Summary
För att inducera experimentell autoimmun encefalomyelit, en djurmodell av multipel skleros, immuniseras möss med en vatten-i-olja-emulsion innehållande ett autoantigen och kompletterar Freunds adjuvans. Medan flera protokoll finns för beredning av dessa emulsioner, presenteras ett snabbt, enkelt och standardiserat homogeniseringsprotokoll för emulsionsberedning här.
Abstract
Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) delar liknande immunologiska och kliniska egenskaper med multipel skleros (MS), och används därför i stor utsträckning som en modell för att identifiera nya läkemedelsmål för bättre patientbehandling. MS kännetecknas av flera olika sjukdomsförlopp: skovvis förlöpande MS (RRMS), primär progressiv MS (PPMS), sekundär progressiv MS (SPMS) och en sällsynt progressiv återfallande form av MS (PRMS). Även om djurmodeller inte exakt efterliknar alla dessa kontrasterande fenotyper av mänskliga sjukdomar, finns det EAE-modeller som återspeglar några av de olika kliniska manifestationerna av MS. Till exempel efterliknar myelinoligodendrocytglykoprotein (MOG) -inducerad EAE i C57BL / 6J-möss humant PPMS, medan myelinproteolipidprotein (PLP) -inducerad EAE i SJL / J-möss liknar RRMS. Andra autoantigener, såsom myelinbasiskt protein (MBP), och ett antal olika musstammar används också för att studera EAE. För att inducera sjukdom i dessa autoantigen-immunisering EAE-modeller framställs en vatten-i-olja-emulsion och injiceras subkutant. Majoriteten av EAE-modellerna kräver också en injektion av kikhosttoxin för att sjukdomen ska utvecklas. För konsekvent och reproducerbar EAE-induktion krävs ett detaljerat protokoll för att förbereda reagenserna för att producera antigen-/adjuvansemulsioner. Metoden som beskrivs här utnyttjar en standardiserad metod för att generera vatten-i-olja-emulsioner. Det är enkelt och snabbt och använder en skakande homogenisator istället för sprutor för att förbereda kvalitetskontrollerade emulsioner.
Introduction
En nedbrytning av immunologisk tolerans kan resultera i generering av autoimmuna störningar, såsom multipel skleros (MS). Det uppskattas att 2,8 miljoner människor lever med MS över hela världen1. Även om den exakta orsaken till MS fortfarande är till stor del okänd, spelar dysreglering av autoreaktiva T- och B-celler, liksom defekter i Treg-funktionen, viktiga roller i patogenesen av sjukdomen 2,3.
Djurmodeller av autoimmuna sjukdomar är viktiga verktyg för att undersöka potentiella terapeutiska metoder. Den experimentella modellen för autoimmun encefalomyelit (EAE) har använts i nästan ett sekel av forskare som är intresserade av MS4. I tidiga experiment var förekomsten av sjukdomen relativt låg. Introduktionen av komplett Freunds adjuvans (CFA), innehållande Mycobacterium och kikhosttoxin, möjliggjorde konsekvent induktion av EAE i möss4. Viktigast av allt är att det är nödvändigt att blanda CFA med ett antigen i centrala nervsystemet (CNS) för att generera en homogen vatten-i-olja-emulsion för att inducera EAE. De vanligaste för närvarande tillgängliga EAE-modellerna är baserade på aktiv immunisering av möss med encefalitogena peptider. Mössens genetiska bakgrund spelar en viktig roll för sjukdomskänslighet, med myelinoligodendrocytglykoprotein (MOG35-55) och myelinproteolipidprotein (PLP139-151) peptider som används för att inducera EAE i C57BL / 6J respektive SJL-möss5. Andra musstammar och CNS-härledda peptider kan dock också användas.
Kvaliteten på CFA/peptidemulsionen är en kritisk faktor som bestämmer sjukdomspenetransen i den aktiva immuniseringsmodellenEAE modell 6. En homogen vatten-i-olja-emulsion måste framställas genom att blanda de encefalitogena peptiderna upplösta i vattenhaltig buffert med CFA, annars kommer djur inte att utveckla sjukdomen. Många protokoll har publicerats om beredning av CFA/peptidemulsioner. Exempel inkluderar användning av en virvel7, ultraljudsbehandling8, sprutor och en trevägs T-kontakt9, eller en spruta endast5. Alla dessa metoder är dock svåra att standardisera och är ofta förknippade med långa och komplicerade protokoll.
