Modelo de lesión por isquemia y reperfusión en conejos
Summary
El presente estudio demuestra un modelo animal altamente reproducible de isquemia miocárdica regional aguda y lesión por reperfusión en conejos utilizando una minitoracotomía izquierda para los casos de supervivencia o una esternotomía de línea media para los casos de no supervivencia.
Abstract
El protocolo aquí proporciona una metodología simple y altamente replicable para inducir isquemia miocárdica regional aguda in situ en el conejo para experimentos de supervivencia y no supervivencia. El conejo blanco adulto de Nueva Zelanda está sedado con atropina, acepromazina, butorfanol e isoflurano. El animal es intubado y colocado en ventilación mecánica. Se inserta un catéter intravenoso en la vena marginal del oído para la infusión de medicamentos. El animal se medica previamente con heparina, lidocaína y solución de Ringer lactada. Se realiza un corte carotídeo para obtener acceso a la vía arterial para el control de la presión arterial. Los parámetros fisiológicos y mecánicos seleccionados se monitorean y registran mediante análisis continuos en tiempo real.
Con el animal sedado y completamente anestesiado, se realiza una pequeña toracotomía izquierda en el cuarto espacio intercostal (supervivencia) o una esternotomía de la línea media (no supervivencia). Se abre el pericardio y se localiza la arteria descendente anterior izquierda (DA).
Se pasa una sutura de polipropileno alrededor de la segunda o tercera rama diagonal de la arteria LAD, y el filamento de polipropileno se enhebra a través de un pequeño tubo de vinilo, formando una trampa. El animal es sometido a 30 min de isquemia regional, lograda ocluyendo la DA apretando la trampa. La isquemia miocárdica se confirma visualmente por cianosis regional del epicardio. Después de la isquemia regional, la ligadura se afloja y se permite que el corazón se vuelva a perfundir.
Tanto para los experimentos de supervivencia como para los de no supervivencia, la función miocárdica puede evaluarse mediante una medición ecocardiográfica (ECO) del acortamiento fraccional. En el caso de los estudios de no supervivencia, los datos de la sonomicrometría recogidos mediante tres sondas ultrasónicas piezoeléctricas digitales implantadas en el área isquémica y la presión desarrollada en el ventrículo izquierdo (DPVI) mediante un catéter de ventrículo izquierdo (VI) insertado apicalmente pueden adquirirse de forma continua para evaluar la función miocárdica regional y global, respectivamente.
Para los estudios de supervivencia, se cierra la incisión, se realiza una toracocentesis con aguja izquierda para la evacuación del aire pleural y se logra el control del dolor postoperatorio.
Introduction
Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de muerte en el mundo y contribuyen a más de 18 millones de muertes cada año1,2,3. El infarto agudo de miocardio (IM) es una emergencia médica común que se desarrolla cuando un coágulo de sangre o un trozo de placa de ateroma bloquea el flujo sanguíneo de una arteria coronaria. Esto provoca isquemia miocárdica regional en el territorio que perfunde la arteria.
El presente estudio describe un protocolo que utiliza una metodología simple y confiable para crear isquemia miocárdica regional aguda in situ en un modelo de conejo para experimentos de no supervivencia y supervivencia. El objetivo inicial de este método fue evaluar los efectos del trasplante mitocondrial en la modulación de la necrosis miocárdica y el aumento de la función cardíaca post-isquémica después de un evento isquémico. Investigaciones previas han demostrado la aparición de alteraciones mitocondriales y una rápida disminución de los niveles de fosfato de alta energía tras el inicio de la isquemia y una reducción en el suministro de oxígeno, lo que resulta en una disminución drástica de las reservas de energía cardíaca4. Los investigadores han intentado mejorar la función post-isquémica y disminuir la necrosis tisular miocárdica utilizando intervenciones farmacológicas y/o técnicas de procedimiento, pero estas técnicas proporcionan una cardioprotección limitada y tienen un impacto mínimo en el daño y la disfunción mitocondrial 5,6,7. Nuestro equipo y otros han demostrado previamente que el daño mitocondrial ocurre principalmente durante la isquemia y que la recuperación contráctil puede mejorarse y el tamaño del infarto de miocardio puede disminuir con la preservación de la función respiratoria mitocondrial durante la reperfusión 8,9,10. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que el trasplante mitocondrial de tejidos no afectados por la isquemia al área de isquemia antes de la reperfusión proporcionaría un enfoque alternativo para reducir la necrosis miocárdica y mejorar la función miocárdica. En este trabajo se detalla el protocolo utilizado para probar esta teoría y los resultados representativos obtenidos del análisis inicial de nuestro estudio.
