Summary
Dieses Protokoll enthält häufig verwendete Zytotoxizitätstests (Alamar Blue [AB], CFDA-AM-, Neutral Red- und MTT-Assays), die für die Bewertung der Zytotoxizität in Zebrafischembryo- (ZEM2S) und Leberzelllinien (ZFL) in 96-Well-Platten geeignet sind.
Abstract
Fischzelllinien werden zunehmend in Ökotoxizitätsstudien verwendet, und Zytotoxizitätstests wurden als Methoden zur Vorhersage der akuten Toxizität von Fischen vorgeschlagen. Daher enthält dieses Protokoll Zytotoxizitätsassays, die modifiziert wurden, um die Zelllebensfähigkeit in Zebrafisch- (Danio rerio), Embryo- (ZEM2S) und Leber- (ZFL) Zelllinien in 96-Well-Platten zu bewerten. Die bewerteten Endpunkte der Zytotoxizität sind die mitochondriale Integrität (Alamar Blue [AB]- und MTT-Assays), die Membranintegrität über die Esteraseaktivität (CFDA-AM-Assay) und die lysosomale Membranintegrität (Neutral Red [NR]-Assay). Nach der Exposition der Testsubstanzen in einer 96-Well-Platte werden die Zytotoxizitätstests durchgeführt; Hier werden AB und CFDA-AM gleichzeitig durchgeführt, gefolgt von NR auf derselben Platte, während der MTT-Assay auf einer separaten Platte durchgeführt wird. Die Messwerte für diese Assays werden durch Fluoreszenz für AB und CFDA-AM und Absorption für MTT und NR ermittelt. Die mit diesen Fischzelllinien durchgeführten Zytotoxizitätstests können verwendet werden, um die akute Toxizität chemischer Substanzen an Fischen zu untersuchen.
Introduction
Chemische Stoffe müssen auf ihre Sicherheit für die menschliche Gesundheit und die Umwelt geprüft werden. Molekulare und zelluläre Biomarker werden zunehmend in Sicherheitsbewertungen zur Vorhersage von Auswirkungen auf lebende Organismen durch Regulierungsbehörden und/oder Gesetzgebungen (z. B. REACH, OECD, US-EPA)1,2 berücksichtigt, da sie dem unerwünschten In-vivo-Ergebnis (z. B. endokrine Störung, immunologische Reaktion, akute Toxizität, Phototoxizität) vorausgehen können3,4,5,6,7 . In diesem Zusammenhang wurde die Zytotoxizität als Maß für die Vorhersage der akuten Toxizität von Fischen herangezogen 5,8; Es kann jedoch viele andere Anwendungen in Ökotoxizitätsstudien haben, wie z. B. die Definition subzytotoxischer Konzentrationen chemischer Substanzen, um ihre unterschiedlichsten Auswirkungen auf Fische zu untersuchen (z. B. endokrine Disruptoren).
In Zellkultursystemen (In-vitro-Systemen ) kann die Zytotoxizität chemischer Substanzen durch Methoden bestimmt werden, die sich in der Art der Endpunkte unterscheiden. Zum Beispiel kann eine Zytotoxizitätsmethode auf einem Endpunkt basieren, der sich auf die spezifische Morphologie bezieht, die während des Zelltodprozesses beobachtet wird, während eine andere die Zytotoxizität durch Messung des Zelltods, der Lebensfähigkeit und Funktionalität, der Morphologie, des Energiestoffwechsels sowie der Zellanhaftung und -proliferation bestimmen kann. Chemische Substanzen können die Zelllebensfähigkeit durch verschiedene Mechanismen beeinflussen, daher ist eine Bewertung der Zytotoxizität erforderlich, die verschiedene Endpunkte der Zelllebensfähigkeit abdeckt, um chemische Wirkungen vorherzusagen9.
MTT und Alamar Blue (AB) sind Assays, die die Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit auf der Grundlage der Zellstoffwechselaktivität bestimmen. Der MTT-Assay bewertet die Aktivität des mitochondrialen Enzyms Succinat-Dehydrogenase10. Die Reduktion von gelblichem 3-[4,5-Dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) zu Formazanblau tritt nur in lebensfähigen Zellen auf, und seine optische Dichte ist direkt proportional zur Anzahl lebensfähiger Zellen10. Der AB-Assay ist ein empfindlicher Oxidations-Reduktions-Indikator, der durch mitochondriale Enzyme vermittelt wird, die fluoreszieren und ihre Farbe ändern, wenn Resazurin von lebenden Zellen zu Resorufin reduziertwird 11; aber auch zytosolische und mikrosomale Enzyme tragen zur Reduktion von AB und MTT12 bei. Diese Enzyme können mehrere Reduktasen umfassen, wie z. B. Alkohol- und Aldehydoxidoreduktasen, NAD(P)H: Chinonoxidoreduktase, Flavinreduktase, NADH-Dehydrogenase und Cytochrome11.
