Модель ишемического и реперфузионного повреждения у кроликов

Summary

Настоящее исследование демонстрирует высоковоспроизводимую животную модель острой регионарной ишемии миокарда и реперфузионного повреждения у кроликов, использующих левую мини-торакотомию для случаев выживания или срединную стернотомию для случаев невыживаемости.

Abstract

Протокол предоставляет простую, легко воспроизводимую методологию индуцирования острой регионарной ишемии миокарда in situ у кролика для экспериментов без выживания и выживания. Новозеландского белого взрослого кролика усыпляют атропином, ацепромазином, буторфанолом и изофлураном. Животное интубируют и помещают на искусственную вентиляцию легких. Внутривенный катетер вводится в краевую ушную вену для инфузии лекарственных препаратов. Животное предварительно лечат гепарином, лидокаином, лактационным раствором Рингера. Срез сонной артерии проводится для получения доступа к артериальному катетеру для мониторинга артериального давления. Выбранные физиологические и механические параметры контролируются и регистрируются с помощью непрерывного анализа в режиме реального времени.

После того, как животное находится под седативным препаратом и под полным наркозом, выполняется либо торакотомия в четвертом межреберье (выживаемость), либо стернотомия по средней линии (невыживаемость). Вскрывается перикард и располагается левая передняя нисходящая артерия.

Полипропиленовый шов пропускается вокруг второй или третьей диагональной ветви артерии LAD, и полипропиленовая нить продевается через небольшую виниловую трубку, образуя петлю. Животное подвергается 30-минутной регионарной ишемии, достигаемой окклюзией LAD путем затягивания силка. Ишемия миокарда подтверждается визуально регионарным цианозом эпикарда. После регионарной ишемии лигатуру ослабляют, и сердцу дают возможность повторной перфузии.

Как в экспериментах с выживаемостью, так и без выживания функция миокарда может быть оценена с помощью эхокардиографии (ЭХО) для измерения фракционного укорочения. Для исследований, не связанных с выживаемостью, данные сономикрометрии, собранные с помощью трех цифровых пьезоэлектрических ультразвуковых зондов, имплантированных в область ишемии, и давление развития левого желудочка (LVDP) с помощью апикально введенного катетера левого желудочка (ЛЖ) могут быть непрерывно получены для оценки региональной и глобальной функции миокарда соответственно.

Для исследований выживаемости разрез закрывают, выполняют торакоцентез левой иглой для эвакуации воздуха из плевры и достигают послеоперационного контроля боли.

Introduction

Сердечно-сосудистые заболевания являются ведущей причиной смерти в мире и ежегодно приводят к более чем 18 миллионам случаев смерти ^1,2,3. Острый инфаркт миокарда (ИМ) является распространенным неотложным состоянием, которое развивается, когда тромб или кусочек атероматозной бляшки блокирует кровоток коронарной артерии. Это вызывает регионарную ишемию миокарда на территории, которую перфузирует артерия.

В настоящем исследовании описывается протокол, который использует простую и надежную методологию для создания острой регионарной ишемии миокарда in situ на кроличьей модели для экспериментов без выживания и выживания. Первоначальная цель этого метода состояла в том, чтобы оценить влияние митохондриальной трансплантации на модуляцию некроза миокарда и повышение постишемической функции сердца после ишемического события. Предыдущие исследования продемонстрировали возникновение митохондриальных изменений и быстрое снижение уровня высокоэнергетических фосфатов после начала ишемии и снижение подачи кислорода, что приводит к резкому уменьшению^{запасов} сердечной энергии. Исследователи пытались улучшить постишемическую функцию и уменьшить некроз ткани миокарда с помощью фармакологических вмешательств и/или процедурных методов, но эти методы обеспечивают ограниченную кардиозащиту и оказывают минимальное влияние на повреждение и дисфункцию митохондрий ^5,6,7. Наша команда и другие ранее показали, что повреждение митохондрий в основном происходит во время ишемии и что сократительное восстановление может быть усилено, а размер инфаркта миокарда уменьшен с сохранением дыхательной функции митохондрий во время реперфузии ^8,9,10. Таким образом, мы предположили, что митохондриальная трансплантация из тканей, не затронутых ишемией, в область ишемии до реперфузии обеспечит альтернативный подход к уменьшению некроза миокарда и усилению функции миокарда. В этой статье мы подробно опишем протокол, используемый для проверки этой теории, и репрезентативные результаты, полученные в результате нашего первоначального анализа исследования.

