Modell der Ischämie und Reperfusionsschädigung bei Kaninchen

Summary

Die vorliegende Studie zeigt ein hochgradig reproduzierbares Tiermodell der akuten regionalen myokardialen Ischämie und Reperfusionsschädigung bei Kaninchen unter Verwendung einer linken Mini-Thorakotomie für Überlebensfälle oder einer Mittellinien-Sternotomie für Nicht-Überlebensfälle.

Abstract

Das vorliegende Protokoll bietet eine einfache, hochgradig replizierbare Methodik zur Induktion einer akuten regionalen myokardialen In-situ-Ischämie beim Kaninchen für Nicht-Überlebens- und Überlebensexperimente. Das ausgewachsene neuseeländische weiße Kaninchen wird mit Atropin, Acepromazin, Butorphanol und Isofluran sediert. Das Tier wird intubiert und mechanisch beatmet. Für die Infusion von Medikamenten wird ein intravenöser Katheter in die marginale Ohrvene eingeführt. Das Tier wird mit Heparin, Lidocain und Ringer-Laktationslösung vorbehandelt. Es wird eine Verkleinerung der Halsschlagader durchgeführt, um einen arteriellen Zugang zur Blutdrucküberwachung zu erhalten. Ausgewählte physiologische und mechanische Parameter werden durch kontinuierliche Echtzeitanalyse überwacht und aufgezeichnet.

Wenn das Tier sediert und vollständig betäubt ist, wird entweder eine vierte Thorakotomie im kleinen linken Interkostalraum (Überleben) oder eine Sternotomie in der Mittellinie (Nicht-Überleben) durchgeführt. Der Herzbeutel wird eröffnet und die linke vordere absteigende Arterie (LAD) lokalisiert.

Ein Polypropylen-Nahtmaterial wird um den zweiten oder dritten diagonalen Ast der LAD-Arterie geführt, und das Polypropylen-Filament wird durch ein kleines Vinylrohr gefädelt, wodurch eine Schlinge entsteht. Das Tier wird einer 30-minütigen regionalen Ischämie ausgesetzt, die durch Verschluss der LAD durch Anziehen der Schlinge erreicht wird. Die myokardiale Ischämie wird visuell durch eine regionale Zyanose des Epikards bestätigt. Nach einer regionalen Ischämie wird die Ligatur gelockert und das Herz kann wieder durchblutet werden.

Sowohl für Überlebens- als auch für Nicht-Überlebensexperimente kann die Myokardfunktion über eine echokardiographische (ECHO) Messung der fraktionellen Verkürzung beurteilt werden. Für Nicht-Überlebensstudien können kontinuierlich Daten aus der Sonomikrometrie erfasst werden, die mit drei digitalen piezoelektrischen Ultraschallsonden gesammelt wurden, die in den ischämischen Bereich implantiert wurden, und der linke Ventrikel entwickelte Druck (LVDP) mit einem apikal eingeführten Katheter des linken Ventrikels (LV) zur Bewertung der regionalen bzw. globalen Myokardfunktion erfasst werden.

Für Überlebensstudien wird der Schnitt geschlossen, eine Thorakozentese der linken Nadel zur Evakuierung der Pleuraluft durchgeführt und eine postoperative Schmerzkontrolle erreicht.

Introduction

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind die häufigste Todesursache weltweit und tragen jedes Jahr zu über 18 Millionen Todesfällen bei ^1,2,3. Ein akuter Myokardinfarkt (MI) ist ein häufiger medizinischer Notfall, der entsteht, wenn ein Blutgerinnsel oder ein Stück atheromatöser Plaque den Blutfluss einer Koronararterie blockiert. Dies führt zu einer regionalen myokardialen Ischämie in dem Gebiet, das die Arterie durchblutet.