Jämfört med alla ovanstående metoder erbjuder den enkla metoden som beskrivs här för emulsionsberedning fördelarna med att inte ha några person-till-person-skillnader och vara relativt snabb. Emulsionen genereras av en homogenisator som skakar reagenserna med en inställd hastighet, tid och temperatur, vilket säkerställer snabba och konsekventa resultat. Förutom att inducera sjukdom i EAE-modellen kan denna metod också användas för att studera andra autoimmuna sjukdomsmodeller såsom kollageninducerad artrit (CIA) och antigeninducerad artrit (AIA)6. Därför förväntas denna metod kunna användas för att konsekvent inducera sjukdom i andra djurmodeller som är beroende av vatten-i-olja-emulsioner med autoantigener, såsom experimentell autoimmun neurit (EAN)10, experimentell autoimmun tyreoidit (EAT)11, autoimmun uveit (EAU)12 och myasthenia gravis (MG)13. Denna metod inducerar också allmänna immunsvar som fördröjd överkänslighet (DTH) konsekvent6, och kan därför användas för att leverera cancer- och malariavacciner (se diskussion).
Således har en snabb (total beredningstid ~ 30 min), enkel (alla reagenser kan förberedas i förväg och lagras) och standardiserad (emulsionen uppnås med hjälp av en skakningshomogenisator) metod utvecklats och presenteras här. CFA/antigenemulsioner framställda med hjälp av detta protokoll inducerar konsekvent sjukdom i autoimmuna djurmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes enligt Djurförsöksmyndighetens praxis och godkändes av djurförsöksetiska nämnden, Lund-Malmö (Tillståndsnummer: M126-16).
OBS: Ett schematiskt flöde av metoden beskrivs i figur 1.
1. Förberedelse av material
OBS: Förbered alla reagens aseptiskt i en steril huva och alikvotera och förvara vid angiven temperatur. Reagenserna kan lagras upp till 2 år utan att förlora sin effekt.
- Bered CFA innehållande 20 mg/ml Mycobacterium tuberculosis enligt beskrivningen nedan.
- Tillsätt 100 mg frystorkad M. tuberculosis H37RA (se materialförteckning) och fem 3,2 mm stålpärlor till ett 7 ml rör (se materialtabell). Skaka röret i en homogenisator (se materialtabell) i 60 s vid högsta hastighetsinställning (5 000 rpm).
- Tillsätt 5 ml ofullständigt Freunds adjuvans (IFA) till röret och skaka igen i 60 s med högsta hastighet. Överför uppslamningen av homogeniserad M. tuberkulos i IFA (nu kallad CFA) till ett nytt rör med pipett, lämna pärlorna bakom dig och förvara vid 4 °C tills de används.
- Tillsätt ultrarent vatten till det frystorkade pulvret av MOG35-55-peptiden (se materialförteckning) för att erhålla en slutlig peptidkoncentration på 10 mg / ml. Sterilisera lösningen genom att leda den genom ett 0,2 μm filter. Bered 60 μL alikvoter och förvara vid -20 °C tills de används.
OBS: MOG35-55-peptiden som används för detta experiment är av ImmunoGrade-renhet (~ 70%), är TFA-klyvd, löser sig lätt i vatten och innehåller en C-terminal amid (-NH2) för att öka in vivo-stabiliteten 14. Peptidalikvoter tinades aldrig och frystes på nytt mer än två gånger och förvarades vid -20 °C tills de användes. - Förbered 100 ml kikhosttoxinbuffert: Lös upp 2,9 g NaCl i 80 ml 1x Ca 2+/Mg 2+ fri PBS och tillsätt 100 μl 10% Triton X-100. Justera volymen till 100 ml med PBS och sterilisera lösningen genom att leda den genom ett 0,2 μm filter. Förbered 10 ml alikvoter och förvara vid 4 °C tills de används.
