Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

الميالين في المختبر للمحاور المحيطية في زراعة مشتركة لنباتات العقدة الجذرية الظهرية للفئران وخلايا شوان

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64768
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Neurology, Ruhr-University Bochum, St. Josef Hospital

Summary

في نظام الاستزراع المشترك للعقد الجذرية الظهرية وخلايا شوان ، يمكن دراسة الميالين في الجهاز العصبي المحيطي. يوفر هذا النموذج فرصا تجريبية لمراقبة الميالين المحيطي وقياسه ودراسة تأثيرات المركبات ذات الأهمية على غمد الميالين.

Abstract

عملية الميالين ضرورية لتمكين نقل إشارة سريعة وكافية في الجهاز العصبي. في الجهاز العصبي الطرفي، تشارك الخلايا العصبية وخلايا شوان في تفاعل معقد للتحكم في ميالين المحاور العصبية. اضطرابات هذا التفاعل وانهيار غمد المايلين هي السمات المميزة لاعتلالات الأعصاب الالتهابية وتحدث بشكل ثانوي في الاضطرابات التنكسية العصبية. نقدم هنا نموذجا للاستزراع المشترك لنباتات العقدة الجذرية الظهرية وخلايا شوان ، والتي تطور ميالين قويا للمحاور العصبية الطرفية لدراسة عملية الميالين في الجهاز العصبي الطرفي ، ودراسة تفاعلات الخلايا المحورية وشوان ، وتقييم التأثيرات المحتملة للعوامل العلاجية على كل نوع من الخلايا على حدة. من الناحية المنهجية ، تم حصاد العقد الجذرية الظهرية للفئران الجنينية (E13.5) ، وفصلها عن الأنسجة المحيطة بها ، واستزراعها كنباتات كاملة لمدة 3 أيام. تم عزل خلايا شوان من الفئران البالغة من العمر 3 أسابيع ، وتم هضم الأعصاب الوركية إنزيميا. تم تنقية خلايا شوان الناتجة عن طريق فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا واستزراعها في ظل ظروف تخصيب النيوريجولين وفورسكولين. بعد 3 أيام من زراعة العقدة الجذرية الظهرية ، تمت إضافة 30000 خلية شوان إلى مزرعة واحدة من العقدة الجذرية الظهرية في وسط يحتوي على حمض الأسكوربيك. تم الكشف عن العلامات الأولى للميالين في اليوم 10 من الزراعة المشتركة ، من خلال إشارات متفرقة لبروتين المايلين الأساسي في تلطيخ الخلايا المناعية الكيميائية. من اليوم 14 فصاعدا، تكونت أغلفة الميالين وانتشرت على طول المحاور. يمكن قياس الميالين كميا عن طريق تلطيخ البروتين الأساسي للمايلين كنسبة بين مساحة الميالين والمنطقة المحورية، لحساب الاختلافات في الكثافة المحورية. يوفر هذا النموذج فرصا تجريبية لدراسة الجوانب المختلفة للميالين المحيطي في المختبر ، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم علم الأمراض وفرص العلاج الممكنة لإزالة الميالين والتنكس العصبي في الأمراض الالتهابية والتنكسية العصبية في الجهاز العصبي المحيطي.

Introduction

في الجهاز العصبي الطرفي (PNS) ، يتم نقل المعلومات السريع بوساطة محاور مغلفة بالمايلين. يعد الميالين في المحاور العصبية ضروريا لتمكين الانتشار السريع للنبضات الكهربائية ، لأن سرعة توصيل الألياف العصبية ترتبط بقطر المحور العصبي وسمكالمايلين 1. تعتمد الإشارات الحسية من المحيط إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS) على تنشيط الخلايا العصبية الحسية من الدرجة الأولى الموجودة في تضخم الجذر الظهري ، والتي تسمى العقد الجذرية الظهرية (DRG). لتكوين الميالين وصيانته ، يكون الاتصال المستمر بين المحاور العصبية وخلايا شوان ، وهي خلايا الخلايا الدبقية الميالينية في الجهاز العصبي الطرفي ، إلزاميا2.

تزعج العديد من أمراض الجهاز العصبي الطرفي نقل المعلومات إما عن طريق تلف محوري أولي أو مزيل للميالين ، مما يؤدي إلى نقص الحس أو خلل الحس. تتمتع الخلايا العصبية الحسية من الدرجة الأولى بالقدرة على التجدد إلى حد ما بعد تلف الخلايا العصبية ، من خلال تفاعل معقد بين الخلايا العصبية وخلايا شوان المحيطة3. في هذه الحالة ، يمكن أن تخضع خلايا شوان لإعادة البرمجة الخلوية لإزالة حطام المحور العصبي وكذلك المايلين وتعزيز تجديد المحور العصبي ، مما يؤدي إلى إعادة الميالين4. من المهم فهم آليات الميالين في الصحة والمرض ، من أجل إيجاد خيارات العلاج الممكنة لاضطرابات إزالة الميالين في الجهاز العصبي الطرفي. يمكن أيضا أن يتلف المايلين بسبب الصدمات العصبية الحادة ، والأساليب لتعزيز الميالين لتعزيز الانتعاش الوظيفي بعد إصابة الأعصاب الطرفية قيد التحقيق5.