Die vorliegende Studie beschreibt ein Protokoll, das eine einfache und zuverlässige Methodik verwendet, um in situ eine akute regionale myokardiale Ischämie de einem Kaninchenmodell für Nicht-Überlebens- und Überlebensexperimente zu erzeugen. Das ursprüngliche Ziel dieser Methode war es, die Auswirkungen einer mitochondrialen Transplantation auf die Modulation der Myokardnekrose und die Erhöhung der postischämischen Herzfunktion nach einem ischämischen Ereignis zu untersuchen. Frühere Forschungen haben das Auftreten von mitochondrialen Veränderungen und einen raschen Abfall des energiereichen Phosphatspiegels nach dem Einsetzen einer Ischämie und einer Verringerung der Sauerstoffversorgung gezeigt, was zu einer drastischen Abnahme der kardialen Energiespeicher führt⁴. Die Forscher haben versucht, die postischämische Funktion zu verbessern und die Nekrose des Myokardgewebes durch pharmakologische Interventionen und/oder Verfahrenstechniken zu verringern, aber diese Techniken bieten eine begrenzte Kardioprotektion und haben nur minimale Auswirkungen auf mitochondriale Schäden und Funktionsstörungen ^5,6,7. Unser Team und andere haben bereits gezeigt, dass mitochondriale Schäden hauptsächlich während der Ischämie auftreten und dass die kontraktile Erholung verbessert und die Größe des Myokardinfarkts verringert werden kann, wenn die mitochondriale Atmungsfunktion während der Reperfusion erhalten bleibt ^8,9,10. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass eine mitochondriale Transplantation aus Geweben, die nicht von einer Ischämie betroffen sind, in den Bereich der Ischämie vor der Reperfusion einen alternativen Ansatz zur Verringerung der Myokardnekrose und zur Verbesserung der Myokardfunktion darstellen würde. Im Folgenden beschreiben wir das Protokoll, das zum Testen dieser Theorie verwendet wurde, und die repräsentativen Ergebnisse, die wir aus unserer ersten Studienanalyse erhalten haben.

Darüber hinaus haben sich mehrere Forscher auf andere Themen konzentriert, die für die Definition der Auswirkungen von Myokardischämie-Reperfusionsschäden und die Etablierung geeigneter therapeutischer Interventionen von wesentlicher Bedeutung sind. Ein solches Forschungsgebiet ist das der Präkonditionierung. Die myokardiale ischämische Präkonditionierung ist ein kardioprotektiver Mechanismus, der durch kurzen ischämischen Stress aktiviert wird und zu einer Verringerung der Rate der Herzzellnekrose während nachfolgender Episoden anhaltender Ischämie führt. Diese Mechanismen können entweder durch Hypoxie oder Koronarverschluss aktiviert werden. Mandel et al. zeigten, dass die hypoxisch-hyperoxische Vorkonditionierung dazu beitrug, das Gleichgewicht der Stickstoffmonoxid-Metaboliten aufrechtzuerhalten, die Endothelin-1-Überproduktion zu reduzieren und den Organschutz zu unterstützen¹¹. Darüber hinaus wurde das Konzept der fernischämischen Präkonditionierung untersucht, ein Phänomen, bei dem die Präkonditionierung eines einzelnen Organs einen systemischen Schutz bietet. Ali et al. fanden heraus, dass bei Patienten, die sich einer elektiven Reparatur eines offenen Bauchaortenaneurysmas unterzogen, eine Fernpräkonditionierung, die durch intermittierendes Kreuzklemmen der Arteria iliaca als Stimulus durchgeführt wurde, die Inzidenz von postoperativen Myokardverletzungen, Myokardinfarkten und Nierenfunktionsstörungen reduzierte¹².

Kaninchenmodelle bieten potenzielle Vorteile gegenüber Modellen mit anderen Spezies und werden seit Jahrzehnten in verschiedenen Szenarien eingesetzt, darunter die Induktion von Arrhythmien, globale und regionale ischämische Modelle und die Herzkontraktionsforschung, unter anderem^13,14,15. Obwohl das Kaninchenherz kleiner ist als das eines Hundes oder Schweins, ist es groß genug, um chirurgische Eingriffe zu viel geringeren Kosten durchzuführen¹³. Das Kaninchenherz wird oft verwendet, da es dem menschlichen Herzen sehr ähnlich ist. In der Tat hat es eine ähnliche Stoffwechselrate, exprimiert β-Myosin-Schwerkette und es fehlt eine signifikante myokardiale Xanthinoxidase¹⁶. Die hierin beschriebene Technik zur Induktion einer regionalen myokardialen Ischämie ist einfach, wiederholbar und kostengünstig. Diese Methode ermöglicht sowohl Nicht-Überlebens- als auch Überlebensfälle, da nur eine regionale Ischämie und keine globale Ischämie induziert wird und die benötigten Materialien nicht spezialisiert sind. Es können zwei verschiedene chirurgische Ansätze (Sternotomie und Mini-Thorakotomie) verwendet werden, wodurch der Operateur und die experimentellen Protokolle mehr Freiheit in Bezug auf das Studiendesign erhalten. Darüber hinaus erfordert das Verfahren keinen kardiopulmonalen Bypass. In diesem Zusammenhang sind minimalinvasive Ansätze zur Bypass-Transplantation von Koronararterien zu wertvollen Alternativen für Patienten geworden, die ein Multigefäß-Revarskularizaiton benötigen^17,18. Dieses Modell könnte verwendet werden, um die Unterschiede zwischen diesen Ansätzen zu untersuchen und ein tierbasiertes Lernwerkzeug für chirurgische Auszubildende bereitzustellen. Darüber hinaus kann die Durchführung einer Herzkatheteruntersuchung mit diesem Modell für die physiologische Forschung und/oder das chirurgische Training nützlich sein.