Der Neutral Red (NR)-Assay ist ein Zellviabilitätstest, der auf dem Einbau dieses Farbstoffs in die Lysosomen lebensfähiger Zellenbasiert 13. Die Aufnahme von NR hängt von der Fähigkeit der Zellen ab, pH-Gradienten aufrechtzuerhalten. Der Protonengradient innerhalb der Lysosomen hält einen niedrigeren pH-Wert als das Zytoplasma aufrecht. Bei normalem physiologischen pH-Wert weist der NR eine Nettoladung von ungefähr Null auf, wodurch er die Zellmembranen durchdringen kann. Somit wird der Farbstoff geladen und bleibt in den Lysosomen zurück. Folglich ist die Anzahl der lebensfähigen Zellen14 umso größer, je größer die Menge an zurückgehaltenem NR ist. Chemische Substanzen, die die Zelloberfläche oder die lysosomalen Membranen schädigen, beeinträchtigen die Aufnahme dieses Farbstoffs.
Der CFDA-AM-Assay ist ein fluorometrischer Zellviabilitätstest, der auf der Retention von 5-Carboxyfluorescein-Diacetat-Acetoxymethylester (CFDA-AM)15 basiert. 5-CFDA-AM, ein Esterasesubstrat, wird in Carboxyfluorescein umgewandelt, eine fluoreszierende Substanz, die polar und durch Membranen lebender Zellen nicht durchlässig ist15; Somit wird es in der Innenseite einer intakten Zellmembran zurückgehalten, was auf lebensfähige Zellen hinweist.
Kürzlich wurden drei Zytotoxizitätstests (CFDA-AM-, NR- und AB-Assays) in einer validierten ISO-Richtlinie (International Organization for Standardization) (ISO 21115:2019)16 und einer OECD-Testmethode (OECD TG 249) kombiniert, um die akute Toxizität von Fischen unter Verwendung der RTgill-W1-Zelllinie (permanente Zelllinie aus der Kieme der Regenbogenforelle [Oncorhynchus mykiss]) in 24-Well-Plattenzu bewerten 17 . Obwohl es eine bestehende zellbasierte Methode zur Vorhersage der akuten Toxizität von Fischen gibt, wurden Anstrengungen unternommen, um ähnliche Methoden mit anderen Fischarten zu entwickeln und den Durchsatz der Methode zu erhöhen. Einige Beispiele umfassen die Entwicklung von ZFL-Zelllinien, die mit Reportergenen für spezifische Toxizitätswege18,19 transfiziert wurden, Phototoxizitätstests in der RTgill-W1-Zelllinie 20 und die Verwendung von ZFL- und ZF4-Zelllinien (Zebrafisch-Fibroblasten, die aus 1 Tag alten Embryonen gewonnen wurden) zur Bewertung der Toxizität durch mehrere Zytotoxizitätstests21.
Danio rerio (Zebrafisch) ist eine der wichtigsten Fischarten, die in aquatischen Toxizitätsstudien verwendet werden. Daher können zellbasierte Methoden mit Zebrafisch-Zelllinien für die Toxizitätsprüfung von Fischen äußerst nützlich sein. Die ZFL-Zelllinie ist eine zebrafischepitheliale Hepatozytenzelllinie, die die Hauptmerkmale von Leberparenchymzellen aufweist und Xenobiotika 7,22,23,24,25 metabolisieren kann. Inzwischen ist die ZEM2S-Zelllinie eine embryonale Zebrafisch-Fibroblasten-Zelllinie, die aus dem Blastula-Stadium stammt und zur Untersuchung von Entwicklungseffekten auf Fische verwendet werden kann26,27. Daher beschreibt dieses Protokoll vier Zytotoxizitäts-Assays (MTT-, AB-, NR- und CFDA-AM-Assays), deren Modifikationen mit ZFL- und ZEM2S-Zelllinien in 96-Well-Platten durchgeführt werden müssen.
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Protocol
ANMERKUNG: In der Materialtabelle finden Sie die Liste der in diesem Protokoll verwendeten Materialien und in Tabelle 1 die Zusammensetzung der in diesem Protokoll verwendeten Lösungen und Medien.
1. Vorbereitung von ZFL- und ZEM2S-Zellen
- Beginnen Sie mit einem T75-Kolben aus ZFL- oder ZEM2S-Zellen mit 80% Konfluenz, kultiviert im jeweiligen vollständigen Medium bei 28 °C ohne CO2.
- Nehmen Sie das Nährmedium aus dem Kolben und waschen Sie die Zellen unter Zugabe von 10 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (0,01 M). 3 ml 1x Trypsin (0,05% v/v; 0,5 mM Trypsin-EDTA) in die Kulturkolben geben. Bei 28 °C 3 min inkubieren.
- Klopfen Sie vorsichtig auf den Kolben, um die Zellen freizusetzen, und stoppen Sie dann die Trypsinverdauung, indem Sie 3 ml vollständiges Nährmedium in den Kolben geben.
- Die Zellsuspension wird in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und 5 Minuten lang bei 100 × g zentrifugiert.
- Entfernen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig den Überstand, fügen Sie 1 ml vollständiges Medium für ZFL- oder ZEM2S-Zellen hinzu und resuspendieren Sie das Pellet mit einer Mikropipette.
2. Zellzählung durch Ausschluss von Trypanblau
- Geben Sie 10 μl der Zellsuspension und 10 μl Trypanblau-Farbstoff in ein Mikroröhrchen, um die Zellen zu zählen und ihre Lebensfähigkeit zu bewerten. Mischen Sie die Zellsuspension und färben Sie sie mit einer Pipette.