استفادت معرفتنا بالميالين المحيطي إلى حد كبير من الزراعات المشتركة الميالينية لخلايا شوان والخلايا العصبية الحسية. منذ تطبيق الأساليب الأولى6،7،8 ، تمت دراسة الميالين بشكل مكثف باستخدام أنظمة الاستزراع المشتركالمختلفة 9،10،11. هنا ، نقدم بروتوكولا سريعا وسهلا للميالين القوي في المختبر لمحاور العقدة الجذرية الظهرية. يعتمد بروتوكول تحضير خلية شوان على بروتوكول Andersen et al.12 ، الذي نشر سابقا في Pitarokoili et al.13. نحن نستخدم خلايا شوان المشتقة من الفئران اليافعة ومزارع DRG الجنينية للزراعة المشتركة ، حيث يحدث الميالين في حوالي اليوم 14. الهدف من هذه الطريقة هو توفير نظام للتحقيق في تكوين المايلين نتيجة للتفاعل المباشر بين خلية محور عصبي وشوان ، ودراسة معدلات الميالين PNS. بالمقارنة مع مزارع الخلايا العصبية المنفصلة ، يتم الحفاظ على نباتات DRG تشريحيا بشكل أكبر وتشكل عمليات محورية طويلة. يوفر القياس الكمي لمنطقة المحور العصبي المياليني قراءة كافية للميالين في الزراعة المشتركة. هذه الطريقة هي أداة قيمة لفحص المركبات العلاجية لتأثيرها المحتمل على الميالين العصبي الطرفي ، ويمكن استخدامها أيضا بالإضافة إلى الدراسات في الجسم الحي في النماذج الحيوانية14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لتوجيه مجلس الجماعات الأوروبية لرعاية واستخدام المختبر.