2. Beredning av CFA/peptidemulsioner
- Beräkna mängden emulsion som behövs för immunisering. I detta standardprotokoll får varje mus 50 μg MOG35-55 peptid och 300 μg M. tuberkulos dispergerad i Freunds adjuvans (CFA). Mängden av varje reagens (MOG35-55 peptid, PBS, CFA och IFA) som krävs för framställning av emulsionerna kan beräknas med hjälp av tilläggsfil 1. Ytterligare 20% av alla reagenser, för att kompensera för den lilla förlusten av emulsion, ingår i beräkningen.
OBS: Den kommersiella emulsionssatsen (se materialtabell) som används i denna studie består av ett rör, skruvlock och en kolv i en steriliserad påse. Varje rör i emulsionssatsen rymmer högst 9,6 ml, vilket gör det möjligt att förbereda 8 x 1 ml sprutor som är tillräckliga för att immunisera 40 möss (eller 80 möss om man använder 100 μl emulsion per djur). - Placera skruvkapsylröret (från den kommersiella emulsionssatsen) och reagenserna som ska användas på is.
- Tillsätt emulsionskomponenterna i följande ordning i volymerna beräknade i steg 2.1: PBS, sedan peptiden, sedan M. tuberkulos i CFA och slutligen IFA.
- Stäng röret med locket ordentligt genom att dra åt och lossa det flera gånger. Skaka röret kraftigt i 5-10 s för hand för att förblanda reagenserna.
- Placera röret i skakningshomogenisatorn och säkra det med stången. Ställ in hastigheten till den högsta inställningen och tiden till 60 s. När körningen är klar, placera röret på is i 3 minuter. Upprepa körningen en eller två gånger till med samma inställningar.
- Centrifugera röret vid 300 x g i 1 min för att avlägsna instängd luft och komprimera emulsionen.
- Ta bort locket från röret, sätt in kolven i röret och tryck ner det långsamt tills det når toppen av emulsionen. Ta bort snäppet av stängningen längst ner på röret genom att vrida det.
- Ta bort kolven från en injektionsspruta (1 ml; se materialförteckning). Tillsätt en nål (helst 25-27 G) till injektionssprutan.
- Fäst den bakre änden av injektionssprutan på det dedikerade låset längst ner på röret och lås det med en kort vridning.
- Överför emulsionen från röret till injektionssprutan genom att trycka försiktigt på kolven. Sluta när emulsionen når 0,15 ml gradering av injektionssprutan.
- Separera injektionssprutan från röret och sätt in kolven försiktigt, se till att ingen luft kommer in i sprutan. Tryck på kolven tills emulsionen kommer ut ur nålen.
OBS: Vid denna tidpunkt kan en del av emulsionen användas för kvalitetskontroll (se steg 3). - Upprepa steg 2.8-2.11 för resten av emulsionen som finns i röret.
OBS: För att minimera slöseriet med dyra CFA/antigenemulsioner bör 1 ml sprutor användas. Andra sprutor som passar det dedikerade låset längst ner på röret kan användas; En större volym emulsion kan dock behöva beredas. CFA/MOG35-55 peptidemulsionen kan förvaras vid 4 °C i upp till 15 veckor utan att förlora sin EAE-inducerande kapacitet.
3. Kvalitetskontroll av emulsion
- Dropptest: Tillsätt en liten droppe av emulsionen i ett sterilt 50 ml koniskt rör fyllt med 20 ml kallt vatten. Stäng röret och skaka det för hand i några sekunder. Utseendet på små distinkta droppar bekräftar bildandet av en vatten-i-olja-emulsion.
- Undersök emulsionen med faskontrastmikroskopi.
- För att analysera storleken på vatten-i-oljepartiklarna, tillsätt en liten droppe (2-3 μL) av emulsionen till ett mikroskopglas, smörj ut det med en täckglidning och tryck sedan hårt i en cirkulär rörelse för att platta ut emulsionen.