- Übertragen Sie dann 10 μl dieser Mischung (Zellsuspension + Trypanblau) in eine Neubauer-Kammer und zählen Sie die Zellen in den vier großen Quadraten (Quadranten Q), die an den Ecken der Kammer platziert sind, wobei lebensfähige Zellen als solche betrachtet werden, die kein Trypanblau aufnehmen. Bestimmen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit Gleichung (1):
Bewertungen (1) - Berechnen Sie die endgültige Zellzahl in der Zellsuspension, indem Sie die mit Gleichung (1) ermittelte Zellzahl mit zwei multiplizieren (der Verdünnungsfaktor aufgrund der Verwendung von Trypanblau).
HINWEIS: Alternativ kann ein automatisiertes Zellzählsystem (z. B. ein Zytomer mit Zellzähl- und Viabilitätsfunktion) verwendet werden.
Bewertungen (1)3. Zellplattierung in 96-Well-Platten
- Berechnen Sie das Zellsuspensionsvolumen, das benötigt wird, um die Anzahl der Zellen zu erhalten, die zur Durchführung der Zytotoxizitätstests erforderlich sind. Die Anzahl der lebensfähigen Zellen für jede Zelllinie ist unten angegeben:
- Platte 60.000 lebensfähige ZEM2S-Zellen pro Well; Verwenden Sie daher für die gesamte Platte sechs Millionen Zellen in 20 ml vollständigem Medium (200 μl/Well, 96-Well-Platte).
- Platte 40.000 lebensfähige ZFL-Zellen pro Well; Verwenden Sie daher für die gesamte Platte vier Millionen Zellen in 20 ml vollständigem Medium (200 μl/Well, 96-Well-Platte).
- Danach wird das jeweilige Volumen der Zellsuspension in ein Reagenzreservoir (steril) überführt und mit dem kompletten Nährmedium für ZFL oder ZEM2S auf 20 ml aufgefüllt. Mischen Sie die Lösung mit einer Mehrkanalpipette vorsichtig auf und ab.
HINWEIS: Achten Sie darauf, keinen Schaum oder Blasen zu bilden. - Geben Sie 200 μl der Zellsuspension mit der Mehrkanal-Mikropipette in jede Vertiefung einer transparenten Polystyrol-96-Well-Platte. Die Platten werden 24 h lang bei 28 °C inkubiert.
HINWEIS: Die Platte muss mindestens drei Vertiefungen ohne Zellen für die Blindkontrolle aufweisen, und diesen Vertiefungen sollten nur vollständige Medien zugesetzt werden. Der Randeffekt (verursacht durch eine höhere Verdunstung in den Randvertiefungen) tritt häufig bei 96-Well-Plattenassays auf und kann die Lebensfähigkeit der Zellen in den Randvertiefungen der Platte28 beeinträchtigen. Dieser Effekt kann je nach Marke und Design der 96-Well-Platte höher oder niedriger sein28. Obwohl wir in den Randvertiefungen keine Störung des Zellwachstums/der Lebensfähigkeit von ZFL und ZEM2S festgestellt haben, empfehlen wir, die Platte mit Parafilm oder Klebesiegelfolie zu versiegeln, um diesen Effekt zu verhindern, oder die Zellen nur in den 60 Innenvertiefungen zu kultivieren und die Randvertiefungen mit PBS zu füllen.
4. Exposition von Zellen gegenüber Prüfchemikalien
- Entsorgen Sie das verbrauchte Medium vorsichtig mit einer Mehrkanal-Mikropipette aus den Vertiefungen.
- Setzen Sie die Zellen Testchemikalien in unterschiedlichen Konzentrationen aus. Bereiten Sie die Lösungen der Prüfchemikalienkonzentrationen in den Nährmedien für ZFL oder ZEM2S ohne fötales Rinderserum (FBS) (Expositionsmedien) vor. Fügen Sie dann 100 μl dieser Lösungen pro Vertiefung in technischer Verdreifachung hinzu (d. h. drei Vertiefungen/Testchemikalienkonzentration).
- Für Kontrollen werden die Kontrollgruppen in technischen Dreifachteilen (drei Vertiefungen/Kontrollgruppe) auf die gleiche Platte wie die Prüfchemikalie gelegt. So werden für die Blindkontrolle (B) 100 μl des Belichtungsmediums in die zellfreien Vertiefungen gegeben, für die Negativkontrolle (NC) 100 μl des Belichtungsmediums in Vertiefungen mit Zellen gegeben und für die Positivkontrolle (PC) die Zellen einer Lösung von 1% Triton X-100 ausgesetzt, die in den Belichtungsmedien hergestellt wurde. In einigen Fällen sollte eine Lösungsmittelkontrolle (SC) in die Platte aufgenommen werden, wobei eine eindeutig nicht-zytotoxische Konzentration als endgültige Lösungsmittelkonzentration berücksichtigt wird.
HINWEIS: Es wird empfohlen, 0,5% DMSO als Lösungsmittel zu verwenden; DMSO kann in diesen Zelllinien bis zu 1% als Lösungsmittel verwendet werden, ohne die Zytotoxizitätsschwelle von 10% in Bezug auf die Negativkontrolle zu überschreiten. - Die Platten werden 24 h lang bei 28 °C inkubiert. Versiegeln Sie die Platten mit Parafilm oder selbstklebender Siegelfolie, um die Verdunstung des Nährmediums zu verhindern.