1. ثقافة خلية شوان

  1. طلاء لثقافة خلية شوان
    1. معطف أطباق ثقافة الخلية تحت ظروف معقمة. ضع 2 مل من 0.01٪ بولي-ل-ليسين (PLL) على طبقين لزراعة الأنسجة (TC) مقاس 60 مم لكل منهما واحتضان طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    2. قم بإزالة PLL ، واغسل أطباق TC 2x بالماء المقطر ، واحتضانها ب 2 مل من 1 ميكروغرام / سم2 لامينين طوال الليل عند 4 درجات مئوية. اغسل أطباق TC 2x باستخدام أكوا ديست ، واترك الأطباق تجف في الهواء.
  2. تحضير متوسط لزراعة خلايا شوان
    1. قم بإعداد 50 مل من وسط خلية شوان عن طريق إضافة 10٪ من مصل عجل الجنين المعطل بالحرارة (FCS)، و2 ميكرومتر فورسكولين، و10 نانومتر نيوريجولين، و50 ميكروغرام/مل جنتاميسين إلى وسط النسر المعدل (DMEM)/F-12 (ارتفاع الجلوكوز) في ظل ظروف معقمة.
    2. تحضير 70 مل من وسط ليبوفيتز L-15 مع 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين تحت ظروف معقمة.
  3. إعداد العصب الوركي
    ملاحظة: يتم تنفيذ جميع خطوات تحضير العصب الوركي تحت مقعد نظيف.
    1. قم بإعداد طبق TC واحد 100 مم مع 5 مل من محلول ملحي Dulbecco المخزن بالفوسفات (DPBS) بدون Ca 2+ و Mg2+ ، وطبق TC 100 مم مع 5 مل من وسط Leibovitz's L-15 المثلج ، وطبق TC 100 مم مع 5 مل من وسط L-15 المثلج البارد من Leibovitz و 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين.
    2. تنظيف جميع الأدوات عن طريق التعقيم. رش الأدوات ومنطقة العمل بنسبة 70٪ إيثانول.
    3. القتل الرحيم لخمسة ذكور من فئران Sprague Dawley البالغة من العمر 3 أسابيع باستخدام استنشاق CO2 وقطع الرأس. رش جذع الفئران بنسبة 70 ٪ من الإيثانول.
    4. افتح الطرف الأيسر السفلي الظهري بالمقص وأزل عضلة الفخذ ذات الرأسين بعناية. قم بفك العصب الوركي عن طريق الارتفاع السلس بالملقط المنحني ، مع ضمان عدم كدمات العصب.
    5. امسك الجزء الأقرب من العصب بالملقط المنحني لتقويم العصب ، وقم بقص العصب إلى أعلى مستوى ممكن باستخدام المقص. ثم ، قص العصب بالقرب من الضفيرة المقدسة ومخلب مع مقص. كرر الخطوات 1.3.4-1.3.5 للجانب الأيمن.
      ملاحظة: أثناء فتح الطرف ، احرص على عدم كدمات أي أوعية دموية.
    6. باستخدام ملقط ، ضع الأعصاب الوركية اليمنى واليسرى في طبق TC 100 مم مع DPBS المثلج.
  4. تجديد العصب الوركي
    1. استخدم الملقط لنقل جميع الأعصاب إلى طبق TC مقاس 100 مم مع متوسط L-15 المثلج من Leibovitz و 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين. استمر في استخدام المجهر المجسم وقم بإزالة الدهون والعضلات والأوعية الدموية من الأعصاب باستخدام زوجين من الملقط الدقيق. أمسك الأعصاب بالملقط وانقلها إلى طبق TC مقاس 100 مم مع وسيط L-15 من Leibovitz المثلج.
    2. تحديد الأطراف القريبة والبعيدة للعصب الوركي. قم بإزالة العصب باستخدام زوج واحد من الملقط الدقيق في الاتجاه القريب إلى البعيد ، مع إمساك نهاية العصب القريب بالزوج الثاني من الملقط الدقيق.
    3. انقل الأعصاب النقية إلى طبق TC مقاس 100 مم مع متوسط L-15 المثلج و 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين. ندف الحزم العصبية المعزولة لفصل وعزل الألياف العصبية المفردة باستخدام زوجين من الملقط الدقيق.
    4. انقل الألياف العصبية إلى أنبوب سعة 50 مل باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل وتناول أقل وسط ممكن. أضف 50 مل من وسط L-15 من Leibovitz مع 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين إلى الألياف العصبية وقتل عدة مرات في أنبوب 50 مل.
  5. الهضم الأنزيمي للعصب الوركي
    ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات التالية (الخطوات 1.5-1.8 و 2.1 و 2.2) في ظروف معقمة.
    1. تحضير محلول الهضم الأنزيمي الذي يحتوي على 0.25٪ ديسباز II ، 0.05٪ كولاجيناز من النوع الأول ، و 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين في 10 مل من DMEM (نسبة عالية من الجلوكوز).
    2. قم بطرد الأنبوب عند 188 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وقم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة مصلية سعة 25 مل ، وانقل الحبيبات مع وسط Leibovitz L-15 المتبقي إلى طبق TC 60 مم باستخدام ماصة 1000 مل.
    3. شطف أنبوب 50 مل مع 10 مل من محلول الهضم الأنزيمي وإضافته إلى الطبق الذي يحتوي على الألياف العصبية. قم بتوزيع المنديل في الطبق بعناية باستخدام طرف ماصة لزيادة السطح الذي يمكن الوصول إليه للهضم.
    4. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 18 ساعة ، ووقف الهضم عن طريق إضافة 10 مل من 40٪ FCS في محلول ملح هانكس المتوازن ، بدون Ca2 و Mg2+ (HBSS).
  6. فصل الخلايا
    1. نقل الأعصاب المهضومة إلى أنبوب سعة 50 مل باستخدام ماصة مصلية وأجهزة طرد مركزي عند 188 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 10 مل من DMEM تحتوي على 10٪ FCS و 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين. أعد تعليق الحبيبات 20 مرة بعد ذلك ، باستخدام طرف ماصة 10 مل و 5 مل و 2 مل و 1 مل و 200 ميكرولتر.
    2. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر وأجهزة طرد مركزي عند 188 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات ب 4 مل من DMEM تحتوي على 10٪ FCS و 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين.
    3. أضف 2 مل من معلق الخلية إلى كل من طبقي TC المغلفة ب PLL و laminin مقاس 60 مم ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. اترك اللوحات دون أن تمسها لمدة 2 أيام في الحاضنة لحماية الخلايا من الإجهاد الميكانيكي ودعم الالتزام.
  7. تمايز خلايا شوان
    1. بعد يومين ، قم بإزالة الوسط وشطف الألواح بعناية 2x مع DMEM (نسبة عالية من الجلوكوز) ، و 10٪ FCS ، و 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين. بعد ذلك ، أضف 2 مل من وسط خلية شوان. استبدال وسط خلية شوان كل 2يوم ، ومراقبة مظهر الخلية والتقاء باستخدام المجهر.
      ملاحظة: يجب تحضير خلايا Schwann و DRG explants في الوقت المناسب وبطريقة منسقة للزراعة المشتركة. تأكد من توفر فأر مع أجنة في E 13.5 لإعداد DRG عندما تكون خلايا Schwann قريبة من التقاء 80٪.
  8. التربسين الخلوي والفصل المغناطيسي
    ملاحظة: للحصول على صور مثالية لمراحل زراعة خلايا شوان المختلفة ، انظر الشكل التكميلي 1.
    1. عندما تصل الخلايا إلى التقاء حوالي 80٪ (6-12 يوما من الثقافة) ، اغسل الأطباق بعناية 2x مع 3 مل من DPBS واحتضانها ب 2 مل من 0.05٪ Trypsin / EDTA (مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية) لمدة 3 دقائق. عندما تنفصل الخلايا عن قاع اللوحة ، قم بتعطيل الهضم بإضافة 2 مل من DMEM مع 10٪ FCS و 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين.
      ملاحظة: التزم بوقت التربسين البالغ 3 دقائق بدقة ، واستمر بسرعة بعد ذلك.
    2. أعد تعليق حبيبات الخلية في 2 مل من المخزن المؤقت لفصل الخلايا المغناطيسية الذي يحتوي على DPBS مع 0.5٪ ألبومين مصل بقري (BSA) و 2 نانومتر EDTA. اجمع بين 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق وعد الخلايا باستخدام غرفة تلطيخ.
    3. الطرد المركزي تعليق الخلية عند 188 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 90 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفصل الخلايا المغناطيسية لكل 1 × 107 خلايا. أضف 10 ميكرولتر من ميكروبيدات Thy-1 لكل 1 × 107 خلايا. أعد تعليق المحلول عدة مرات واحتضانه لمدة 15 دقيقة في الظلام عند 8 درجات مئوية.
    4. أضف 2 مل من المخزن المؤقت لفصل الخلايا المغناطيسية إلى تعليق الخلية وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفصل الخلايا المغناطيسية.
    5. بلل عمود فصل الخلايا المغناطيسية ب 1 مل من المخزن المؤقت لفصل الخلايا المغناطيسية. ضع عمود فصل الخلايا المغناطيسية في فاصل الخلايا المغناطيسية. ضع الخلايا على عمود فصل الخلايا المغناطيسية. جمع التدفق من خلال وأجهزة الطرد المركزي في 300 × غرام في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: يتم اختيار الخلايا الليفية بشكل إيجابي وتبقى في العمود ، بينما تمر خلايا شوان العمود. يمكن جمع الخلايا الليفية بختم (على سبيل المثال ، كعنصر تحكم سلبي لبروتوكولات تلطيخ خلايا شوان).
    6. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من وسط الاستزراع المشترك (انظر الخطوة 3.1.1). عد الخلايا بعد تلطيخها باستخدام التريبان الأزرق وغرفة تلطيخ.