Unser Modell bietet eine Methodik für Anwendungen, bei denen die Induktion einer regionalen myokardialen Ischämie und die anschließende Messung der Infarktgröße, der Myokardfunktion und der zellulären Veränderungen von Bedeutung sind. Mit diesem Protokoll waren wir in der Lage, mehrere Marker der zellulären Funktion und Anpassung an Ischämie und die vorgeschlagene therapeutische Intervention (d.h. mitochondriale Transplantation) zu evaluieren, indem wir die Internalisierung von Organellen, den Sauerstoffverbrauch, die hochenergetische Phosphatsynthese und die Induktion von Zytokinmediatoren und Proteomwegen untersuchten. Diese Ergebnisse sind wichtig für die Erhaltung der myokardialen Energetik, der Zelllebensfähigkeit und der Herzfunktion und ermöglichen die objektive Bewertung kardioprotektiver Techniken nach Ischämie-Reperfusionsverletzungen. Dieses Modell könnte verwendet werden, um ähnliche biologische Signalwege und Alternativen im Bereich der postischämischen Myokardpathologie und Genesung zu untersuchen.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine hochgradig reproduzierbare Methodik zur Induktion einer akuten regionalen myokardialen Ischämie beim Kaninchen für Nicht-Überlebens- und Überlebensexperimente bereitzustellen. Dieses Modell bietet eine Methodik mit hohem Überleben, niedriger intraoperativer Mortalität und minimaler Morbidität¹⁹. Andere Modelle für akute regionale myokardiale Ischämie wurden mit radioaktiv markierten Materialien, Kontrastmitteln, Magnetresonanztomographie oder Computersimulationen beschrieben^20,21,22. Unser Protokoll bietet eine zuverlässige und einfache Methodik, die kostengünstig und konsistent reproduzierbar ist und einen geringen technischen Aufwand hat und daher von Untersuchern ohne chirurgische Expertise durchgeführt werden kann. Dieses Protokoll ermöglicht entweder ein Überlebensprojekt mit einer linken Mini-Thorakotomie oder ein Nicht-Überlebensmodell mit einer Mittellinien-Sternotomie.

Protocol

Diese Untersuchung wurde gemäß den Richtlinien der National Institutes of Health zur Pflege und Verwendung von Tieren durchgeführt und vom Animal Care and Use Committee des Boston Children’s Hospital genehmigt (Protokoll 20-08-4247R). Alle Tiere erhielten eine humane Pflege in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren. 1. Tierarten, Anästhetika und Analgetika Tierarten: Verwenden Sie neuseeländische weiße Kaninchen (Wi…

Representative Results

Nach dem Protokoll (Abbildung 1) wurde die myokardiale Ischämie sofort durch die direkte Visualisierung einer Zyanose des Epikards bestätigt. Standard-EKGs (drei Extremitätenableitungen: I, II und III und drei berechnete erweiterte Ableitungen: aVL, aVR und aVF) wurden kontinuierlich vor der Ischämie, während der Ischämie und bei der Reperfusion aufgezeichnet (Abbildung 2). Die EKGs zeigen Tachykardie, Arrhythmien (d.h. Kammerfl…