ANMERKUNG: Bestimmte Chemikalien können eine intrinsische Hintergrundabsorption oder Fluoreszenz aufweisen, die die Absorption oder Fluoreszenz des/der Indikatorfarbstoff(e) beeinträchtigen kann (z. B. können Verbindungen mit Farbe die Absorption, das Serumalbumin29 und Verbindungen, die die Reduktionsenzymestören 30,31). In diesem Fall muss die Platte eine zusätzliche Kontrolle enthalten, indem Testchemikalienlösungen in die Vertiefungen ohne Zellen gegeben werden. Damit soll die mögliche Interferenz der chemischen Autoabsorption/Autofluoreszenz mit den Farbstoffen überprüft werden. Wenn eine Interferenz festgestellt wird, sollte bewertet werden, ob sie ausgeschlossen werden kann, um eine korrekte Vorhersage der Zytotoxizität zu erhalten.
5. Zytotoxizitäts-Assays
HINWEIS: Bereiten Sie alle Lösungen gemäß Tabelle 1 vor. Alle unten beschriebenen Schritte (Abbildung 1) werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Die Verwendung einer Pipette zum Verwerfen des Expositionsmediums wird nicht empfohlen, da sich die Zellen nach einer chemischen Behandlung leicht von den Vertiefungen lösen können.
- AB- und CFDA-AM-Assays
- Entsorgen Sie das Expositionsmedium nach 24 Stunden Exposition gegenüber der Prüfchemikalie vorsichtig, indem Sie den Inhalt in eine Auffangschale gießen.
- Waschen Sie den Teller mit 200 μl PBS. Entfernen Sie das PBS vorsichtig, indem Sie es in eine Auffangschale gießen, um den Verlust von Zellen zu vermeiden.
- Fügen Sie 100 μl AB/CFDA-AM-Lösung pro Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang im Dunkeln bei 28 °C.
- Messen Sie die Fluoreszenz in einem Fluoreszenzplatten-Reader bei 530 nm (Anregung) und 595 nm (Emission) für AB und bei 493 nm (Anregung) und 541 nm (Emission) für CFDA-AM.
- NR-Assay
ANMERKUNG: Die Schritte für den NR-Assay werden unmittelbar nach den AB- und CFDA-AM-Assays durchgeführt (Abbildung 1).- Zentrifugieren Sie die NR-Arbeitslösung (40 μg/ml) bei 600 × g für 10 min.
HINWEIS: Die Ausfällung von NR im Röhrchen darf nicht auf die Platten übertragen werden. Sammeln Sie daher nach dem Zentrifugieren der NR-Arbeitslösung den Überstand mit einer Pipette, ohne die NR-Ausfällungen abzusaugen. Übertragen Sie den Überstand in ein Reagenzreservoir. - Entfernen Sie die AB/CFDA-AM-Lösung vorsichtig, indem Sie den Inhalt in eine Auffangschale gießen.
- 100 μl der NR-Arbeitslösung pro Well mit einer Mehrkanal-Mikropipette zugeben. Die Platte wird 3 h bei 28 °C inkubiert.
HINWEIS: Beobachten Sie nach der 3-stündigen Inkubation mit einem Mikroskop, ob in den Platten NR-Niederschlag aufgetreten ist. NR-Ausfällungen können die Quantifizierung der Zelllebensfähigkeit beeinträchtigen und sollten daher nicht vorhanden sein. - Entfernen Sie die NR-Lösung vorsichtig, indem Sie den Inhalt in eine Auffangschale gießen. Waschen Sie die Vertiefungen, indem Sie 150 μl PBS pro Vertiefung hinzufügen.
- Fügen Sie 150 μl der NR-Extraktionslösung pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Platte 10 Minuten lang auf einem Tellerschüttler zum sanften Schütteln. Messen Sie die Absorption bei 540 nm in einem Plattenleser.
HINWEIS: Eine zweite Anzeige bei 690 nm sollte durchgeführt werden, um eine Absorption von Fingerabdrücken im Hintergrund in der Platte auszuschließen.
- Zentrifugieren Sie die NR-Arbeitslösung (40 μg/ml) bei 600 × g für 10 min.
- MTT-Assay
ANMERKUNG: Der MTT-Test muss getrennt von den oben beschriebenen Assays (in einer neuen Platte) durchgeführt werden (Abbildung 2).- Entfernen Sie das Belichtungsmedium vorsichtig, indem Sie den Inhalt in ein Auffangfach gießen.
- 100 μl MTT-Arbeitslösung pro Well mit einer Mehrkanal-Mikropipette zugeben. Inkubieren Sie die Platte bei 28 °C für 4 h.
- Entsorgen Sie die MTT-Lösung, indem Sie den Inhalt in eine Auffangschale gießen.
- Fügen Sie 100 μl DMSO pro Vertiefung hinzu, um die Formazankristalle zu extrahieren, und inkubieren Sie die Platte 10 Minuten lang auf einem Tellerschüttler. Messen Sie die Absorption bei 570 nm mit einem Plattenleser.
HINWEIS: Eine zweite Anzeige bei 690 nm sollte durchgeführt werden, um eine Absorption von Fingerabdrücken im Hintergrund in der Platte auszuschließen. Es ist wichtig zu beachten, dass Prüfchemikalien die MTT stören können, die bewertet werden muss, um die Qualität der erzeugten Datenzu gewährleisten 32. Dazu sollten zellfreie Vertiefungen, die die Testkonzentrationen und MTT (0,5 mg/ml) enthalten, exponiert werden, gefolgt von einer Inkubation, um jede Farbveränderung in den Vertiefungen zu beobachten, die die Absorption erhöhen und zu falschen Viabilitätsergebnissen führen kann. Chemikalien, die mit MTT interagieren, müssen bei diesem Test vermieden werden.