2. DRG ثقافة الزرع

  1. إعداد متوسط نمو DRG
    1. قم بإعداد وسط نمو DRG بإضافة 2٪ B27 ، مصل الحصان 2٪ ، 1٪ L-glutamine ، 0.5٪ بنسلين / ستربتومايسين ، و 10 نانوغرام / مل عامل نمو الأعصاب (NGF) إلى الوسط العصبي القاعدي. قم بتخزين وسط النمو عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يمكن استخدام وسيط النمو لمدة 2 أيام.
  2. طلاء لمصانع DRG
    1. احتضان أغطية في 70 ٪ من الإيثانول لمدة 1 ساعة ووضعها في آبار أطباق 4 آبار باستخدام ملقط منحني. بعد أن يجف الإيثانول ، ضع 300 ميكرولتر من 0.2 مجم / مل بولي-د-ليسين (PDL) لكل بئر واحتضانه طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    2. اغسل أغطية الغطاء 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام DPBS على التوالي. خلع DPBS ، وتطبيق 300 ميكرولتر من 1 ميكروغرام / مل لامينين على أغطية الغطاء ، واحتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    3. بعد ثلاث خطوات غسيل باستخدام DPBS لمدة 5 دقائق ، استبدل DPBS ب 190 ميكرولتر من وسط نمو DRG. ضع الألواح المكونة من 4 آبار في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  3. إعداد DRG
    ملاحظة: حصاد DRG من الفئران الجنينية تحت مقعد نظيف.
    1. قبل التحضير ، قم بتنظيف جميع الأدوات باستخدام الإيثانول بنسبة 70٪. املأ 10 أطباق TC (اثنان لكل جنين) 35 مم مع 2 مل من HBSS المثلج لكل طبق ، وطبقين TC 100 مم مع 5 مل من HBSS المثلج لكل طبق.
    2. القتل الرحيم للفئران الحوامل (إناث الفئران البالغة Sprague Dawley ، E13.5) عن طريق استنشاق CO2 وقطع الرأس.
    3. رش الجسم مع الإيثانول 70 ٪ وفتح الجذع البطني للفئران. قم بإزالة الرحم بعناية ووضعه في طبق TC 100 مم مع HBSS المثلج.
    4. امسك الرحم باستخدام ملقط منحني وافتح جدار الرحم بملقط ناعم. قم بإزالة كيس أمنيوسي واحد وافتحه بعناية عن طريق قرص ثقب بالملقط الدقيق.
    5. إزالة الجنين من الأنسجة المحيطة ، وقطع الحبل السري ، وقطع رأس الجنين باستخدام ملقط دقيق. ضع الجذع في طبق TC 100 مم مملوء ب HBSS باستخدام ملقط منحني وملعقة.
    6. قم بإزالة جميع الأجنة بسرعة من الرحم ونقلها إلى طبق TC واحد 100 مم مملوء ب HBSS. إذا كان هناك أكثر من خمسة أجنة ، فقم بإعداد طبق TC إضافي 35 مم مع 2 مل من HBSS ، وفقا للخطوة 2.3.1.
    7. ضع جذع جنين واحد برفق في طبق TC مقاس 35 مم مملوء ب HBSS باستخدام ملعقة وملقط منحني. تحت المجهر المجسم ، افتح الجزء الظهري من الجذع لتقسيم الجنين إلى نصفين باستخدام ملقط دقيق ومقص دقيق. أدر نصفا إلى الجانب وحدد حبلا DRG الموجود في خط في الجزء الظهري من الجنين.
    8. اقطع DRG كخصلة كاملة باستخدام ملقط ناعم ومقص صغير. ضع DRG في طبق TC طازج 35 مم مملوء ب 2 مل من HBSS ، وافصل DRG واحدا عن الأنسجة المتبقية باستخدام ملقط دقيق ومقص صغير.
  4. زراعة خلايا DRG
    1. خذ 4 ألواح جيدة تحتوي على 190 ميكرولتر من وسط نمو DRG من الحاضنة إلى المقعد النظيف حيث سيتم تحضير DRG. انقل DRG واحدا بعناية إلى بئر واحد من صفيحة استزراع ذات 4 آبار باستخدام ملقط دقيق وملعقة. ضع DRG في وسط كل بئر ، لأن الموضع المركزي مهم لربط DRG.
    2. العمل في ظل ظروف معقمة من الآن فصاعدا. ضع مزارع الزرع في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. في اليوم التالي ، أضف 50 ميكرولتر من وسط نمو DRG بعناية إلى كل بئر باستخدام ماصة 100 مل.
    3. راقب التصاق DRG explant ونمو المحور العصبي باستخدام المجهر يوميا ، وتجاهل نباتات DRG التي انفصلت عن غطاء الغطاء أو فشلت في تجاوز المحاور العصبية في اليوم 3 من الثقافة.
      ملاحظة: تعتبر نباتات DRG هشة للغاية في الأيام الأولى من الاستزراع وتحتاج إلى التعامل معها بحذر ، خاصة عند تحريك الألواح داخل وخارج الحاضنة عند تغيير الوسيط ، أو حتى عند إغلاق باب الحاضنة. يعد الحجم الدقيق البالغ 190 ميكرولتر من الوسط لكل بئر أمرا بالغ الأهمية للحفاظ على محطات DRG في مكانها خلال اليوم الأول من الثقافة. يمكن التعرف على نباتات DRG السائبة بسهولة أثناء التحكم اليومي ، لأنها تسبح في الوسط بدلا من الالتصاق بغطاء الغطاء.