Además, varios investigadores se han centrado en otros temas integrales para definir el impacto de la lesión por isquemia-reperfusión miocárdica y establecer intervenciones terapéuticas adecuadas. Una de esas áreas de investigación es la del preacondicionamiento. El preacondicionamiento miocárdico isquémico es un mecanismo cardioprotector activado por un breve estrés isquémico que da lugar a una reducción de la tasa de necrosis de las células cardíacas durante los episodios posteriores de isquemia prolongada. Estos mecanismos pueden ser activados por hipoxia u oclusión coronaria. Mandel et al. demostraron que el preacondicionamiento hipóxico-hiperóxico ayudó a mantener el equilibrio de los metabolitos del óxido nítrico, redujo la hiperproducción de endotelina-1 y apoyó la protección de los órganos11. Además, se ha explorado el concepto de precondicionamiento isquémico remoto, un fenómeno por el cual el precondicionamiento de un solo órgano proporciona protección sistémica. Ali et al. encontraron que, en pacientes sometidos a reparación electiva de aneurisma de aorta abdominal abierta, el preacondicionamiento remoto, realizado mediante pinzamiento cruzado intermitente de la arteria ilíaca común para que sirviera como estímulo, redujo la incidencia de lesión miocárdica postoperatoria, infarto de miocardio e insuficiencia renal12.
Los modelos de conejo ofrecen ventajas potenciales sobre los modelos con otras especies y se han utilizado en múltiples escenarios diferentes durante décadas, incluyendo la inducción de arritmias, modelos isquémicos globales y regionales, y la investigación de contracción cardíaca, entre otros13,14,15. Aunque el corazón del conejo es más pequeño que el de un perro o un cerdo, es lo suficientemente grande como para realizar fácilmente procedimientos quirúrgicos aun costo mucho menor. El corazón de conejo se usa a menudo, ya que es muy paralelo al corazón humano; De hecho, tiene una tasa metabólica similar, expresa β-cadena pesada de miosina y carece de xantina oxidasa16 miocárdica significativa. La técnica aquí descrita para inducir isquemia miocárdica regional es simple, repetible y costo-efectiva. Este método permite tanto los casos de no supervivencia como los de supervivencia, ya que solo se induce isquemia regional en lugar de isquemia global, y los materiales necesarios no son especializados. Se pueden utilizar dos enfoques quirúrgicos diferentes (es decir, esternotomía y minitoracotomía), lo que proporciona al operador y a los protocolos experimentales más libertad en cuanto al diseño del estudio. Además, el procedimiento no requiere el uso de un bypass cardiopulmonar. En este contexto, los abordajes mínimamente invasivos para el injerto de revascularización de la arteria coronaria se han convertido en alternativas valiosas para los pacientes que necesitan revascularización multivaso17,18. Este modelo podría utilizarse para estudiar las diferencias entre estos enfoques y proporcionar una herramienta de aprendizaje basada en animales para los aprendices de cirugía. Además, la realización de cateterismo cardíaco utilizando este modelo puede ser útil para la investigación fisiológica y/o el entrenamiento quirúrgico.
Nuestro modelo proporciona una metodología para aplicaciones en las que la inducción de isquemia miocárdica regional y la posterior medición del tamaño del infarto, la función miocárdica y los cambios celulares son importantes. Con este protocolo, hemos podido evaluar varios marcadores de función celular y adaptación a la isquemia y la intervención terapéutica propuesta (es decir, trasplante mitocondrial) examinando la internalización de orgánulos, el consumo de oxígeno, la síntesis de fosfato de alta energía y la inducción de mediadores de citoquinas y vías proteómicas. Estos resultados son importantes para preservar la energía miocárdica, la viabilidad celular y la función cardíaca y permiten la evaluación objetiva de las técnicas cardioprotectoras después de la lesión por isquemia-reperfusión. Este modelo podría utilizarse para estudiar vías biológicas similares y alternativas en el campo de la patología y recuperación miocárdica post-isquémica.