- Undersök den utsmyckade emulsionen under ett faskontrastmikroskop (se Materialförteckning) med 400x förstoring och fokusera på ett fält med ett monolager av emulsionen. Se till att små enhetliga grå/vita partiklar är synliga (figur 2A).
- Analysera emulsionspartikelstorleken med laserdiffraktion.
OBS: Laserdiffraktion mäter partikelstorleksfördelningar med hjälp av en laserstråle. Detta är det ultimata kvalitetskontrolltestet för emulsioner. Ett representativt resultat av partikelstorleksfördelningar med den metod som beskrivs här visas i figur 2B (för en detaljerad beskrivning, se Topping et al.6). Dropptestet och mikroskopundersökningen är dock tillräckliga för att validera om en tillfredsställande emulsion har bildats.- Ställ in brytningsindexen för både röda och blå lasrar för dispergeringsmedlet (se materialtabellen) till 1,456 och för provet till 1,33 på partikelstorleksanalysatorn (se materialförteckningen). Ställ in absorbansen för brytningsindexet till 0,02.
- Tillsätt en droppe från sprutan som innehåller peptidemulsionen till dispersionsenheten som innehåller lätt mineralolja. Starta datainsamlingen direkt efter spridning av emulsionen.
OBS: En generell modell tillämpades, och sfäriska partiklar antogs, för uppskattning av partikelstorleksfördelning.
4. EAE-induktion med MOG 35-55 peptidemulsionen i C57BL6 / J-möss
OBS: I alla experiment användes fem 8-12 veckor gamla kvinnliga C57BL6 / J-möss.
- Före immunisering, bedöva mössen med 2,5% förångad isofluran och bekräfta med en fast tåklämma.
- Injicera varje mus subkutant med 1 ml sprutor på två olika ställen, på höger och vänster sida av bakflanken med 200 μL emulsion innehållande 50 μg MOG35-55 peptid i ett 1:1 (v/v) förhållande mellan peptid och CFA.
- Minst 1,5 h efter immuniseringen med emulsionen, och sedan igen efter 24 timmar, administrera totalt 80 ng Bordetella pertussistoxin i 200 μl kikhosttoxinbuffert till varje mus genom intraperitoneala injektioner (100 μL till vänster och 100 μL på höger sida av magen).
OBS: Exakt lokalisering av intraperitoneal injektion med kikhosttoxin har visat sig vara avgörande för aktivering av T-celler i den dränerande lymfkörteln15. - Valfritt: Injicera MOG35-55 peptid igen på dag 7 (som används i vissa protokoll16) genom att upprepa steg 4.2.
OBS: Viktigast av allt, se till att sprutorna och nålarna som används för immunisering som innehåller MOG / CFA eller kikhosttoxin bortskaffas på ett adekvat sätt i biohazardpåsar / behållare. - Utvärdera den kliniska poängen dagligen med hjälp av en skala från 0-6 som tidigare beskrivits6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det snabba, enkla och standardiserade protokollet för beredning av CFA/MOG-emulsioner visas i figur 1. Denna metod har nyligen beskrivits på annat håll6. CFA/MOG-emulsionerna kan också framställas med andra metoder, såsom den traditionella sprutmetoden eller genom virvel. Dessa metoder jämfördes här genom att bedöma kvaliteten på emulsionerna. Alla metoder producerade vatten-i-olja-emulsioner; Homogeniteten och kvaliteten på dessa emulsioner bedömdes genom att tillsätta en liten droppe på ett glasglas följt av observation under ett faskontrastmikroskop. Emulsioner framställda med skakningshomogeniseringsmetoden visade grå/vita bönformade partiklar, som representerar små droppar vatten-i-olja-emulsioner. Däremot var emulsionsdropparna som producerades med sprutmetoden större och vitare. I virvelmetoden observerades stora grå/svarta partiklar, motsvarande luftbubblor som fångats i emulsionen (figur 2A).
För att testa den långsiktiga stabiliteten hos vatten-i-olja-emulsioner kan förändringarna i partikelstorleksfördelningen över tid mätas med hjälp av en laserdiffraktionspartikelstorleksanalysator. Emulsioner framställda med det standardiserade protokollet som beskrivs här visade ingen förändring i partikelstorlek under en period av 6 veckor (figur 2B). Därför testades möjligheten att emulsioner innehållande MOG35-55-peptiden kan lagras vid 4 °C under en längre tid och fortfarande inducera sjukdom. Emulsioner innehållande CFA/MOG35-55-peptiden framställdes med denna metod och användes omedelbart eller förvarades vid 4 °C i 3 eller 15 veckor (figur 3A). Möss injicerades med 50 μg MOG35-55 peptid och fick poäng för kliniska tecken på sjukdom enligt beskrivningen i protokollet. Anmärkningsvärt nog inducerade de färska, 3 veckor gamla och 15 veckor gamla emulsionerna alla liknande EAE-sjukdom hos alla djur som testades under hela experimentet (figur 3A). Således avslöjade dessa resultat att emulsioner innehållande MOG35-55 peptider framställda med användning av skakningshomogeniseringsmetoden kan lagras i minst 15 veckor och fortfarande inducera EAE med sjukdomspoäng jämförbara med de som uppnås med nyberedda emulsioner.
För att förenkla och påskynda installationen av experimenten och för att undvika skillnad mellan reagenser mellan partier förbereddes, alikvoterades och lagrades alla nödvändiga komponenter vid lämplig temperatur i förväg. Därefter utfördes fem experiment under en period av 6 månader. C57BL6 / J-möss immuniserades med MOG / CFA-emulsionerna som framställdes på immuniseringsdagen, med hjälp av emulsionssatser och utvärderades för kliniska symtom. Möss utvecklade ett liknande sjukdomsmönster i alla experiment (figur 3B), vilket avslöjade att homogeniseringsmetoden som presenteras här producerade emulsioner som inducerade EAE på ett konsekvent och reproducerbart sätt.
Den totala beredningstiden, från att hämta alla reagenser, tillsätta dem och skaka röret tre gånger och ladda sprutorna med emulsionen, redo för immunisering, tar inte mer än 30 min. Dessutom behöver endast 20% av extra emulsion beredas. Detta står i skarp kontrast till andra protokoll, där beredningstiden kan vara upp till 1,5-2 h och 50% -100% extra emulsion kan behöva förberedas för att säkerställa tillräckligt med material för immunisering16.
Figur 1: Schematisk över processen för emulsionsberedning med användning av en kommersiell emulsionssats. Denna siffra har återanvänts från Topping etal 6 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Karakterisering av emulsioner framställda med olika metoder. (A) Representativa bilder från tre olika beredningsmetoder: standardhomogeniseringsmetod, traditionell sprutmetod och virvelmetod. En liten mängd emulsion placerades på en glasskiva och observerades under ett faskontrastmikroskop (400x). Skalstreck = 50 μm. En representativ beredning visas av varje metod från >15 experiment. Medelvärdet D [4, 3] (det volymvägda medelvärdet) mättes med en partikelstorleksanalysator till 0,7 μm för skakningshomogeniseringsmetoden, 1,4 μm för sprutmetoden och 5,4 μm för virvelmetoden. (B) Emulsionens stabilitet över tid mättes med hjälp av partikelstorleksanalysatorn. En emulsion av CFA/PBS framställdes med skakningshomogenisatorn och emulsionssatsen, och partikelstorleken bestämdes med användning av laserdiffraktion över tid. Ett prov analyserades omedelbart och sedan lagrades emulsionerna vid 4 °C. Dessa prover analyserades 1, 2, 4 och 6 veckor efter beredning. Det genomsnittliga D [4, 3] volymvägda medelvärdet för alla prover var 0,73 μm ± 0,03 μm (SD). Denna siffra har återanvänts från Topping etal 6 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: EAE-induktion hos möss immuniserade med en MOG35-55 peptid / CFA-beredning med hjälp av ett kommersiellt emulsionssats. (A) EAE-induktion av den lagrade emulsionen. Emulsioner innehållande CFA och 50 μg MOG35-55 peptid/mus framställdes med homogeniseringsmetoden och lagrades vid 4 °C i 3 eller 15 veckor. De nyberedda och lagrade emulsionerna injicerades samma dag i C57BL/6J-möss (n = 5 per grupp). Mössen fick 80 ng kikhostetoxin samma dag och 24 timmar senare, och fick poäng för tecken på sjukdom med hjälp av kliniska poäng från 0-6. B) Konsekvent induktion av EAE med de emulsioner som framställts med homogeniseringsmetoden. Emulsioner innehållande CFA och 50 μg MOG35-55 peptid/mus framställdes vid olika tidpunkter och injicerades i C57BL/6J-möss (n = 5 per grupp). Mössen fick 80 ng kikhostetoxin samma dag och 24 timmar senare, och fick poäng för tecken på sjukdom. Denna siffra har återanvänts från Topping etal 6 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tilläggsfil 1: Beräkning av mängden av varje reagens (MOG35-55 peptid, PBS, CFA och IFA) för emulsionsberedning. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vatten-i-olja-emulsioner, såsom antigen/Freunds adjuvans, har använts i mer än ett halvt sekel för att inducera EAE17. Det finns för närvarande ingen standardiserad metod för att framställa antigenemulsioner som är oberoende av mänsklig påverkan. Manuell blandning med sprutor är standard för de flesta laboratorier, men denna metod är tidskrävande, resulterar ofta i en överdriven förlust av material och kvaliteten skiljer sig beroende på forskaren som förbereder den.
Metoden som presenteras i detta manuskript använder en standardskakningshomogeniseringsmaskin för att bereda antigen / CFA-emulsionerna. Dessutom kan alla reagenser som används här alikvoteras och lagras under en lång tid, vilket gör det bekvämt och snabbt att förbereda emulsioner. Den totala tiden för beredning av emulsioner för upp till 80 möss är cirka 30 min. Detta står i skarp kontrast till andra publicerade metoder, som kräver 1-1,5 h för beredning av MOG35-55 emulsioner16,18. Andra manuella metoder, såsom den ena sprutmetoden, är ofta förknippade med införandet av luftbubblor i sprutorna5. Metoden som presenteras här har utformats så att emulsionen skjuts in i sprutor från deras bakre ände, vilket eliminerar införandet av luftbubblor och minimerar materialförlusten.
För att säkerställa konsekventa resultat och minimalt slöseri med emulsion finns det några kritiska steg i skakningshomogeniseringsmetoden som kräver särskild uppmärksamhet. Röret och reagenserna ska placeras på is innan experimentet påbörjas och efter homogeniseringssteget. PBS och antigen bör tillsättas till röret först, följt av adjuvansen (CFA/IFA), för att undvika höga lokala koncentrationer av antigen vid blandning med oljeadjuvansen. Locket ska dras åt ordentligt genom att öppna och stänga det ett par gånger för att undvika läckage. Dessutom bör sprutan inte fyllas med emulsionen helt, bara till 0,15 ml på sprutcylindern för att undvika slöseri med emulsionen. Kolven ska sättas in i sprutan mycket försiktigt med båda händerna. När alla sprutor är fyllda med emulsionen kan sprutorna förvaras i rumstemperatur om de ska användas samma dag. I annat fall bör de förvaras vid 4 °C tills de används.
Antigen/CFA-emulsioner framställda med skakningshomogeniseringsmetoden kan verka mindre fasta jämfört med de som framställts med sprutmetoden. Ett ytterligare skakningssteg kan läggas till (se steg 2.5 i protokollet), vilket kan tjockna emulsionen. Emulsioner som klarar "dropptestet" och faskontrastmikroskopundersökningen inducerar emellertid EAE oavsett emulsionens fysiska tillstånd.