6. Berechnung der Zelllebensfähigkeit/Zytotoxizität
ANMERKUNG: Die erfasste Rohabsorption oder -fluoreszenz wird verwendet, um die Zellviabilität als Prozentsatz in Bezug auf die Negativkontrolle (für Prüfchemikalien, die direkt in Expositionsmedien hergestellt werden) oder die Lösungsmittelkontrolle (für Prüfchemikalien, die mit Lösungsmitteln hergestellt werden, wie z. B. DMSO) zu berechnen. Vor dem Bestimmen des Prozentsatzes der Zellviabilität müssen die Rohdaten durch das leere Steuerelement normalisiert werden.
- Berechnen Sie die durchschnittliche Absorption oder Fluoreszenz für jede Prüfchemikalienkonzentration und Kontrollgruppe (drei Vertiefungen/Behandlung).
- Um den Prozentsatz der Zellviabilität relativ zur Kontrolle (negativ oder Lösungsmittel) zu bestimmen, verwenden Sie Gleichung (2):
Bewertungen (2)
ANMERKUNG: Die Einheiten Absorption (abs) oder Fluoreszenz (Fluo) stellen den Mittelwert der Absorption oder Fluoreszenz dar, der in den drei Vertiefungen pro Konzentration gemessen wird. blank steht für Vertiefungen ohne Zellen.
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Representative Results
Abbildung 3 zeigt die Platten der AB-, CFDA-AM-, NR- und MTT-Assays. Für den AB-Assay (Abbildung 3A) zeigen die Blindvertiefungen und Vertiefungen ohne oder mit einer reduzierten Anzahl lebensfähiger Zellen eine blaue Farbe und eine geringe Fluoreszenz, während die Vertiefungen mit einer hohen Anzahl lebensfähiger Zellen rosa sind und aufgrund der Umwandlung von Resazurin (AB) in Resorufin (rosafarbene Substanz) durch die lebensfähigen Zellen hohe Fluoreszenzwerte aufweisen. Für den CFDA-AM-Assay gibt es keinen sichtbaren Unterschied in der Farbe der Vertiefungen auf der Platte; Die Fluoreszenz ist jedoch in Vertiefungen, die lebensfähige Zellen enthalten, aufgrund der Retention von CFDA-AM und der anschließenden Umwandlung in Carboxyfluorescein (fluoreszierende Substanz) höher.
Für den NR-Assay (Abbildung 3B) müssen die Blindvertiefungen transparent sein und sehr niedrige Absorptionswerte aufweisen, da es keine Zellen gibt, die den NR-Farbstoff zurückhalten. In einigen Fällen sind die leeren Vertiefungen nicht transparent, was auf das Auftreten von NR-Niederschlag auf der Platte hinweist. In diesem Fall sollte dies nicht als gültiges Experiment angesehen werden. Stark zytotoxische Konzentrationen der Testchemikalien und PC sind transparent oder weisen eine sehr hellrosa Farbe mit niedrigen Absorptionswerten auf, während Vertiefungen, die lebensfähige Zellen enthalten, den NR-Farbstoff beibehalten und eine dunkelrosa Farbe und hohe Absorptionswerte aufweisen.
Für den MTT-Assay (Abbildung 3C) müssen die Blindvertiefungen transparent und mit sehr geringer Absorption sein, da keine Zellen vorhanden sind, um MTT in Formazan umzuwandeln. Stark zytotoxische Konzentrationen der Prüfchemikalien und des PC sind transparent oder weisen eine sehr hellviolette Farbe mit niedrigen Absorptionswerten auf, während Vertiefungen, die lebensfähige Zellen enthalten, das MTT (gelb) in Formazan (violette Substanz) umwandeln und eine dunklere violette Farbe mit hohen Absorptionswerten aufweisen.
Abbildung 4A zeigt eine repräsentative Grafik der Zellviabilität nach der Berechnung unter Verwendung der Durchschnittswerte der Fluoreszenz- oder Absorptionswerte pro Gruppe. Die Grafik kann mit der Eingabe von prozentualen Rentabilitätswerten, die nach der in Protokollabschnitt 6 dargestellten Rentabilitätsberechnungsformel berechnet werden, unter Verwendung einer Datenanalysesoftware dargestellt werden. Die Lebensfähigkeit von Zellen, die dem SC ausgesetzt sind, sollte nicht um 10% niedriger sein als im NC17. Der Prozentsatz der Zellviabilität für die Testchemikalien wird in Abhängigkeit von ihrer Löslichkeit in Bezug auf NC oder SC berechnet. In diesem Fall werden unterschiedliche Konzentrationen von DMSO als Testsubstanz verwendet und die Zelllebensfähigkeit hängt mit NC zusammen, was als 100%ige Lebensfähigkeit definiert ist.