3. الثقافة المشتركة

  1. نقل خلايا شوان إلى ثقافة زرع DRG
    1. قم بإعداد وسط الاستزراع المشترك بإضافة 0.1٪ حمض الأسكوربيك إلى وسط نمو DRG.
    2. في اليوم 3 من زراعة DRG ، استبدل بعناية وسط نمو DRG ب 250 ميكرولتر من وسط الاستزراع المشترك الذي يحتوي على 30000 خلية شوان (من الخطوة 1.8) لكل بئر.
    3. حافظ على الاستزراع المشترك لنباتات DRG وخلايا Schwann لمدة تصل إلى 22 يوما. استبدل 250 ميكرولتر من وسط الاستزراع المشترك بعناية كل يوم ، ولاحظ مظهر الخلايا باستخدام المجهر.
      ملاحظة: للحصول على مثال على محاور DRG وخلايا شوان في الزراعة المشتركة في الأيام الأولى من الثقافة ، انظر الشكل 1.
  2. تلطيخ كيميائي مناعي
    ملاحظة: تعامل مع عينات الاستزراع المشترك بعناية فائقة أثناء إجراء التلوين ، حيث يمكن أن تتلف بسهولة.
    1. لإصلاح الخلايا الموجودة على أغطية الغطاء ، قم بإزالة الوسط ببطء ، واغسل 3x باستخدام DPBS بعناية ، واحتضن في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 10 دقائق. استبدل PFA ب DPBS ، وقم بتخزين الخلايا الثابتة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 أسبوع.
      تنبيه: عند التعامل مع 4٪ PFA ، ارتد معدات الحماية الشخصية الموصى بها.
    2. اغسل أغطية الغطاء 3x باستخدام DPBS لمدة 5 دقائق ، ثم قم بحظره بمحلول مانع (10٪ مصل الماعز ، 10٪ ألبومين مصل البقر [BSA] ، 0.1٪ جيلاتين ، و 0.05٪ Triton X-100) في DPBS لمدة 1 ساعة. تمييع الأجسام المضادة الأولية βIII-tubulin (1: 7,500) وبروتين المايلين الأساسي (MBP) (1: 750) في محلول الحجب ، واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    3. اغسل الخلايا 3 مرات باستخدام DPBS لمدة 5 دقائق. استخدم الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالصبغة الفلورية بتخفيف 1: 1000 في محلول مانع ، واحتضانها لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    4. اغسل الخلايا 3x باستخدام DPBS لمدة 5 دقائق ، وقم بتركيب الخلايا على شرائح مجهرية بوسط تركيب مضان ، بما في ذلك 4 ′،6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). قم بتخزين الشرائح في الظلام عند 4 درجات مئوية حتى التوثيق المجهري.
      تنبيه: عند التعامل مع وسيط تركيب مضان ، ارتد معدات الحماية الشخصية الموصى بها.
  3. تحليل
    1. التقط صورا لثماني مناطق محددة تحيط بمصنع DRG في المركز باستخدام مجهر مقلوب.
    2. استخدم تطبيقا برمجيا لتحليل الصور لتحديد مناطق المحاور العصبية الموجبة βIII-tubulin والميالين الملطخة بواسطة MBP.
    3. احسب النسبة المئوية للميالين في صورة نسبة بين المحاور العصبية الميالينية والمحاور العصبية غير الميالينية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم تقييم الميالين في الزراعة المشتركة في الأيام 10 و 12 و 14 و 16 و 18 و 20. تم تلطيخ نباتات DRG وخلايا Schwann من أجل MBP و βIII-tubulin و DAPI. كانت الشبكة المحورية في الثقافة المشتركة كثيفة ولم تتغير بشكل واضح في المسار الزمني للملاحظة. كانت العلامات الأولى للمايلين ، في شكل شظايا صغيرة ، قابلة للاكتشاف في اليوم 10 وزادت في اليوم 12 (الشكل 2). زادت المناطق الإيجابية MBP بمرور الوقت حتى اليوم 20 من الثقافة. تم تحديد الميالين كنسبة من المناطق الإيجابية MBP و βIII-tubulin. زاد الميالين بشكل ملحوظ في اليومين 18 و 20 مقارنة باليوم 10 (الشكل 3 ؛ ** p ≤ 0.01 ؛ ***p ≤ 0.001).