Den initiala investeringen som krävs i en skakningshomogeniseringsmaskin är en begränsning. Beredningsstegen som beskrivs här säkerställer emellertid minimalt slöseri med emulsion och antigenet, vilket ofta är dyrt att köpa eller tar lång tid att förbereda. Därför är denna metod på lång sikt billigare att använda eftersom den sparar tid och reagens. Antigenet och bufferten som används i skakningshomogeniseringsmetoden kan påverka emulsionens kvalitet. MOG35-55-peptiden upplöst i PBS utan Ca 2+/Mg 2+ genererade konsekvent emulsioner med små enhetliga vatten-i-olja-partiklar (figur 2A). Peptidantigener upplösta i PBS med Ca 2+/Mg2+, eller peptider som innehåller många laddade aminosyrarester kan emellertid generera emulsioner som är mindre viskösa. Huruvida sådana emulsioner är mindre benägna att inducera sjukdom i djurmodeller har inte testats. En annan begränsning med denna metod är att högst 8 ml antigen / CFA-emulsion kan framställas från ett rör. Rören ska inte laddas med mer än 9,6 ml totalt (4,8 ml PBS/antigen och 4,8 ml CFA/IFA), vilket är tillräckligt för att ladda åtta 1 ml sprutor. Även om röret kan hålla en större volym måste viss luft finnas i röret, annars genereras inte perfekta emulsioner. Om mer emulsion behövs kan den beredas med hjälp av ytterligare rör.
Jämfört med befintliga metoder finns det ingen person-till-person-skillnad vid framställning av emulsionerna med skakningshomogeniseringsmetoden. Den vanligaste metoden för att förbereda emulsioner för EAE-experiment använder sprutor som skjuts fram och tillbaka för hand19. Kraften, tiden och temperaturen kan inte kontrolleras väl, och det är därför svårt att standardisera en sprutbaserad metod. Andra metoder för att göra vatten-i-olja emulsioner dra nytta av ultraljud vatten-bad sonicators. Emulsioner framställda med en ultraljudsbehandling metod kan inducera EAE i annars resistenta BALB/c möss8. Den beskrivna metoden skulle kunna vara standardiserad och därför användbar. Problemet med ultraljud vatten-bad och ultraljud sond sonicators är dock att det är svårt att överföra emulsionen i rören till sprutor som används för immunisering utan att införa luftbubblor. Rören som används för metoden som presenteras här eliminerar detta problem.
En virvelmetod kan betraktas som en standardiserad metod med en bestämd hastighet, tid och temperatur. Att testa denna metod för att framställa en emulsion genom att virvla MOG/CFA-preparatet i 10 minuter resulterade dock inte i någon sjukdomsinduktion hos C57BL/6J-möss (data visas inte). Ändå kan EAE induceras med en antigen/CFA-blandning framställd genom virvel i 45 min18, vilket skulle vara ett mycket längre förfarande jämfört med den metod som presenteras i detta manuskript.
Ett annat oljebaserat adjuvans (se materialförteckning), godkänt av FDA för att användas på människor, som producerar en vatten-i-olja-emulsion har visat sig vara ett lovande adjuvans för cancer- och malariavacciner20,21,22. Därför kan det standardiserade protokollet som presenteras här anpassas för användning i kliniken. Preliminära experiment har visat att skakningshomogeniseringsmetoden genererar emulsioner med denna FDA-godkända olja som är av bättre kvalitet jämfört med den manuella sprutmetoden (data visas inte).
Sammanfattningsvis ger skakningshomogeniseringsmetoden som presenteras här ett antal fördelar, såsom snabbare generering av kvalitetskontrollerade emulsioner, hög reproducerbarhet i ett antal autoimmuna sjukdomsmodeller och en minskning av dyra reagenser som behövs för att framställa antigen / CFA-emulsioner. Eftersom det inte finns någon skillnad mellan person som genererar dessa vatten-i-oljeemulsioner, erbjuder det möjligheten att standardisera denna metod som behövs för reproducerbar biomedicinsk forskning och läkemedelsupptäckt inom området autoimmuna sjukdomar och terapeutisk vaccinutveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
BTB Emulsions AB har lämnat in en patentansökan för användning av en anordning och metod för beredning av emulsioner för immunisering samt djur och människor (europeiskt patentansökningsnummer: EP3836884A1). BTB är VD och grundare av företaget och aktieägare i BTB Emulsions. Bertin-Instruments distribuerar de emulsionssatser som används i denna publikation över hela världen.
