Summary
本协议描述了从原代癌细胞生成3D肿瘤培养模型，并使用细胞活力测定和显微镜检查评估其对药物的敏感性。
Abstract
尽管在理解肿瘤生物学方面取得了显着进展，但绝大多数进入临床试验的肿瘤候选药物都失败了，通常是由于缺乏临床疗效。这种高失败率说明了目前的临床前模型无法预测临床疗效，主要是因为它们在反映肿瘤异质性和肿瘤微环境方面存在不足。这些限制可以通过从个体患者身上的人类肿瘤样本建立的三维（3D）培养模型（球状体）来解决。这些3D培养物比不反映肿瘤异质性的已建立细胞系更能代表现实世界的生物学。此外，3D培养优于二维（2D）培养模型（单层结构），因为它们复制肿瘤环境的元素，如缺氧，坏死和细胞粘附，并保持天然细胞形状和生长。在本研究中，开发了一种用于制备来自个体患者的癌细胞原代培养物的方法，这些患者是3D的并在多细胞球状体中生长。这些细胞可以直接来源于患者肿瘤或患者来源的异种移植物。该方法广泛适用于实体瘤（例如结肠、乳腺癌和肺癌），并且还具有成本效益，因为它可以在典型的癌症研究/细胞生物学实验室中完整地进行，而无需依赖专用设备。本文提出了一种协议，用于从原代癌细胞生成3D肿瘤培养模型（多细胞球状体），并使用两种互补方法评估其对药物的敏感性：细胞活力测定（MTT）和显微镜检查。这些多细胞球体可用于评估潜在的候选药物，识别潜在的生物标志物或治疗靶点，并研究反应和耐药的机制。
Introduction
体外 和 体内 研究代表了开发癌症治疗方法的补充方法。 体外 模型允许控制大多数实验变量并促进定量分析。它们通常用作低成本的筛选平台，也可用于机理研究1。然而，它们的生物学相关性本质上是有限的，因为这样的模型只能部分反映肿瘤微环境1。相比之下， 体内 模型，如患者来源的异种移植物（PDX），捕获了肿瘤微环境的复杂性，更适合于患者的转化研究和个体化治疗（即，在源自个体患者的模型中研究对药物的反应）1。然而， 体内 模型不利于药物筛选的高通量方法，因为实验参数不能像 体外 模型那样严格控制，并且它们的开发耗时、劳动密集型且成本高昂1，2.
体外模型已经有100多年的历史，细胞系已经有70多年的历史3。然而，在过去的几十年中，实体瘤体外模型的复杂性急剧增加。这种复杂性的范围从肿瘤衍生的已建立细胞系或原代细胞系的二维（2D）培养模型（单层结构）到涉及三维（3D）模型的最新方法1。在2D模型中，一个关键的区别是已建立的细胞系和原代细胞系之间的区别4。已建立的细胞系永生化;因此，同一细胞系可以在全球范围内使用多年，从历史的角度来看，这促进了协作、数据的积累和许多治疗策略的开发。然而，这些细胞系中的遗传畸变随着每次传代而积累，从而损害了它们的生物学相关性。此外，可用细胞系的数量有限并不能反映患者肿瘤的异质性4，5。原代癌细胞系直接来源于通过活检、胸腔积液或切除获得的切除肿瘤样本。因此，原代癌细胞系更具生物学相关性，因为它们保留了肿瘤微环境和肿瘤特征的元素，例如细胞间行为（例如，健康和癌细胞之间的串扰）和癌细胞的干细胞样表型。然而，原代细胞系的复制能力有限，这导致培养时间较窄，并限制了可用于分析的肿瘤细胞数量4，5。
使用3D培养物的模型比2D培养模型更具生物学相关性，因为保留了体内条件。因此，3D培养模型保留了天然细胞的形状和生长，并复制了肿瘤环境的元素，例如缺氧，坏死和细胞粘附。癌症研究中最常用的3D模型包括多细胞球状体，基于支架的结构和基质嵌入的培养物4，6，7。
本协议从原发癌细胞生成3D肿瘤培养模型（多细胞球状体），并使用两种互补方法评估其对药物的敏感性：细胞活力测定（MTT）和显微镜检查。本文介绍的代表性结果来自乳腺癌和结肠癌;然而，该方案广泛适用于其他实体瘤类型（例如，胆管癌，胃癌，肺癌和胰腺癌），并且也具有成本效益，因为它可以在典型的癌症研究/细胞生物学实验室中完整进行，而无需依赖专用设备。使用这种方法生成的多细胞微球可用于评估潜在的候选药物，识别潜在的生物标志物或治疗靶点，并研究反应和耐药的机制。
该协议分为三个部分：（1）微球的生成，收集和计数，以准备将其用作测试药物疗效的模型;（2）MTT测定以评估药物对球状体的疗效;（3）用药物治疗微球后形态变化的显微镜评估，作为评估药物疗效的另一种方法（图1）。