Figure 1
الشكل 1: ظهور خلايا ومحاور شوان في الزراعة المشتركة. صورة مثالية للثقافة المشتركة في اليوم 3. تظهر الأسهم السوداء محاور DRG رفيعة ، ويشير السهم الأبيض إلى خلية شوان ذات مورفولوجيا ممدودة على شكل مغزل متصلة بمحور عصبي. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: الميالين في الزراعة المشتركة لنباتات DRG وخلايا شوان. تم إجراء تلطيخ للعلامة العصبية βIII-tubulin و MBP في الأيام 10 و 12 و 14 و 16 و 18 و 20 ، بعد الانضمام إلى كلتا الثقافتين للتحقيق في تطور الميالين في الثقافة المشتركة. كانت العلامات الأولى للميالين مرئية في اليومين 10 و 12 من الزراعة المشتركة. من اليوم 14 فصاعدا ، كانت إشارة MBP أكثر وضوحا ، وتم اكتشاف محاور مغلفة بالمايلين. زاد الميالين مع وقت الزراعة المشتركة حتى اليوم 20. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: القياس الكمي للمايالين. في الأيام 10 و 12 و 14 و 16 و 18 و 20 من الزراعة المشتركة ، تم تقييم الميالين عن طريق تلطيخ المحاور مع βIII-tubulin ، والمايلين مع MBP. تم تحديد النسبة المئوية للمحاور العصبية الميالينية من خلال حساب نسبة المناطق الملطخة ب MBP و βIII-tubulin. تم الكشف عن اختلافات ذات دلالة إحصائية في اليومين 18 و 20 مقارنة باليوم 10 من الثقافة المشتركة. يتم التعبير عن البيانات كمتوسط ± SEM ؛ ن = 3. ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار Kruskal-Wallis و Dunn المتعدد بعد المقارنة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: مراحل زراعة خلايا شوان. صور برايت فيلد النموذجية لخلايا شوان المستزرعة (A) قبل و (B) بعد فصل الخلايا المغناطيسية. قبل فصل الخلايا المغناطيسية ، تشتمل الثقافة على خلايا شوان ذات شكل ممدود ومغزلي ، وخلايا ليفية مسطحة ومنتشرة ، وبقايا النسيج الضام. لتحقيق ثقافة أنقى لخلايا شوان ، يتم إجراء فصل الخلايا المغناطيسية. قضبان المقياس: 200 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: الميالين من نباتات DRG مع خلايا شوان الإضافية وبدونها. تم استخدام المنطقة الملطخة MBP لقياس الميالين في الثقافة المشتركة في اليوم 14. تم زيادة الميالين من نباتات DRG بشكل ملحوظ إذا تمت إضافة خلايا Schwann إلى المزرعة (اختبار t غير المزاوج ، ** p ≤ 0.01). ن = 3. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: تحليل التعبير الجيني في الزراعة المشتركة. تم تحليل مستويات التعبير الجيني النسبية ل MBP و PMP22 و MAG و Oct6 و Egr2 و Olig1 في عينات الاستزراع المشترك في اليوم 22 بواسطة qPCR (A). كان MBP و PMP22 هما الهدفان اللذان حققا أعلى مستويات التعبير الجيني في الثقافة المشتركة. توضح الصورة المثالية لمنتجات تضخيم qPCR المطبقة على هلام الأغاروز الوفرة النوعية للأهداف (B). يمثل الممران الأول والأخير على الجل سلم الحمض النووي (100 زوج من القواعد). ن = 5. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا ، نقدم بروتوكولا سريعا وسهلا لتوليد الميالين في المختبر عن طريق دمج ثقافتين منفصلتين من نوع الخلية ، خلايا شوان ونباتات العقدة الجذرية الظهرية.

تتمثل الخطوة الحاسمة في البروتوكول في زراعة نباتات DRG ، خاصة في الأيام الأولى للثقافة. DRG هشة للغاية قبل بناء شبكة محورية قوية ويجب التعامل معها بعناية فائقة ، على سبيل المثال ، عند إخراجها من الحاضنة أو أثناء تغيير الوسيط. DRG التي تنفصل عن قاع البئر وتوجد تسبح في الوسط تظهر زراعة غير ناجحة. بالنسبة لخلايا شوان ، يمكن أن يمثل تغيير معدلات الانتشار بسبب ظروف الزراعة والمكملات المختلفة (على سبيل المثال ، المصل في الوسط) تحديا للثقافة المشتركة. إذا كانت الثقافة متضخمة بسبب عدد مفرط من خلايا شوان ، فإنها تنفصل عن قاع البئر وتصبح غير صالحة للاستعمال. لذلك يوصى بمعايرة رقم خلية شوان في الثقافة. أثناء إنشاء بروتوكول خلية شوان ، يجب إجراء اختبارات النقاء ، باستخدام SOX10 أو S100 immunostaining. بشكل عام ، يجب أن يتم التعامل مع الثقافة ، بما في ذلك تغيير الوسيط وكذلك خطوات الغسيل والتثبيت ، بعناية لضمان نتيجة ناجحة. من المهم تحديد النقطة الزمنية للمراقبة وفقا لاهتمام البحث ؛ يمثل اليوم 14 نقطة البداية لأول محاور عصبية ميالينية كثيفة، ومن ثم يمكن اختياره كنقطة زمنية للرصد لبدء الميالين، بينما توفر النقاط الزمنية اللاحقة أغلفة مايلين أكثر اكتمالا.