Discussion

Unser Protokoll demonstriert eine zuverlässige Methodik zur Durchführung einer akuten regionalen myokardialen Ischämie beim Kaninchen. Die linke Mini-Thorakotomie ist ideal für Überlebensfälle, bei denen der Schnitt und die damit verbundenen Schmerzen minimiert werden müssen. Wichtig ist, dass eine diuretische Therapie vor der Extubation nicht notwendig war und es keine Mortalität intraoperativ in der Nicht-Überlebensgruppe oder 4 Wochen postoperativ in der Überlebensgruppe gab. Wenn das Design des Protokolls e…

Materials

#10 blade	Bard Parker	371210
#11 blade	Fisher Scientific	B3L
22 G PIV needle	BD Insyte	381423
Acepromazine	VETONE	NDC 13985-587-50	0.5 mg/kg IM and IV
Aline pressure bag	Infu-Stat	2139
Angiocath	Becton Dickinson	382512
Arterial Catheter	Teleflex	MC-004912
Atropine	Hikma Pharmaceuticals	NDC 0641-6006-01	0.01 mg/kg IM
Betadine and 70% isopropyl alcohol	McKesson	NDC 68599-2302-6
Blood gas machine	Siemens	MRK0025
Bovie	Valleylab	E6008
Bulldog clamps	World Precision Instruments	14119
Bupivacaine	Auromedics	NDC 55150-249-50	3 mg/kg IM
Butorphanol	Roxane	NDC 2054-3090-36	0.5 mg/kg IM
Clear acetate sheet	Oxford Instruments	ID 51-1625-0213
Clipers	Andis	AGC2
DeBakey forceps	Integra	P6280
Echocardiography machine	Philips	IE33 F1
Electrocardiography machine	Meditech	MD908B
Endotracheal tube	Medline	#922774
Fentanyl	West-Ward	NDC 0641-6030-01	1–4 µg/kg transdermal patch
Formaldehyde solution 10%	Epredia	94001
Glass plates	United Scientific	B01MUHX6MR
Heparin Sodium	Sagent	NDC 69-0058-02	1000U in 1 mL 3 mg/kg
Hot water blanket	3M	55577
Isoflurane	Penn Veterinary Supply, INC	NDC 50989-606-15	1%–3%
Ketamine	Dechra	NDC 42023-138-10	10 mg/kg IV
Lab Chart 7 Acquisition Software	Adinstruments
Lactated Ringer's solution	ICUmedical	NDC 0990-7953-09	10 mL/kg/h
Laryngoscope	Welch Allyn	68044
Left ventricule lumen catheter 3Fr	McKesson	385764-EA
Lidocaine (1%)	Pfizer	4276-01	1–1.5 mL/kg IV
LVDP transducer	Edward	PDP-ED
Marking pen	Viscot	1451SR-100 Unsterile
Mayo scissors	Mayo	S7-1098
Medetomidine	Entireoly Pets Pharmacy	NDC 015914-005-01	0.25 mg/kg IM
Metzenbaum scissors	Cole-Parmer	UX-10821-05
Monastra. Blue pigment 98%	Chemsavers	MBTR1100G
Monocryl 5-0	Ethicon	Y463G
Mosquito clamp	Shioda	802N
PDS 3-0	Ethicon	42312201
Piezoelectric sonomicrometry crystals	Sonometrics	Small 2mm round
Plegets	DeRoyal	32-363
Povuine Iodine Prep Solutions	Medline	MDS093940
Precision vaporized system face mask	Yuwell	B07PNH69BF
Prolene 3-0	Ethicon	8665G
Proline 5-0	Ethicon	8661G
Pulse oximetry probe	Masimo	9216-U
Rib spreader	Medline	MDS5621025
S12 Pediatric Sector Probe	Phillips	21380A
Sonomicrometer	Sonometrics	BZ10123724
Sterile gauze	Medline	3.00802E+13
Sterile towels	McKesson	MON 277860EA
Sternal retractor	Medline	MDS5610321
Sutures for closure	J&J Dental	8698G
Telemetriy monitor	Meditech	MD908B
Temperature probe	Omega	KHSS-116G-RSC-12
Triphenyl tetrazolium chloride (1%)	Millipore	MFCD00011963
Ventilator	MedGroup	MSLGA 11
Vicryl 2-0	Ethicon	V635H
Vinyl tubing	ABE	DISW 3001