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Protocol
用于原发性肿瘤细胞培养的人类肿瘤样本的收集是根据机构审查委员会（IRB）批准的方案在拉宾医疗中心进行的，并得到了患者的书面知情同意。有资格参与该研究的患者包括患有非转移性乳腺癌、结肠癌、肝癌、肺癌、神经内分泌癌、卵巢癌或胰腺癌、任何儿科癌症或任何转移性癌症的男性和女性成人和儿科癌症患者。唯一的排除标准是缺乏提供知情同意的能力。
1. 球体的生成和收集
注意：原发性肿瘤细胞的分离可以按照柯达等人的描述进行8。重要的是，用于产生球状体的原代肿瘤细胞可以直接来自通过活检、切除等获得的患者样本，也可以间接使用来自患者来源的异种移植（PDX）模型的肿瘤样本，如Moskovits等人所描述的9。
- 制备75%-100%汇合的贴壁原代肿瘤细胞培养物的单细胞悬液，取具有单细胞贴壁原代细胞培养物的小烧瓶（T25），除去细胞培养基，用PBS洗涤，然后加入1mL的1x Accutase（细胞分离溶液）（参见 材料表）在37°C下3分钟。
- 通过加入 5 mL 细胞培养基（补充有 10% FBS、1：100 青霉素-链霉素、1% 非必需氨基酸和 1% L-谷氨酰胺的 RPMI-1640 培养基;参见 材料表）中和 Accutase 溶液。
- 用 10 mL 血清移液管吸出细胞，并将其沉积在 15 mL 锥形管中。在室温下以800× g 离心管5分钟。
- 取出细胞培养基，在细胞沉淀顶部加入 5 mL 新鲜细胞培养基，轻轻混合。
- 用血细胞计数器计数活细胞10。为此，取 50 μL 细胞悬浮液的等分试样，并将其与 50 μL 台盼蓝混合。计数活细胞（蓝色阴性的细胞），并计算悬浮液中活细胞的总数。
- 制备“3D培养基”（补充有5%基底膜基质的细胞培养基;参见 材料表）。
注意：“3D培养基”在室温下呈液体状。在37°C时，稠度变得更加凝胶状（使细胞保持在一起），尽管它仍然可以移液（因为它仅含有5%的基底膜基质）。 - 计算测定所需的细胞数量和所需的总体积;每个孔必须在 200 μL 培养基中含有 2，000-8，000 个细胞。
- 在 200 μL 的“3D 培养基”中制备具有所需细胞数（例如 4，000 个细胞）的细胞悬液，并与移液器轻轻混合以确保均匀分布。
- 将悬浮液转移到移液槽中。使用多通道移液器，向超低附着 96 孔板的每个孔中加入 200 μL 细胞悬液（参见 材料表）。在每次收集细胞之前，充分混合悬浮液。
- 在室温下以300× g 离心板10分钟以加强细胞的聚集，从而改善细胞聚集，并将板在37°C下在5%CO2加湿培养箱中孵育。
- 每2-3天刷新一次“3D培养基”。在室温下以300× g 离心板10分钟，轻轻除去并丢弃50%的培养基（100μL），然后加入100μL新鲜的“3D培养基”以替换现有溶液。重复步骤1.11，并将板放回37°C，5%CO2加湿培养箱中。
注意：当板保持在45°时，必须去除培养基，并且必须仅从上部收集培养基以避免收集细胞。不应使用真空抽吸系统。需要缓慢而温和地添加新鲜培养基，以免破坏已经开始形成的微球。 - 每1-2天在显微镜下检查细胞以监测球状体的形成。使用成像软件中的“缩放”工具测量形成的微球的直径（参见 材料表）。
注意：显微镜检查应首先发现不规则的圆形到椭圆形物体，随着时间的流逝，这些物体呈球状11，12。- 当球体直径达到100-200μm时，进行药物疗效实验。
注意：当球状体达到该直径时进行药物功效实验，因为此时大多数细胞正在增殖，这有利于评估对治疗的反应。较大直径的球状体包含坏死核心和静止层11，12，导致对治疗有反应的增殖细胞比例较小。
- 当球体直径达到100-200μm时，进行药物疗效实验。
- 对于球状体收集，请使用 1，000 μL 移液器从每个孔中收集球体，并将其沉积到 15 mL 锥形管中。
注意：球体本质上是脆弱的，需要轻柔处理。将带有球体的培养基转移到锥形管中时，将管保持在45°，然后在管壁上缓慢移液。球体是肉眼可见的。 - 在室温下以300× g 离心锥形管5分钟，然后小心地吸出并使用移液管弃去上清液。
- 加入 0.5 mL 细胞培养基，并轻轻地重悬沉淀。避免制造气泡。