Кроме того, несколько исследователей сосредоточились на других темах, имеющих важное значение для определения влияния ишемически-реперфузионного повреждения миокарда и разработки соответствующих терапевтических вмешательств. Одной из таких областей исследований является предобусловливание. Прекондиционирование ишемии миокарда является кардиопротекторным механизмом, активируемым кратковременным ишемическим стрессом, который приводит к снижению скорости некроза клеток сердца во время последующих эпизодов длительной ишемии. Эти механизмы могут быть активированы либо гипоксией, либо окклюзией коронарных артерий. Mandel et al. продемонстрировали, что гипоксически-гипероксическое прекондиционирование помогает поддерживать баланс метаболитов оксида азота, снижает гиперпродукцию эндотелина-1 и поддерживает защиту органов¹¹. Кроме того, была исследована концепция дистанционного ишемического прекондиционирования, феномена, при котором прекондиционирование одного органа обеспечивает системную защиту. Ali et al. обнаружили, что у пациентов, перенесших плановую открытую операцию по поводу аневризмы брюшной аорты, дистанционное прекондиционирование, выполняемое путем периодического перекрестного пережатия общей подвздошной артерии в качестве стимула, снижало частоту послеоперационного повреждения миокарда, инфаркта миокарда и почечной недостаточности¹².

Кроличьи модели обладают потенциальными преимуществами по сравнению с моделями с другими видами и десятилетиями использовались в различных сценариях, включая индукцию аритмий, глобальные и региональные модели ишемии, а также исследования сердечных сокращений, среди прочих^13,14,15. Хотя сердце кролика меньше, чем у собаки или свиньи, оно достаточно большое, чтобы легко выполнять хирургические процедуры с гораздо меньшими^{затратами}. Часто используется кроличье сердце, так как оно очень похоже на человеческое сердце; Действительно, он имеет аналогичную скорость метаболизма, экспрессирует тяжелую цепь β-миозина и не имеет значительной ксантиноксидазы¹⁶ миокарда. Описанный здесь метод индуцирования регионарной ишемии миокарда прост, воспроизводим и экономически эффективен. Этот метод допускает как случаи невыживаемости, так и случаи выживания, поскольку индуцируется только регионарная ишемия, а не глобальная, а необходимые материалы не являются специализированными. Могут быть использованы два различных хирургических подхода (например, стернотомия и мини-торакотомия), что обеспечивает оператору и экспериментальным протоколам большую свободу с точки зрения дизайна исследования. Кроме того, процедура не требует использования искусственного кровообращения. В этом контексте минимально инвазивные подходы к аортокоронарному шунтированию стали ценной альтернативой для пациентов, нуждающихся в многососудистой реваскуляризации^17,18. Эта модель может быть использована для изучения различий между этими подходами и предоставления инструмента обучения на животных для стажеров-хирургов. Кроме того, катетеризация сердца с использованием этой модели может быть полезна для физиологических исследований и/или хирургической подготовки.

Наша модель предоставляет методологию для приложений, в которых важно индуцировать регионарную ишемию миокарда и впоследствии измерять размер инфаркта, функцию миокарда и клеточные изменения. С помощью этого протокола мы смогли оценить несколько маркеров клеточной функции и адаптации к ишемии и предлагаемому терапевтическому вмешательству (т.е. митохондриальной трансплантации), изучив интернализацию органелл, потребление кислорода, синтез высокоэнергетических фосфатов и индукцию цитокиновых медиаторов и протеомных путей. Эти результаты важны для сохранения энергетики миокарда, жизнеспособности клеток и функции сердца и позволяют объективно оценить кардиопротекторные методы после ишемически-реперфузионного повреждения. Эта модель может быть использована для изучения аналогичных биологических путей и альтернатив в области постишемической патологии миокарда и восстановления.

Целью данного протокола является предоставление высоковоспроизводимой методологии индуцирования острой регионарной ишемии миокарда in situ у кроликов для экспериментов по невыживанию и выживанию. Эта модель обеспечивает методологию с высокой выживаемостью, низкой интраоперационной летальностью и минимальной заболеваемостью¹⁹. Другие модели острой регионарной ишемии миокарда были описаны с использованием радиомеченных материалов, контрастных веществ, магнитно-резонансной томографии или компьютерного моделирования^20,21,22. Наш протокол обеспечивает надежную и простую методологию, которая является экономически эффективной, стабильно воспроизводимой и имеет низкие технические требования и, таким образом, может быть выполнена исследователями без хирургического опыта. Этот протокол включает в себя либо проект выживания с использованием левой мини-торакотомии, либо модель без выживания с использованием срединной стернотомии.

Protocol

Это исследование было проведено в соответствии с рекомендациями Национальных институтов здравоохранения по уходу за животными и их использованию и было одобрено Комитетом по уходу за животными и их использованию Бостонской детской больницы (протокол 20-08-4247R). Все животные получали гу?…

Representative Results

В соответствии с протоколом (рис. 1) ишемия миокарда была подтверждена сразу при прямой визуализации цианоза эпикарда. Стандартные ЭКГ (три отведения: I, II и III и три компьютерных аугментированных отведения: aVL, aVR и aVF) регистрировались непрерывно в преишемию…

Discussion

Наш протокол демонстрирует надежную методику выполнения острой регионарной ишемии миокарда у кролика. Левосторонняя миниторакотомия идеально подходит для случаев выживания, в которых разрез и связанная с ним боль должны быть сведены к минимуму. Важно отметить, что диуретическая тера…

Materials

#10 blade	Bard Parker	371210
#11 blade	Fisher Scientific	B3L
22 G PIV needle	BD Insyte	381423
Acepromazine	VETONE	NDC 13985-587-50	0.5 mg/kg IM and IV
Aline pressure bag	Infu-Stat	2139
Angiocath	Becton Dickinson	382512
Arterial Catheter	Teleflex	MC-004912
Atropine	Hikma Pharmaceuticals	NDC 0641-6006-01	0.01 mg/kg IM
Betadine and 70% isopropyl alcohol	McKesson	NDC 68599-2302-6
Blood gas machine	Siemens	MRK0025
Bovie	Valleylab	E6008
Bulldog clamps	World Precision Instruments	14119
Bupivacaine	Auromedics	NDC 55150-249-50	3 mg/kg IM
Butorphanol	Roxane	NDC 2054-3090-36	0.5 mg/kg IM
Clear acetate sheet	Oxford Instruments	ID 51-1625-0213
Clipers	Andis	AGC2
DeBakey forceps	Integra	P6280
Echocardiography machine	Philips	IE33 F1
Electrocardiography machine	Meditech	MD908B
Endotracheal tube	Medline	#922774
Fentanyl	West-Ward	NDC 0641-6030-01	1–4 µg/kg transdermal patch
Formaldehyde solution 10%	Epredia	94001
Glass plates	United Scientific	B01MUHX6MR
Heparin Sodium	Sagent	NDC 69-0058-02	1000U in 1 mL 3 mg/kg
Hot water blanket	3M	55577
Isoflurane	Penn Veterinary Supply, INC	NDC 50989-606-15	1%–3%
Ketamine	Dechra	NDC 42023-138-10	10 mg/kg IV
Lab Chart 7 Acquisition Software	Adinstruments
Lactated Ringer's solution	ICUmedical	NDC 0990-7953-09	10 mL/kg/h
Laryngoscope	Welch Allyn	68044
Left ventricule lumen catheter 3Fr	McKesson	385764-EA
Lidocaine (1%)	Pfizer	4276-01	1–1.5 mL/kg IV
LVDP transducer	Edward	PDP-ED
Marking pen	Viscot	1451SR-100 Unsterile
Mayo scissors	Mayo	S7-1098
Medetomidine	Entireoly Pets Pharmacy	NDC 015914-005-01	0.25 mg/kg IM
Metzenbaum scissors	Cole-Parmer	UX-10821-05
Monastra. Blue pigment 98%	Chemsavers	MBTR1100G
Monocryl 5-0	Ethicon	Y463G
Mosquito clamp	Shioda	802N
PDS 3-0	Ethicon	42312201
Piezoelectric sonomicrometry crystals	Sonometrics	Small 2mm round
Plegets	DeRoyal	32-363
Povuine Iodine Prep Solutions	Medline	MDS093940
Precision vaporized system face mask	Yuwell	B07PNH69BF
Prolene 3-0	Ethicon	8665G
Proline 5-0	Ethicon	8661G
Pulse oximetry probe	Masimo	9216-U
Rib spreader	Medline	MDS5621025
S12 Pediatric Sector Probe	Phillips	21380A
Sonomicrometer	Sonometrics	BZ10123724
Sterile gauze	Medline	3.00802E+13
Sterile towels	McKesson	MON 277860EA
Sternal retractor	Medline	MDS5610321
Sutures for closure	J&J Dental	8698G
Telemetriy monitor	Meditech	MD908B
Temperature probe	Omega	KHSS-116G-RSC-12
Triphenyl tetrazolium chloride (1%)	Millipore	MFCD00011963
Ventilator	MedGroup	MSLGA 11
Vicryl 2-0	Ethicon	V635H
Vinyl tubing	ABE	DISW 3001