نظرا لأن طريقة الميالين هذه في المختبر تشتمل فقط على خلايا DRG و Schwann ، فإنها لا تشبه تماما عملية الميالين في الكائن الحي. العوامل المساهمة الأخرى ، مثل الأنسجة المحيطة ، والبيئة المكروية ، والخلايا المناعية ، والإشارات من الهياكل البعيدة ، غير ممثلة في هذا النموذج. ومع ذلك ، توفر هذه الطريقة نموذجا مناسبا للتحقيق في الميالين في الجهاز العصبي الطرفي عن طريق التحليل والتلاعب المنفصلين لكلا النوعين من الخلايا9،15،16. يمكن حصاد خلايا Schwann أو DRG للاستزراع المشترك من الحيوانات المريضة أو المعالجة لفك تشفير مساهمة نوع الخلية المحدد17,18. عند استخدام المراحل المتأخرة من هذا الإعداد ، يوصى بشدة بتضمين حالة تحكم دون إضافة خلايا Schwann بشكل إضافي ، لاستبعاد الآثار المحتملة لخلايا Schwann المشتقة من DRG. في تجربتنا ، تم الكشف عن الميالين في DRG explants بدون خلايا Schwann بدرجة أقل بكثير مما كانت عليه في الزراعة المشتركة (الشكل التكميلي 2).

يوفر استخدام DRG explants ميزة العمارة الهيكلية السليمة مقارنة بالثقافات العصبية المنفصلة. يسمح التلوين المناعي لبروتين المايلين الأساسي (MBP) بتحديد منطقة المحور العصبي المياليني ، ويوفر قراءة كافية للميالين في الثقافة المشتركة. كشف تحليل التعبير الجيني لعينات الزراعة المشتركة في اليوم 22 عن وجود MBP ، وبروتين المايلين المحيطي (PMP22) ، والبروتين السكري المرتبط بالمايلين (MAG) ، وعامل ربط الأوكتامير 6 (Oct6) ، والجين المرتبط ب ETS 2 (Erg2) ، وعامل نسخ الخلايا قليلة التغصن 1 (Olig1) ، مع أعلى مستويات التعبير ل MBP و PMP22 (الشكل التكميلي 3). ومن ثم ، فإن البروتوكول الموصوف يوفر طريقة مع العديد من الخيارات المستهدفة لعلامات الميالين في الثقافة المشتركة.

تشمل التطبيقات المحتملة لهذه الطريقة مناهج البحث الأساسية حول عملية الميالين في المحيط ، بالإضافة إلى التحقق من صحة المركبات العلاجية لأمراض الجهاز العصبي الطرفي ، بما في ذلك تلف الميالين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نشكر الأستاذ الدكتور رالف جولد والأستاذة الدكتورة جيسا إلريشمان على نصائحهم ودعمهم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-MBP, rabbit Novus Biologicals, Centannial, USA ABIN446360
Anti-ßIII-tubulin, mouse  Biolegend, San Diego, USA 657402
Ascorbic acid  Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  A4403-100MG
B27-supplement Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  17504-044
Biosphere Filter Tip, 100 µL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  70760212
Biosphere Filter Tip, 1250 µL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  701186210
Biosphere Filter Tip, 20 µL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  701114210
Biosphere Filter Tip, 300 µL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  70765210
Bovine serum albumin Carl Roth, Karlsruhe, Germany  8076.4
Cell strainer, 100 µM BD Bioscience, Heidelberg, Germany 352360
Centrifuge 5810-R Eppendorf AG, Hamburg, Germany 5811000015
CO2 Incubator Heracell Heraeus Instruments, Hanau, Germany  51017865
Coverslips 12 mm Carl Roth, Karlsruhe, Germany  P231.1
Curved fine forceps  Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 11370-42
DAPI fluoromount-G(R) Biozol, Eching, Germany SBA-0100-20
Dispase II Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  4942078001
Distilled water (Water Purification System)  Millipore, Molsheim, France ZLXS5010Y
DMEM/F-12, GlutaMAX Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  31331093
DPBS (no Ca2+ and no Mg2+) Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  D8537-6X500ML
Ethanol  VWR, Radnor, USA  1009862500
FCS Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  F7524 FCS must be tested for Schwann cell culture
Fine forceps (Dumont #5) Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 11252-20
Forceps Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 11370-40
Forskolin Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  F6886-10MG
Gelatin Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  G1393-20ML
Gentamycin Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany 5710064
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  A11036
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  A11001
HBSS (no Ca2+ and no Mg2+)  Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  14170138
HERAcell Incubator Heraeus Instruments, Hanau, Germany  51017865
Heraguard ECO 1.2 Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  51029882
Horse serum Pan-Biotech, Aidenbach, Germany P30-0712
Image J Software HIH, Bethesda, USA
Laminin Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  L2020-1MG
Leibovitz´s L-15 Medium Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  11415064
L-Glutamine 200 mM  Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  25030024
MACS Multistand  Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130042303
Microscissors Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 15000-08
Microscope  Motic, Wetzlar, Germany Motic BA 400
Microscope Axio observer 7 Zeiss, Oberkochen, Germany  491917-0001-000
Microscope slide VWR, Radnor, USA  630-1985
MiniMACS separator Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130091632
MS columns Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130-042-201
Neubauer counting chamber  Assistant, Erlangen, Germany 40441  
Neuregulin Peprotech, Rocky Hill, USA 100-03
Neurobasal medium  Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  21103049
NGF Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  N1408
Normal goat serum Biozol, Eching, Germany S-1000
Nunclon Δ multidishes, 4 well Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  D6789
Paraformaldehyde Acros Organics, New Jersey, USA  10342243
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  15140-122
Pipetboy Eppendorf AG, Hamburg, Germany 4430000018 
Pipettes Eppendorf AG, Hamburg, Germany 2231300004
Poly-D-Lysin Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  P6407-5MG
Poly-L-Lysin Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  P4707-50ML
Reaction tubes, 15 mL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  62554502
Reaction tubes, 50 mL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  62547254
Reaction vessels, 1.5 mL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  72690001
Safety Cabinet S2020 1.8 Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  51026640
Scissors Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 14083-08
Serological pipette, 10 mL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  861254025
Serological pipette, 25 mL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  861685001
Serological pipette, 5 mL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  861253001
Spatula Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 10094-13
Stereomicroscope Discovery.V8 Zeiss, Oberkochen, Germany  495015-0012-000 
Surgical scissors Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 14007-14
TC dish 100, cell + Sarstedt, Nümbrecht, Germany  833902300
TC dish 35, cell + Sarstedt, Nümbrecht, Germany  833900300
TC dish 60, cell + Sarstedt, Nümbrecht, Germany  833901300
Thy-1 Microbeads (MACS Kit) Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130-094-523
Triton X-100  Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  X100-500ML
Trypan Blue Solution 0.4%  Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  15250061
Trypsin (2.5%), no phenol red Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  15090-046
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  25300-054
Type I Collagenase Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  C1639
Water bath type 1008 GFL, Burgwedel, Germany  4285