- 按照以下步骤执行球体计数。
- 使用 96 孔板并在孔的底部绘制一个加号，将孔划分为象限（以帮助跟踪计数）。
- 向孔中加入 50 μL 悬浮液，并在显微镜下手动计数球状体（使用 10 倍物镜）。
- 计算每个象限中的球体，注意不要重复计数，并计算孔中的球体总数。
注意：为了计数的准确性，至少计数孔中的50个球体。如果球状体少于50个，则轻轻混合悬浮液以确保均匀分布，并使用添加到新孔中的更大体积的悬浮液再次计数。或者，如果孔中的球体少于 50 个，则可以离心球体并以 <0.5 mL 的体积轻轻重悬。如果球状体超过 100 个，将细胞培养基添加到球状悬浮液中，轻轻混合并重新计数。 - 计算球体浓度（球体计数/计数体积[μL]），然后计算悬浮液中的球体总数（球体浓度×总体积）。
2. 药物疗效测定（MTT测定）
注：详见van Meerloo et al.13。此外，对于MTT测定，必须仅使用细胞培养基而不是“3D培养基”（添加基底膜基质不是必需的，并且可能会干扰MTT测定）。
- 在新管中，制备浓度为每 200 μL 细胞培养基 200 个球状体的球状悬浮液（补充有 10% FBS、1：100 青霉素-链霉素、1% 非必需氨基酸和 1% L-谷氨酰胺的 RPMI-1640 培养基）。
- 对于每种药物治疗，在 15 mL 管中制备球状体储备液。通过重复所需的孔数计算每种药物所需的量：（5-8）×200μL。将药物添加到试管中至所需的最终浓度。
注意：请参阅有关本研究使用的药物及其剂量的代表性结果部分。此外，药物的商业细节列在 材料表中。
- 对于每种药物治疗，在 15 mL 管中制备球状体储备液。通过重复所需的孔数计算每种药物所需的量：（5-8）×200μL。将药物添加到试管中至所需的最终浓度。
- 将 200 μL 球状悬浮液转移到超低附着 96 孔板的孔中，并将板在 37 °C 下在 5% CO2 加湿培养箱中孵育。不要使用96孔板的外部行和列进行测定，因为这些孔的特征是蒸发增加，这可能导致重复实验之间的变异性增加;相反，将PBS添加到这些孔中。
注意：关键是球状体的培养物在等分到96孔板中之前是均匀的。此外，每个实验中都必须包括对照条件（即未经处理的球体）。 - 将球状体与研究药物孵育24-72小时后，在室温下以300× g 离心板5分钟，并轻轻除去170μL细胞培养基，在孔底部留下30μL（包括球状体）。
注意：必须小心去除170μL细胞培养基，以免去除球状体。将板保持在 45°，并将一只手（戴上深色手套以形成对比）放在孔下，以便可以看到球体（白点）。 - 制备MTT溶液（0.714mg / mL无酚RPMI，参见 材料表）。
- 向每个孔中加入 70 μL MTT 溶液，最终体积为每孔 100 μL（孔中的最终 MTT 浓度为每 100 μL 0.05 mg）。此外，用不含细胞的MTT溶液制备“空白”孔。
注意：MTT 对光敏感。因此，必须关闭引擎盖中的灯，并且必须用铝箔覆盖装有MTT溶液的管子。 - 将板在37°C下在5%CO2加湿培养箱中孵育3-4小时，直到观察到孔中溶液颜色的变化（紫色代表活细胞）。
- 观察到变化时，向每个孔中加入 100 μL 终止溶液（0.1N HCl 异丙醇溶液），并轻轻混合孔的内容物而不会产生气泡。
- 在荧光计-ELISA读数器（参见 材料表）中读取波长为570nm，背景波长为630-690nM的板的吸光度。
注意：如果可用的荧光计-ELISA读数仪无法读取超低附着的96孔板，请将每个孔的内容物转移到相应的平底96孔板中。 - 按照以下步骤计算细胞活力。
- 对于每个孔，计算“特定信号”（“特定信号”= 570 nm 处的信号 - 630-690 nm 处的信号）。然后，计算“空白”孔的平均值，并从每个孔中减去该值。
- 计算包含未用研究药物（“AV-SS-unt”）处理的细胞的对照孔中“特定信号”的平均值。
- 计算每个孔中细胞相对于未处理细胞的孔的活力（百分比）。
注意：活力=（每个孔中的特定信号/“AV-SS-unt”）×100
3. 监测和分析微球的形态变化
注意：对于MTT测定，在此评估中应仅使用细胞培养基而不是“3D培养基”（不需要添加基底膜基质，并且可能会干扰分析）。
- 计数球状体后，将细胞培养基（补充有 10% FBS、1：100 青霉素-链霉素、1% 非必需氨基酸和 1% L-谷氨酰胺的 RPMI-1640 培养基）中的悬浮液稀释至每 20 μL 约 1-2 个球状体。
- 将 80 μL 细胞培养基放入超低附着 96 孔板的孔中，然后将 20 μL 球状悬浮液加入孔中。
注意：因此，孔将包含1-2个球体，体积为100μL。 - 在显微镜下仔细检查孔，并标记包含一个球体的孔，因为它们将用于此分析。
- 以目标浓度的两倍浓度制备研究药物。向相关孔中加入 100 μL 药物溶液（孔中的总浓度为 1x）。
- 在第0天（在添加研究药物之前）捕获每个孔的图像，并使用成像软件中的“刻度”工具（参见 材料表）来确定微球的直径。
- 将板在37°C下在5%CO2加湿培养箱中孵育，并检查形态并测量球体的直径（使用“刻度”工具）每天3-7天，具体取决于何时观察到药物效应（例如，细胞传播，侵袭性豆荚，结构破坏等）。
- 在实验结束时，绘制球体直径（相对于第 0 天）随时间的变化。
注意：变化（百分比）=（特定日期的球体直径/第0天该球体的直径）×100
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Representative Results
该协议提出了从原代肿瘤细胞生成球状体均质培养物的程序，定量评估球状体培养的药物功效（MTT测定），并确定研究药物对球状体形态的影响。介绍了来自结肠和乳腺癌细胞培养物产生的球状体的代表性实验数据。使用其他肿瘤类型进行了类似的实验，包括胆管癌，胃癌，肺癌和胰腺癌（数据未显示）。本文介绍的所有实验一式三份进行。
图2 显示了从原代结肠癌细胞培养物产生的球状体。如图 2所示，生成的球状体数量取决于每个孔中最初接种的细胞数量。微球生长到直径超过100μm需要10-14天。肿瘤细胞的起源（例如，不同的患者和不同的起源）决定了生长速率。用更多的细胞接种孔并没有缩短球体生成所需的时间，而是增加了形成的微球数量。值得注意的是，在结肠癌球体的长期培养中，它们开始相互附着并在葡萄状结构中形成球状体簇（图3），这阻止了均质培养，因此禁止在MTT测定中使用球状体。
图4 显示了三种处理（10μM帕博西利，10μM舒尼替尼及其组合10μM）对源自两种原发性癌症的球状体活力的影响。在这种情况下，首先建立了PDX模型，用于球状体分析的肿瘤细胞来自PDX模型9。第一个PDX模型是使用来自50岁男性患者的结肠癌样本建立的，第二个模型使用来自62岁女性的乳腺癌样本建立的。如图 4A，B所示，治疗3天后，帕博西尼加舒尼替尼的组合导致MTT测定法测量的活力显着降低。如图 4C，D所示，治疗过程中发生的形态变化非常清晰。在第0天，所有球体都完好无损。相比之下，在第3天，用对照（DMSO）处理的微球仍然完整，而用组合处理的微球被拆解，它们的形态是“开放的”，细胞从固体结构中分离，表明球体结构被破坏。
图5 显示了微球随时间推移的随访情况。这些球状体由来自一名44岁女性患者的乳腺癌细胞产生，用两种组合之一（曲妥珠单抗[10μg/mL]加长春瑞滨[1μg/mL]或5-氟尿嘧啶[200μM]加顺铂[300μM]）之一治疗。 如图5A所示，用5-氟尿嘧啶加顺铂处理的微球尺寸在第3天减小，在第7天完全破坏球体。相比之下，曲妥珠单抗加长春瑞滨治疗对球体的形态只有很小的影响（例如，某种程度的“开放”结构），但效果并不显着。 图5B 显示了微球直径相对于第0天的平均变化（每个治疗组跟踪五个微球）。
图 1：从患者来源的肿瘤样本中建立 3D 微球并评估其对药物敏感性的方案概述。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：通过初始接种细胞的数量随着时间的推移，原代结肠癌细胞培养物形成球状体。将不同数量的细胞接种在超低附着96孔板中的“3D培养基”中，并在显微镜下观察（4倍放大）。比例尺 = 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：培养 12 天后来自原发性结肠癌细胞的球状体（初始细胞接种每孔 2，000 个）。两个示例（A，B）显示了由球体相互连接（10倍放大倍率）创建的集群。