Die Zellviabilitätsdaten können verwendet werden, um die halbmaximale Hemmkonzentration (IC50) der Prüfchemikalien durch logarithmische Transformation und die interpolierte Standardkurve durch nichtlineare Regression nach geeigneten Replikaten 33,34,35 zu berechnen. Abbildung 4B zeigt den IC50, berechnet aus dem in Abbildung 4A gezeigten Prozentsatz der Lebensfähigkeit. Der IC50 wurde mit mindestens drei technischen Replikaten und drei experimentellen Replikaten unter Verwendung von Nennkonzentrationen im AB-Assay erhalten. Die Analysen wurden mit fünf verschiedenen Konzentrationen der Prüfsubstanzen durchgeführt; Je nach Art des Experiments kann jedoch eine höhere Anzahl von Konzentrationen erforderlich sein. Zum Beispiel werden acht Testkonzentrationen für den Range-Finding-Test empfohlen, der normalerweise durchgeführt wird, um die endgültigen Testkonzentrationen einer chemischen Substanz für ein Experiment zu bestimmen. Da die Viabilitätstests unterschiedliche Zytotoxizitätsendpunkte haben, empfehlen wir, den IC50 für jeden separat durchgeführten Assay zu berechnen, um Unterschiede in der Sensitivität zu identifizieren, die durch unterschiedliche Wirkmechanismen der chemischen Substanzen oder Unterschiede in der Empfindlichkeit zwischen Zelllinien verursacht werden. Die Unterschiede in den IC50-Werten der getesteten Chemikalien in verschiedenen Zelllinien können auch in Abhängigkeit von der Art des verwendeten Nährmediums variieren, da Unterschiede in der Zusammensetzung in Bezug auf Proteine und Lipide die chemische Bioverfügbarkeit beeinflussen können36. Darüber hinaus kann die Zytotoxizität vieler Chemikalien durch diese Assays bewertet werden. Der IC50 anderer Chemikalien, die in ZFL- und ZEM2S-Zelllinien bewertet wurden, ist in Abbildung 4B-H dargestellt.
Abbildung 1: Schematisches Protokoll der AB-, CFDA-AM- und NR-Assays, die in derselben 96-Well-Platte durchgeführt wurden. Abkürzungen: AB = Alamar Blue; CFDA-AM = 5-Carboxyfluorescein-Diacetat-Acetoxymethylester; NR = neutrales Rot; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Schematisches Protokoll des MTT-Assays, der in einer 96-Well-Platte durchgeführt wurde. Abkürzung: MTT = 3-[4,5-Dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse der AB-, CFDA-AM-, NR- und MTT-Assays. Die Bilder zeigen die Farbunterschiede in den Vertiefungen für Kontrollen und Testkonzentrationen in (A) AB- und CFDA-AM-, (B) NR- und (C) MTT-Assays. Abkürzungen: AB = Alamar Blue; CFDA-AM = 5-Carboxyfluorescein-Diacetat-Acetoxymethylester; NR = neutrales Rot; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung; B = Blank Wells (zellfreie Wells); SC = Lösungsmittelkontrolle (0,5% DMSO); NC = Negativkontrolle (Zellen im Nährmedium); PC = Positivkontrolle (1% Triton X-100). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Berechnung der Zellviabilität und der Viabilitätsdaten für verschiedene Prüfchemikalien. Die Berechnung der Zellviabilität unter Verwendung der Auslesedaten kann als Prozentsatz (%) der Zellviabilität in Bezug auf NC oder SC (A) ausgedrückt werden. Die Zytotoxizität einer Chemikalie kann bewertet werden, indem die Viabilitätsdaten verwendet werden, um eine Standardkurve durch nichtlineare Regression für verschiedene Testchemikalien (B-H) zu interpolieren. Die Daten werden als Mittelwert der Zellviabilität (Punkte) und Standardabweichung (Balken) von drei technischen Replikaten und drei experimentellen Replikaten (AB-Assay) dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: MTT-Assay in ZFL- und ZEM2S-Zellen, die 24 Stunden lang in Anwesenheit (10 %) und Abwesenheit (0 %, vollständig FBS-beraubt) kultiviert wurden. (A) ZFL-Zellen bei 0% und 10% FBS zeigen keinen signifikanten Unterschied in der Zellviabilität durch den Kruskall-Wallis-Test (p = 0,2286). (B) ZEM2S-Zellen bei 0% und 10% FBS zeigen keinen signifikanten Unterschied in der Zellviabilität durch Mann-Whitney-Test (p = 0,3429). Es wurde ein Signifikanzniveau von p < 0,05 berücksichtigt. Die Daten werden als Median- und Interquartilsabstand von drei technischen Replikaten ausgedrückt. Abkürzungen: n.s. = kein signifikanter Unterschied; FBS = fötales Rinderserum; MTT = 3-[4,5-Dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: MTT- und NR-Assays in ZFL- und ZEM2S-Zellen, die (24 h) mit DMSO in unterschiedlichen Konzentrationen (0,1 %, 0,5 % und 1 %) und Negativkontrolle behandelt wurden. DMSO-behandelte