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).
  2. Taveggia, C. Schwann cells-axon interaction in myelination. Current Opinion in Neurobiology. 39, 24-29 (2016).
  3. Gordon, T. Peripheral nerve regeneration and muscle reinnervation. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8652 (2020).
  4. Nocera, G., Jacob, C. Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (20), 3977-3989 (2020).
  5. Modrak, M., Talukder, M. A. H., Gurgenashvili, K., Noble, M., Elfar, J. C. Peripheral nerve injury and myelination: Potential therapeutic strategies. Journal of Neuroscience Research. 98 (5), 780-795 (2020).
  6. Salzer, J. L., Bunge, R. P., Glaser, L. Studies of Schwann cell proliferation. III. Evidence for the surface localization of the neurite mitogen. The Journal of Cell Biology. 84 (3), 767-778 (1980).
  7. Wood, P. M., Bunge, R. P. Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells. Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).
  8. Eldridge, C. F., Bunge, M. B., Bunge, R. P., Wood, P. M. Differentiation of axon-related Schwann cells in vitro. I. Ascorbic acid regulates basal lamina assembly and myelin formation. The Journal of Cell Biology. 105 (2), 1023-1034 (1987).
  9. Paivalainen, S., et al. Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures. Molecular and Cellular Neuroscience. 37 (3), 568-578 (2008).
  10. Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140 (4), 898-913 (2017).
  11. Taveggia, C., Bolino, A. DRG neuron/Schwann cells myelinating cocultures. Methods in Molecular Biology. 1791, 115-129 (2018).
  12. Andersen, N. D., Srinivas, S., Pinero, G., Monje, P. V. A rapid and versatile method for the isolation, purification and cryogenic storage of Schwann cells from adult rodent nerves. Scientific Reports. 6, 31781 (2016).
  13. Pitarokoili, K., et al. Intrathecal triamcinolone acetonide exerts anti-inflammatory effects on Lewis rat experimental autoimmune neuritis and direct anti-oxidative effects on Schwann cells. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 58 (2019).
  14. Grüter, T., et al. Immunomodulatory and anti-oxidative effect of the direct TRPV1 receptor agonist capsaicin on Schwann cells. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 145 (2020).
  15. Lehmann, H. C., Höke, A. Schwann cells as a therapeutic target for peripheral neuropathies. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 9 (6), 801-806 (2010).
  16. Joshi, A. R., et al. Loss of Schwann cell plasticity in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP). Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 255 (2016).
  17. Klimas, R., et al. Dose-dependent immunomodulatory effects of bortezomib in experimental autoimmune neuritis. Brain Communications. 3 (4), (2021).
  18. Szepanowski, F., et al. LPA1 signaling drives Schwann cell dedifferentiation in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 18 (1), 293 (2021).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 192 ،
الميالين في المختبر للمحاور المحيطية في زراعة مشتركة لنباتات العقدة الجذرية الظهرية للفئران وخلايا شوان
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blusch, A., Sgodzai, M., Rilke, N.,… More

Blusch, A., Sgodzai, M., Rilke, N., Motte, J., König, J., Pitarokoili, K., Grüter, T. In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells. J. Vis. Exp. (192), e64768, doi:10.3791/64768 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter