studio a causa di fratture del cranio o problemi all'orecchio dopo la procedura chirurgica. È importante sottolineare che il modello produce menomazioni neuropatologiche e comportamentali con un singolo impatto, che riduce la complessità sperimentale associata ai modelli ripetitivi di CHI lieve15. Ad esempio, viene identificato un modello temporale riproducibile di cambiamenti morfologici di microglia e astrociti11 (Figura 2A,B). Durante la convalida del modello, si consiglia di utilizzare gli intervalli di partenza delle coordinate antero-posteriore come -1,5 mm ± 0,2 mm e la profondità d'impatto come 1,0 ± 0,2 mm. Potrebbe essere necessario regolare le coordinate in base all'età e allo sforzo dei mouse, nonché alla marca e al modello dell'attrezzatura utilizzata. Una volta convalidate, le impostazioni dovrebbero essere mantenute costanti per un esperimento. Per la validazione, si raccomanda la caratterizzazione neuropatologica di microglia e astrociti a 3 giorni dopo l'infortunio. La colorazione immunoistochimica (IHC) è stata completata seguendo i metodi di Bachstetter et al.18. In particolare, sono state colorate sezioni coronali fluttuanti da 30 μm per attivazione gliale con coniglio anti-GFAP (1:10.000) e per astrociti utilizzando un coniglio anti-IBA1 (1:10.000). Un IgG anti-coniglio di capra coniugato HRP (1:200) è stato utilizzato per rilevare sia GFAP che IBA-1. È stato utilizzato un software di quantificazione per quantificare la colorazione in ciascuna regione considerata. Inoltre, a 1 giorno dopo l'infortunio, sono stati trovati marcatori di lesione assonale nella neocorteccia e cambiamenti nel metabolismo mitocondriale sono stati trovati entro 28 giorni dopo CHI16 (dati non mostrati).
Gli endpoint secondari per la convalida del modello sarebbero i saggi comportamentali. Sono stati riscontrati deficit riproducibili indotti da CHI nel labirinto d'acqua del braccio radiale (RAWM)12 e comportamenti di evitamento attivo13 (Figura 3). I topi sono stati testati in un RAWM a 8 bracci, uno speciale test di apprendimento, come descritto in Macheda et al.12. In breve, i topi sono stati testati in un totale di 28 prove su un protocollo di 4 giorni e avevano 60 s per localizzare la piattaforma posizionata nel braccio bersaglio. Il numero totale di prove al giorno era di sette; Il giorno 1 e il giorno 2 sono stati considerati giorni di allenamento e i giorni 3 e 4 come giorni di test. Durante i giorni di addestramento, i topi sono stati addestrati a localizzare la piattaforma, alternando prove visibili e nascoste; Durante i giorni di test, la piattaforma è stata nascosta durante tutte le prove. Gli esperimenti sono stati registrati utilizzando una telecamera e un sistema di tracciamento è stato utilizzato per l'analisi del comportamento (numero di errori, distanza totale e latenza). I topi sono stati testati 2 settimane dopo l'infortunio. Mentre non c'era alcun effetto del sesso, i topi CHI hanno commesso più errori per eseguire con successo il compito e raggiungere la piattaforma (Figura 3A). Inoltre, sono stati rilevati disturbi della memoria in un test RAWM a 6 bracci11,14,15,16. L'evitamento attivo, un test associativo basato sull'apprendimento, è stato utilizzato per misurare i deficit cognitivi associati a questo modello lieve di CHI. I topi sono stati testati utilizzando un protocollo di 5 giorni ed esposti a 50 prove / giorno13. I topi sono stati addestrati per evitare un lieve shock del piede (stimolo incondizionato, US) associando uno stimolo condizionato (CS, luce) con esso. Nel corso del tempo, i topi hanno imparato a evitare gli Stati Uniti quando è stato presentato il CS. I topi CHI avevano una funzione cognitiva compromessa nell'evitamento attivo rispetto ai topi fittizi (Figura 3B). I topi femmina finti hanno imparato significativamente più velocemente rispetto ai maschi, ma il sesso non ha avuto un ruolo nei topi CHI13. Il comportamento è stato registrato utilizzando un software di evitamento attivo/passivo. Un deficit riproducibile della funzione motoria oltre la prima settimana dopo la lesione non è stato rilevato11.
In questo modello di TBI lieve, non sono state riscontrate lesioni strutturali grossolane al cervello e un singolo impatto ha indotto l'attivazione gliale bilaterale e cambiamenti nella morfologia della microglia. Inoltre, i deficit cognitivi sono associati a questo modello TBI.