El objetivo de este protocolo es proporcionar una metodología altamente reproducible para inducir isquemia miocárdica regional aguda in situ en el conejo para experimentos de no supervivencia y supervivencia. Este modelo proporciona una metodología con alta supervivencia, baja mortalidad intraoperatoria y mínima morbilidad19. Otros modelos de isquemia miocárdica regional aguda han sido descritos utilizando materiales radiomarcados, agentes de contraste, resonancia magnética o simulaciones computacionales20,21,22. Nuestro protocolo proporciona una metodología fiable y sencilla que es rentable, reproducible de forma consistente y tiene una baja demanda técnica y, por lo tanto, puede ser realizada por investigadores sin experiencia quirúrgica. Este protocolo se adapta a un proyecto de supervivencia mediante una minitoracotomía izquierda o a un modelo de no supervivencia mediante una esternotomía de línea media.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nuestro protocolo demuestra una metodología fiable para la realización de la isquemia miocárdica regional aguda en el conejo. El abordaje de la minitoracotomía izquierda es ideal para los casos de supervivencia, en los que se debe minimizar la incisión y el dolor asociado. Es importante destacar que el tratamiento con diuréticos no fue necesario antes de la extubación, y no hubo mortalidad intraoperatoria en el grupo de no supervivencia ni a las 4 semanas después de la operación en el grupo de supervivencia. Cua…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El estudio original en el que se utilizó este protocolo fue financiado por las subvenciones HL-103642 y HL-088206 del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre
Materials
| #10 blade | Bard Parker | 371210 | |
| #11 blade | Fisher Scientific | B3L | |
| 22 G PIV needle | BD Insyte | 381423 | |
| Acepromazine | VETONE | NDC 13985-587-50 | 0.5 mg/kg IM and IV |
| Aline pressure bag | Infu-Stat | 2139 | |
| Angiocath | Becton Dickinson | 382512 | |
| Arterial Catheter | Teleflex | MC-004912 | |
| Atropine | Hikma Pharmaceuticals | NDC 0641-6006-01 | 0.01 mg/kg IM |
| Betadine and 70% isopropyl alcohol | McKesson | NDC 68599-2302-6 | |
| Blood gas machine | Siemens | MRK0025 | |
| Bovie | Valleylab | E6008 | |
| Bulldog clamps | World Precision Instruments | 14119 | |
| Bupivacaine | Auromedics | NDC 55150-249-50 | 3 mg/kg IM |
| Butorphanol | Roxane | NDC 2054-3090-36 | 0.5 mg/kg IM |
| Clear acetate sheet | Oxford Instruments | ID 51-1625-0213 | |
| Clipers | Andis | AGC2 | |
| DeBakey forceps | Integra | P6280 | |
| Echocardiography machine | Philips | IE33 F1 | |
| Electrocardiography machine | Meditech | MD908B | |
| Endotracheal tube | Medline | #922774 | |
| Fentanyl | West-Ward | NDC 0641-6030-01 | 1–4 µg/kg transdermal patch |
| Formaldehyde solution 10% | Epredia | 94001 | |
| Glass plates | United Scientific | B01MUHX6MR | |
| Heparin Sodium | Sagent | NDC 69-0058-02 | 1000U in 1 mL 3 mg/kg |
| Hot water blanket | 3M | 55577 | |
| Isoflurane | Penn Veterinary Supply, INC | NDC 50989-606-15 | 1%–3% |
| Ketamine | Dechra | NDC 42023-138-10 | 10 mg/kg IV |
| Lab Chart 7 Acquisition Software | Adinstruments | ||
| Lactated Ringer's solution | ICUmedical | NDC 0990-7953-09 | 10 mL/kg/h |
| Laryngoscope | Welch Allyn | 68044 | |
| Left ventricule lumen catheter 3Fr | McKesson | 385764-EA | |
| Lidocaine (1%) | Pfizer | 4276-01 | 1–1.5 mL/kg IV |
| LVDP transducer | Edward | PDP-ED | |
| Marking pen | Viscot | 1451SR-100 Unsterile | |
| Mayo scissors | Mayo | S7-1098 | |
| Medetomidine | Entireoly Pets Pharmacy | NDC 015914-005-01 | 0.25 mg/kg IM |
| Metzenbaum scissors | Cole-Parmer | UX-10821-05 | |
| Monastra. Blue pigment 98% | Chemsavers | MBTR1100G | |
| Monocryl 5-0 | Ethicon | Y463G | |
| Mosquito clamp | Shioda | 802N | |
| PDS 3-0 | Ethicon | 42312201 | |
| Piezoelectric sonomicrometry crystals | Sonometrics | Small 2mm round | |
| Plegets | DeRoyal | 32-363 | |
| Povuine Iodine Prep Solutions | Medline | MDS093940 | |
| Precision vaporized system face mask | Yuwell | B07PNH69BF | |
| Prolene 3-0 | Ethicon | 8665G | |
| Proline 5-0 | Ethicon | 8661G | |
| Pulse oximetry probe | Masimo | 9216-U | |
| Rib spreader | Medline | MDS5621025 | |
| S12 Pediatric Sector Probe | Phillips | 21380A | |
| Sonomicrometer | Sonometrics | BZ10123724 | |
| Sterile gauze | Medline | 3.00802E+13 | |
| Sterile towels | McKesson | MON 277860EA | |
| Sternal retractor | Medline | MDS5610321 | |
| Sutures for closure | J&J Dental | 8698G | |
| Telemetriy monitor | Meditech | MD908B | |
| Temperature probe | Omega | KHSS-116G-RSC-12 | |
| Triphenyl tetrazolium chloride (1%) | Millipore | MFCD00011963 | |
| Ventilator | MedGroup | MSLGA 11 | |
| Vicryl 2-0 | Ethicon | V635H | |
| Vinyl tubing | ABE | DISW 3001 |
Referências
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