Acknowledgments
Författaren vill uppmärksamma djurhållningsenheterna vid Lunds universitet, Camilla Björklöv och Agnieszka Czopek, för deras stöd, och Richard Williams, Kennedy Institute of Rheumatology, University of Oxford, Storbritannien, för konstruktiv kritik och språkligt stöd för att producera detta manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Injection syringe | B. Braun | 9166017V | |
| 1 mL Injection syringe | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
| 7 ml empty tubes with caps | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | 7 mL tube |
| 50 mL sterile centrifuge tube | Fisher Scientific | 10788561 | 50 mL tube |
| Bordetella pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P2980 | Store at -20 °C |
| Dispersant, light mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Store at RT |
| Emulsion kit | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | Containing a tube, cap, and plunger |
| Incomplete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C |
| Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Store at +4 °C |
| Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | Particle size analyzer |
| Minilys-Personal homogenizer | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | Shaking homogenizer |
| MOG 35-55 Peptide | Innovagen | N/A | |
| Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | FDA-approved oil adjuvant |
| Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm | Fisher Scientific | 17124381 | Sterlie filter |
| PBS, Ca2+/Mg2+ free | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| Phase-Constrast Microscope | Olympus | BX40-B | |
| Steel Beads 3.2 mm | Fisher Scientific | NC0445832 | Autoclave and store at RT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | Store at RT |
References
- Walton, C., et al. Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition. Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).
- van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers. Frontiers in Immunology. 11, 760 (2020).
- Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells' Multiple Identities in Neuroimmunity. Frontiers in Immunology. 10, 2947 (2019).
- Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. Animal models of multiple sclerosis--potentials and limitations. Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).
- Terry, R. L., Ifergan, I., Miller, S. D.
- Topping, L. M., et al. Standardization of antigen-emulsion preparations for the induction of autoimmune disease models. Frontiers in Immunology. 13, 892251 (2022).
- Flies, D. B., Chen, L. A simple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 276 (1-2), 239-242 (2003).
- Määttä, J. A., Erälinna, J. P., Röyttä, M., Salmi, A. A., Hinkkanen, A. E. Physical state of the neuroantigen in adjuvant emulsions determines encephalitogenic status in the BALB/c mouse. Journal of Immunological Methods. 190 (1), 133-141 (1996).
- Moncada, C., Torres, V., Israel, Y. Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 162 (1), 133-140 (1993).
- Waksman, B. H., Adams, R. D. Allergic neuritis: an experimental disease of rabbits induced by the injection of peripheral nervous tissue and adjuvants. The Journal of Experimental Medicine. 102 (2), 213-236 (1955).
- Vladutiu, A. O., Rose, N. R. Autoimmune murine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type. Science. 174 (4014), 1137-1139 (1971).
- Caspi, R. R. Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse. Current Protocols in Immunology. , Chapter 15 Unit 15.6 (2003).
- Tuzun, E., et al. Guidelines for standard preclinical experiments in the mouse model of myasthenia gravis induced by acetylcholine receptor immunization. Experimental Neurology. 270, 11-17 (2015).
- Brinckerhoff, L. H., et al. Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines. International Journal of Cancer. 83 (3), 326-334 (1999).
- Kool, M., et al. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells. The Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 869-882 (2008).
- Hasselmann, J. P. C., Karim, H., Khalaj, A. J., Ghosh, S., Tiwari-Woodruff, S. K. Consistent induction of chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice for the longitudinal study of pathology and repair. Journal of Neuroscience Methods. 284, 71-84 (2017).
- Freund, J., Lipton, M. M. Experimental allergic encephalomyelitis after the excision of the injection site of antigen-adjuvant emulsion. The Journal of Immunology. 75 (6), 454-459 (1955).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).
- Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. Journal of Visualized Experiments. (62), e3778 (2012).
- Arevalo-Herrera, M., et al. Randomized clinical trial to assess the protective efficacy of a Plasmodium vivax CS synthetic vaccine. Nature Communications. 13 (1), 1603 (2022).
- Jiang, C., et al. Potential association factors for developing effective peptide-based cancer vaccines. Frontiers in Immunology. 13, 931612 (2022).
- Neninger Vinageras, E., et al. Phase II randomized controlled trial of an epidermal growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (9), 1452-1458 (2008).