Figura 1: Fase 1: Configurazione dell'area chirurgica. (A) Viene mostrato un esempio dell'area chirurgica e degli strumenti necessari per eseguire la chirurgia CHI (impacco di ghiaccio per l'impattatore, telaio stereotassico dotato del dispositivo d'urto, scatola di controllo dell'impattatore e strumenti chirurgici). (B) Una vista ravvicinata della punta della sonda in acciaio da 5 mm, della barra del morso e dell'apparato di supporto della testa, che illustra il posizionamento necessario per l'impatto della linea mediana. (C) L'apparecchio di supporto della testa è costituito da una lampadina di lattice da 1 mL fissata al tubo mediante parafilm. Una siringa da 10 ml viene riempita con acqua per gonfiare il bulbo, con un rubinetto di arresto per mantenere la lampadina gonfiata una volta in posizione. (D) Scatola di controllo del dispositivo d'urto: (1) una grande manopola per regolare la velocità di impatto, (2) un contatore di sosta, (3) un interruttore a levetta di estensione / ritrazione, (4) un interruttore a levetta che, se premuto verso il basso, fornirà l'impatto. (E) Quando non è in uso, il dispositivo di simulazione è tenuto su un impacco di ghiaccio per evitare il surriscaldamento e possibili malfunzionamenti. (F) Un display stereotassico digitale viene utilizzato per stabilire le coordinate x (antero-posteriore), y (mediale-laterale) e z (dorsale-ventrale). Fase 2: Procedura chirurgica. (G,H) Il topo anestetizzato e rasato viene fissato nel telaio stereotassico, (I) viene praticata un'incisione della linea mediana per esporre il bregma (J), (K) che viene utilizzato durante l'intervento chirurgico per allineare l'impattatore. Passaggio 3: recupero. (L) Il mouse viene rimosso dal frame stereotassico. Dopo che il cuoio capelluto è stato chiuso mediante pinzatura o sutura della pelle insieme, viene posto in una gabbia di recupero pulita su un lato. (M) Il mouse viene monitorato fino a quando il mouse non si ribalta e si verifica il riflesso di raddrizzamento. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: I modelli temporali dei cambiamenti morfologici degli astrociti (GFAP) e delle microglia (IBA1) dopo un CHI. (A) La colorazione GFAP a basso ingrandimento mostra l'aumento regionale della colorazione osservato nella corteccia del gruppo CHI. L'aspetto morfologico degli astrociti è mostrato negli inserti ad alto ingrandimento, che sono stati prelevati dalle sezioni del cervello medio e dalle stesse regioni della corteccia. (B) La colorazione IBA1-positiva nella corteccia a 1 giorno, 7 giorni e 2 mesi dopo l'infortunio mostra cambiamenti nella morfologia della microglia nella neocorteccia dopo il CHI (n = 7-14, 50/50 maschio / femmina). I topi (sfondo CD-1/129) avevano 8 mesi al momento dell'intervento. Questa cifra è stata adattata da 11 e riprodotta con il permesso. Barra della scala = 1 mm, 50 μm e 100 μm come indicato in figura. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Deficit di memoria indotti da CHI nella RAWM ed evitamento attivo. (A) A 2 settimane dopo l'infortunio, sia i topi operati da CHI che quelli operati da CHI sono stati in grado di apprendere il compito RAWM, ma i topi CHI hanno commesso più errori rispetto ai topi sham (*** p < 0,0005); sham (n = 20/20 maschio/femmina); CHI (n = 20/20 maschio/femmina). I topi (C57BL/6J) avevano 3-4 mesi al momento dell'intervento. (B) A 4 settimane dopo l'infortunio, i topi CHI e sham-operated sono stati in grado di imparare il compito di evitamento attivo, ma i topi CHI hanno evitato meno scosse del piede rispetto ai topi sham (*** p = 0,0005; **** p < 0,0001); sham (n = 10/10 maschio/femmina); CHI (n = 9/10 maschio/femmina). I topi (C57BL/6J) avevano 3-5 mesi al momento dell'intervento. I dati sono indicati come media ± SEM. (A) Questa cifra è stata adattata da 12 e riprodotta con autorizzazione. (B) Questa cifra è stata adattata da 13 e riprodotta con il permesso. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Diversi passaggi sono coinvolti nella ricreazione di un modello di lesione coerente utilizzando il modello descritto. In primo luogo, è fondamentale fissare correttamente l'animale nella cornice stereotassica. La testa dell'animale non dovrebbe essere in grado di muoversi lateralmente e il cranio dovrebbe essere completamente piatto con bregma e lambda che leggono le stesse coordinate. Posizionare correttamente le barre auricolari è l'aspetto più difficile di questo intervento chirurgico, e questo può essere appreso solo con la pratica. Se il cranio non è livellato, la testa deve essere regolata prima di indurre CHI. La mancata regolazione del posizionamento della testa causerà una frattura del cranio. Per valutare che il cranio è piatto, si dovrebbe guardare lo spazio tra il cranio e la punta dell'impatto da tutte le angolazioni intorno alla punta. I topi con fratture craniche depresse dovrebbero essere esclusi dagli esperimenti, poiché hanno una risposta infiammatoria molto più forte e una lesione più grave rispetto ai topi che non hanno subito fratture del cranio19. Inoltre, i topi con fratture del cranio mostrano esiti TBI più gravi, come depressione respiratoria post-traumatica, lesioni secondarie di rimbalzo e infine morte20.
In questo studio, la testa dell'animale è stata fissata con barre auricolari. In particolare, si raccomanda di utilizzare solo barre auricolari in resina acetalica specifiche per il topo con una punta affusolata, non barre auricolari di ratto di grandi dimensioni. È possibile utilizzare barre auricolari con punta in gomma non foratrici, ma queste barre auricolari comprimono il cranio, alterando la biomeccanica del CHI e sono meno riproducibili. Inoltre, esiste una limitazione all'uso delle barre auricolari, in quanto non consente alcuna forza rotazionale. Tuttavia, la maggiore riproducibilità delle barre auricolari supera il numero limitato di forze rotazionali che possono essere generate se la testa non è fissa.
Tuttavia, fissare la testa con le barre auricolari può anche causare lesioni all'orecchio all'impatto se le forze d'impatto sono tutte posizionate alle orecchie. È stato sviluppato un apparato di supporto della testa posto sotto la testa per spostare le forze lontano dalle orecchie. Dopo aver testato più oggetti simili a cuscini, quello che ha funzionato meglio è stata la lampadina a pipetta in lattice da 1 mL riempita d'acqua. La lampadina della pipetta sotto la testa dell'animale può essere espansa dopo che l'animale è nella cornice stereotassica, permettendogli di avere una vestibilità aderente e fornire un supporto completo sotto la testa. Se posizionato correttamente, non ci dovrebbe essere sanguinamento dalle orecchie o indicazioni comportamentali di danni all'orecchio (rotolamento / inclinazione della testa) dopo la lesione.
Alcune versioni del modello CHI utilizzano una sonda con punta in gomma21,22 o un casco metallico23,24 per ridurre l'insorgenza di fratture craniche. Finché la punta del dispositivo d'urto da 5 mm è a filo con il cranio, non è necessario utilizzarne alcuno. Può essere allettante per i nuovi utenti che non hanno una vasta esperienza con la chirurgia stereotassica di indurre la lesione con la punta non a filo con il cranio nel piano mediale-laterale. Se il cranio non è livellato nel piano mediale-laterale, è perché le barre auricolari non sono posizionate correttamente. L'unica soluzione per questo problema è rimuovere l'animale dall'impattatore e assegnare il mouse a una ferita fittizia. Se la punta non è a filo sul piano anteriore-posteriore, è necessario regolare l'altezza della barra del morso e riallineare la punta con il bregma. Inoltre, l'uso di un dispositivo d'urto da 5 mm con punta piatta riduce la possibilità di causare fratture craniche19 rispetto alle punte del dispositivo d'urto di diametro inferiore. Altri fattori importanti da considerare sono l'età e il peso del soggetto, così come lo spessore del cranio25 e i ceppi dei topi26.
Nelle persone, un lieve trauma cranico non è associato alla morte durante i primi minuti dopo la lesione. Negli animali, anche una ferita lieve può causare la morte. Tuttavia, in questo modello, la mortalità è quasi sempre associata a complicanze chirurgiche, non solo alla lesione. Il motivo più comune per cui un topo morirebbe dopo l'impatto è la profondità dell'anestesia. Ciò potrebbe verificarsi se l'intervento chirurgico ha richiesto più tempo del previsto o se il gas isoflurano era a una concentrazione superiore a quella necessaria per quell'animale. Se la respirazione dell'animale è lenta o affannosa, questo potrebbe essere un segno che la profondità dell'anestesia dovrebbe essere ridotta prima di fornire l'impatto. Se il respiro dell'animale è lento o affannoso al momento dell'impatto, l'animale avrà probabilmente apnea e potrebbe morire.