ZFL-Zellen zeigten in keiner getesteten Konzentration einen signifikanten Unterschied in der Zellviabilität in Bezug auf NC durch den (A) MTT-Assay (p = 0,074) und (B) NR-Assay (p = 0,216). DMSO-behandelte ZEM2S-Zellen zeigten keinen signifikanten Unterschied in der Zellviabilität in Bezug auf NC durch den (C) MTT-Assay (p = 0,422) und (D) NR-Assay (p = 0,287). Es wurde ein Signifikanzniveau von p < 0,05 im Kruskall-Wallis-Test berücksichtigt. Die Daten werden als Median- und Interquartilsabstand von drei technischen Replikaten ausgedrückt. Abkürzungen: n.s. = kein signifikanter Unterschied; NC = Negativkontrolle; MTT = 3-[4,5-Dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid; NR = Neutrales Rot. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Tabelle 1: Lösungen und Medien, die in diesem Protokoll verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Zytotoxizitätstests werden häufig für die In-vitro-Toxizitätsbewertung verwendet, und in diesem Protokollartikel werden vier häufig verwendete Zytotoxizitätstests vorgestellt, die für die Durchführung in Zebrafischzelllinien modifiziert wurden (d. h. Zelldichte für 96-Well-Platten, Inkubationszeit im MTT-Assay, FBS-Erschöpfung während der chemischen Expositionsbedingungen und maximal akzeptable Konzentration für die SC). Da diese Assays die Zytotoxizität anhand verschiedener Endpunkte der Zelllebensfähigkeit (Stoffwechselfunktion, lysosomale Membranintegrität und Zellmembranintegrität) quantifizieren, liefert die Kombination eine genaue Bewertung der chemischen Zytotoxizität in Zebrafischzelllinien. Dieses Protokoll empfiehlt auch die Kultivierung von ZFL- und ZEM2S-Zelllinien in einem CO2 -freien Zustand, da ihre Nährmedienzusammensetzung das Kultursystem ausreichend puffern und den pH-Wert bei 7,4 (physiologischer pH-Wert) halten kann. Die Zusammensetzung des Nährmediums und die CO2 -freie Umgebung, die in diesem Protokoll für beide Zelllinien vorgeschlagen werden, sind in der Literatur weit verbreitet. Die ZFL-Zelllinie wird üblicherweise in L-15- und RPMI-Medien mit oder ohne Zusatz von Natriumbicarbonat und ohne CO2 37,38,39,40,41,42,43 kultiviert. In der Zwischenzeit wird die ZEM2S-Zelllinie gemäß den Anweisungen des Bioressourcenzentrums kultiviert und ihre Nährmedien für CO2 -freie Kulturen formuliert. Daher kann das Gemisch aus CO2 und Luft für Zellen schädlich sein, wenn diese Art von Nährmedien44 verwendet wird.
Die chemische Exposition in einem Nährmedium ohne Zusatz von FBS wurde auf der Grundlage veröffentlichter Studien durchgeführt, die zeigten, dass die Bioverfügbarkeit der chemischen Substanzen in In-vitro-Assays signifikant durch ihre Bindung an Serumproteine beeinflusst wird. So zeigten Chen et al.45 , dass das Vorhandensein von Serumproteinen im RTgill-W1-Assay die Bioverfügbarkeit eines kationischen Tensids (C12-Benzalkonium) um das bis zu Dreieinhalbfache reduzieren kann. Die an FBS gebundene Chemikalie lag im Nährmedium 45 im Allgemeinen zwischen47 % und 90 %. Um dieses Problem zu vermeiden, haben wir die Zellviabilität von ZFL- und ZEM2S-Zellen in Kulturen, denen FBS vollständig entzogen wurde, 24 Stunden lang mit dem MTT-Assay bewertet. Die Ergebnisse zeigten keinen signifikanten Unterschied in der Zellviabilität von ZFL- oder ZEM2S-Kulturen mit (10%) und ohne (0%) FBS, was darauf hindeutet, dass diese Zebrafischzelllinien einer chemischen Behandlung in Nährmedien ohne FBS unterzogen werden können (Abbildung 5). Es ist wichtig zu betonen, dass eine Verringerung der FBS-Menge andere Konsequenzen für die chemische Bioverfügbarkeit haben kann. Zum Beispiel haben lipophile Chemikalien eine höhere Sorption gegenüber Laborgeräten und Platten aus Kunststoff, wodurch die chemische Bioverfügbarkeit verringertwird 36. Das Vorhandensein von FBS im Nährmedium kann jedoch die plastische Bindung verringern, da Serumbestandteile mit dem Kunststoff um die Bindung an die Chemikalien konkurrieren46. Die beste Entscheidung in Bezug auf den Prozentsatz der FBS-Supplementierung oder deren vollständigen Entzug kann von der Art der Prüfchemikalie abhängen. Zum Beispiel berichteten Pomponio et al.46 , dass, obwohl die Chemikalie Amiodaron in Abwesenheit von FBS eine höhere Bindung an Kunststoff aufweist, ihre Bioverfügbarkeit bei Verwendung von 10% FBS noch geringer ist. Für Mono-N-desethylamiodaron ist fast die gleiche Menge an das Serummedium und an die Wände gebunden46.