比例尺 = 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：帕博西尼 （10 μM）、舒尼替尼 （10 μM） 及其组合（每个 10 μM）对原发性肿瘤细胞（包括结肠癌和乳腺癌（PDX 衍生））的球状体的影响。对源自（A）结肠和（B）乳腺癌细胞的微球进行了MTT测定。将MTT信号标准化为来自DMSO处理的细胞的值。这些值表示从 4 到 8 个仿行的均值。误差线表示 SEM。 *p < 0.05 与单个代理（t 检验）。在治疗来自（C）结肠和（D）乳腺癌细胞的球状体（10倍放大）的第0天和3天后，还显微镜评估了各种处理对细胞生长的影响。比例尺 = 100 μm。该图改编自Moskovits等人9。请点击此处查看此图的大图。
图 5：曲妥珠单抗 （10 μg/mL） 加长春瑞滨 （1 μg/mL） 和 5-氟尿嘧啶 （200 μM） 加顺铂 （300 μM） 随着时间的推移对乳腺癌衍生球状体的影响。（A）每个孔包含一个球体，并在显微镜下（10倍放大倍率）随着时间的推移进行监测。比例尺= 100μm。 （B）球体直径的变化（相对于第0天）在治疗持续时间内的变化。*p = 0.05 5-氟尿嘧啶加顺铂与对照组（t 检验）。每个处理组包括四到六个孔，每个孔中有一个球体。显示平均变化。误差线代表 SEM。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
本协议描述了一种从人类肿瘤样品中提取3D原代细胞培养物（球状体）的简单方法。这些微球可用于各种分析，包括评估潜在的候选药物和药物组合，识别潜在的生物标志物或治疗靶点，以及研究反应和耐药的机制。该方案使用直接来自患者样本的原代肿瘤细胞或来自PDX模型的肿瘤细胞，可以使用患者样本建立。后一种方法允许对相同的原发肿瘤进行 体外 和 体内 实验。PDX模型和源自这些模型的3D培养物之间的药物敏感性实验结果先前已显示出一致性9，因此支持这种 体外/体内 方法的相关性。
当前协议的主要优点包括其对大多数实体瘤的广泛适用性和成本效益，这源于其与癌症研究/细胞生物学实验室的典型能力/设备的兼容性（即，不需要专门的设备或外包）。此外，当前方案生成均匀的球状体群体，这允许使用高通量定量活力测定（例如MTT）。生成均匀的球状体群体对于获得有意义的结果很重要，因为研究表明球体大小会影响对治疗的反应。与较小的球体不同，较大的球体具有坏死的核心。然而，大多数细胞在较小的球状体中处于线性生长阶段。此外，微球的大小也会影响其组织结构的刚度，这可能会影响化合物（例如用于活性测定的化合物）扩散到球体14中。当前协议的主要局限性是，即使具有广泛的适用性，在某些情况下，该方法也无法生成球体。重要的是，这种失败不是肿瘤类型特异性的，而是患者特异性的。需要额外的研究来探索为什么来自某些患者的肿瘤样本不会使用该协议形成球状体。
目前的协议基于两个关键原则：（1）具有没有细胞簇的细胞悬液（即单细胞悬液）和（2）使用超低附着板，其培养基含有5%基底膜基质（溶解的细胞外基质）。接种细胞的初始数量会影响形成的球体数量，但不会影响形成球体所需的时间，这表明每个球状体都是由单个肿瘤细胞生成的。值得注意的是，球状体聚集发生，特别是在长时间孵育后。这种聚类破坏了均质培养并禁止使用MTT（由于难以将相同数量的球状体分配到每个孔中）。通过稀释培养物并将球状体转移到较大的孔中，可以避免这种聚集。如果无法实现均质培养，则不能使用MTT测定，尽管仍然可以进行形态学评估和球体直径的测量。必须注意的是，形态学评估更加劳动密集型，因为它需要为每个孔分配一个微球并在显微镜下监测每个微球。
确定MTT测定的适当微球数量对于其解释非常重要。因此，建议首先生成具有已知微球数（例如，每孔50、100、200和400，重复）的标准曲线，以确定MTT测定的最佳微球数。必须使用图线性范围的中间值进行分析，以便有足够的微球来检测信号，但不会太多（即，不会达到信号的平台期）。此外，使用中间范围允许在对药物有反应（即信号减少）以及无反应（即球体的持续生长和信号增加）的情况下将信号保持在线性范围内。最后，由于MTT测定评估细胞代谢活性，来自不同患者的肿瘤之间可能不同，因此应为每个原发肿瘤样本生成标准曲线。
总之，该协议用于从原代癌细胞生成3D肿瘤培养模型，并使用显微镜下的细胞活力测定（MTT）和形态学检查评估其对药物的敏感性，代表了一种有价值的生物学相关工具，可补充当前的2D 体外 方法以及 体内 方法。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
没有。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 Fluorouracil | TEVA Israel | lot 16c22NA | Fluorouracil, Adrucil |
| Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutase Cell Dissociation |
| Cisplatin | TEVA Israel | 20B06LA | Abiplatin, |
| Cultrex | Trevigen | 3632-010-02 | Basement membrane matrix, type 3 |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2391595 | |
| Flurometer ELISA reader | Biotek | Synergy H1 | Gen5 3.11 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma Aldrich | 320331 | for stop solution |
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | Version 1.52a | Open-source software ImageJ |
| Isopropanol | Gadot | P180008215 | for stop solution |
| L-glutamine | Gibco | 1843977 | |
| MTT | Sigma Aldrich | M5655-1G | 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| Palbociclib | Med Chem Express | CAS # 571190-30-2 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium |
| Penicillin–streptomycin | Invitrogen | 2119399 | |
| Phenol-free RPMI 1640 | Biological industries, Israel | 01-103-1A | |
| Pippeting reservoir | Alexred | RED LTT012025 | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco | 11530586 | |
| Sunitinib | Med Chem Express | CAS # 341031-54-7 | |
| Trastuzumab | F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland | 10172154 IL | Herceptin |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological industries, Israel | 03-102-1B | |
| Ultra-low attachment 96 well plate | Greiner Bio-one | 650970 | |
| Vinorelbine | Ebewe | 11733027-03 | Navelbine |
References
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