Esistono molti modelli di TBI lieve. Ognuno ha punti di forza e di debolezza, e questo modello non è diverso. Come riportato, qui è descritto un modello single hit di TBI, ma il modello è stato utilizzato per causare un TBI ripetitivo15. I passaggi descritti in questo protocollo possono essere ripetuti per indurre una lesione TBI ripetitiva. Quando si valutano i diversi modelli TBI, è importante considerare se il modello ha la patologia desiderata che si sta tentando di modellare. Si dovrebbe anche considerare quanto sia riproducibile il modello. Si consiglia vivamente che il punto di partenza per l'utilizzo di questo o di qualsiasi modello TBI sia quello di convalidare e caratterizzare in modo indipendente che il modello funzioni come riportato in precedenza.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato in parte dal National Institutes of Health con i numeri di premio R01NS120882, RF1NS119165 e R01NS103785 e il numero di premio del Dipartimento della Difesa AZ190017. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta le opinioni ufficiali del National Institutes of Health o del Dipartimento della Difesa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9 mm Autoclip Applier | Braintree scientific | ACS- APL | Surgery |
| 9 mm Autoclip Remover | Braintree scientific | ACS- RMV | Surgery |
| 9 mm Autoclip, Case of 1,000 clips | Braintree scientific | ACS- CS | Surgery (Staples) |
| Aperio ImageScope software | Leica BioSystems | NA | IHC |
| BladeFLASK Blade Remover | Fisher Scientific | 22-444-275 | Surgery |
| Cotton tip applicator | VWR | 89031-270 | Surgery |
| Digitial mouse stereotaxic frame | Stoelting | 51730D | Surgery |
| Dumont #7 Forceps | Roboz | RS-5047 | Surgery |
| Ear bars | Stoelting | 51649 | Surgery |
| EthoVision XT 11.0 | Noldus Information Technology | NA | RAWM |
| Fiber-Lite | Dolan-Jeffer Industries | UN16103-DG | Surgery |
| Fisherbrand Bulb for Small Pipets | Fisher Scientific | 03-448-21 | Head support apparatus |
| Gemini Avoidance System | San Diego Instruments | NA | Active avoidance |
| Heating Pad | Sunbeam | 732500000U | Surgery prep |
| HRP conjugated goat anti-rabbit IgG | Jackson Immuno Research laboratories | 111-065-144 | IHC |
| Induction chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530XS | Surgery prep |
| Isoflurane, USP | Covetrus | NDC: 11695-6777-2 | Surgery |
| Mouse gas anesthesia head holder | Stoelting | 51609M | Surgery |
| Neuropactor Stereotaxic Impactor | Neuroscience Tools | n/a | Surgery: Formally distributed by Lecia as impact one |
| NexGen Mouse 500 | Allentown | n/a | Post-surgery, holding cage |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Head support apparatus |
| Peanut - Professional Hair Clipper | Whal | 8655-200 | Surgery prep |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) available Iodine, for laboratory | Ricca | 3955-16 | Surgery |
| Puralube Vet Oinment,petrolatum ophthalmic ointment, Sterile ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Surgery |
| Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | IHC |
| Rabbit anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | IHC |
| 8-arm Radial Arm Water Maze | MazeEngineers | n/a | RAWM |
| Scale | OHAUS CS series | BAL-101 | Surgery prep |
| Scalpel Handle #7 Solid 6.25" | Roboz | RS-9847 | Surgery |
| Sterile Alcohol Prep Pads (isopropyl alcohol 70% v/v) | Fisher Brand | 22-363-750 | Surgery prep |
| SumnoSuite low-flow anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Surgery |
| 10 mL syringe Luer-Lok Tip | BD Bard-Parker | 302995 | Head support apparatus |
| Timers | Fisher Scientific | 6KED8 | Surgery |
| Topical anesthetic cream | L.M.X 4 | NDC 0496-0882-15 | Surgery prep |
| Triple antibiotic ointment | Major | NDC 0904-0734-31 | Post-surgery |
| Tubing | MasterFlex | 96410-16 | Head support apparatus |
| Vaporizer Single Channel Anesthesia System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | Surgery prep |
References
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