Organische Lösungsmittel (z. B. DMSO) werden im Allgemeinen empfohlen, bis zu 0,5% in In-vitro-Assays zu verwenden. Diese niedrige Konzentration kann jedoch die Prüfung höherer Konzentrationen von schlecht wasserlöslichen Chemikalien beeinträchtigen. Um dieses Problem zu vermeiden, untersuchten wir, ob höhere Konzentrationen von DMSO für ZFL- und ZEM2S-Zelllinien geeignet sind, die die Zytotoxizitätsschwelle von 10% nicht überschreiten. Dazu wurden unbehandelte Zellen (NCs) und Zellen, die mit unterschiedlichen DMSO-Konzentrationen (0,1 %, 0,5 % und 1 %) behandelt wurden, für die MTT- und NR-Assays verarbeitet. Die Ergebnisse zeigten keinen signifikanten Unterschied in der Zellviabilität gegenüber der Behandlungsgruppe im Vergleich zu NCs (Abbildung 6), was darauf hindeutet, dass unter diesen besonderen Bedingungen DMSO-Konzentrationen von bis zu 1% verwendet werden können. Andere Fischzelllinien unterstützen auch DMSO-Konzentrationen von mehr als 0,5%, was keine Besonderheit von ZFL- und ZEM2S-Zelllinien ist. Beispielsweise wurden maximale Lösungsmittelkonzentrationen von bis zu 2 % DMSO (ohne beobachtete zytotoxische Wirkung) in Zytotoxizitätstests unter Verwendung von CHSE-214 (Zelllinie aus Oncorhynchus tshawytscha Embryo)47, RTG-2 (Oncorhynchus mykiss Gonadenzelllinie)48,49,50 und PLHC-1 (Poeciliopsis lucida hepatozelluläre Karzinomzelllinie)48 angewendet Zellen. Die maximale Lösungsmittelkonzentration von 1 % DMSO wurde auch in Zytotoxizitätstests mit RTL-W1 (Oncorhynchus mykiss Gonadenzelllinie)51 und CCO (Ictalurus punctatus Ovarialzelllinie)52 Zellen verwendet. Laut Mori und Wakabayashi47 können Fischzelllinien eine geringere Empfindlichkeit gegenüber DMSO aufweisen als Säugetierzelllinien. Es ist jedoch wichtig zu betonen, dass die maximal akzeptable Konzentration von 1% DMSO ausschließlich für die Zytotoxizität definiert wurde und dies für andere Endpunkte (z. B. Genotoxizität, Epigenetik, proteinkodierende Genexpressionsanalyse) in ZFL- und ZEM2S-Zelllinien sorgfältig bewertet werden sollte.
Die MTT- und AB-Assays basieren auf der Stoffwechselaktivität, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Obwohl der MTT-Assay der am häufigsten verwendete Viabilitätstest ist, kann er im Vergleich zum AB-Assay etwas weniger empfindlich sein, wodurch die Zellviabilität in einigen Fällen überschätztwird 53. Die höhere Sensitivität des AB-Assays kann mit der Messmethode zusammenhängen, da die Fluoreszenzmessung empfindlicher ist als die kolorimetrische Messung15. Nichtsdestotrotz handelt es sich sowohl bei den AB- als auch bei den MTT-Assays um qualitativ hochwertige Assays zur Identifizierung zytotoxischer chemischer Substanzen, und ihre generierten Daten wurden verwendet, um gefährliche chemische Substanzen nach ihrem intrinsischen zytotoxischen Potenzial zu klassifizieren53.
Die Idee, den AB-, CFDA-AM- und NR-Assay in derselben Platte durchzuführen, basierte auf dem OECD TG 249 (RTgill-W1-Assay)17; Es wurden jedoch Modifikationen vorgenommen, um diese Assays in 96-Well-Platten durchzuführen und für Zebrafischzelllinien geeignet zu sein. Assays in 96-Well-Platten anstelle von 24-Well-Platten können für Hochdurchsatz-Zytotoxizitätstests in Fischzelllinien von Vorteil sein. Darüber hinaus verwendet der RTgill-W1-Assay nur L-15-Kulturmedium, während die ZFL- und ZEM2S-Zelllinien in einem Medium kultiviert werden, das D-Glucose enthält. Das Nährmedium ermöglicht es, den MTT-Assay in diesen Zelllinien durchzuführen, da Zelllinien, die in glukosefreiem Medium (z. B. nur L-15) kultiviert werden, die MTT-Reduktion in den Zellen sofort verringern und die Leistung dieses Assays beeinträchtigenkönnen 54. Dieses Protokoll ermöglicht die einfache Durchführung von vier verschiedenen Viabilitätstests in zwei Zebrafischzelllinien.
Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Auswirkungen chemischer Substanzen auf Fische unter Verwendung von In-vitro-Modellen zu untersuchen. Unterschiedliche Zelllinien können unterschiedliche Empfindlichkeiten haben, um chemische Effekte abzuschätzen, obwohl sie aus derselben Gruppe von Wirbeltieren stammen, wie z. B. Fische. Durch den Vergleich von ZFL- und ZF4-Zelllinien mit Fischembryonen zeigten Langu-Mitea et al.21 beispielsweise, dass ZFL in der Lage ist, ähnliche Ergebnisse zu erzielen wie der Toxizitätstest für Fischembryonen. Tanneberger et al.5 zeigten, dass die permanenten Fischzelllinien GSF, PLHC, RTG-2, RTgill-W1 und R1 im Vergleich zu in vivo (erwachsene Fische) unterschiedliche Sensitivitäten bei der Vorhersage der chemischen Fischtoxizität aufweisen. Obwohl RTgill-W1 (permanente Fischkiemenzelllinie) kürzlich als alternative Methode zur Vorhersage der akuten Toxizität von Fischen validiert wurde, sollte die Anwendbarkeit anderer Zelllinien in Ökotoxizitätsstudien untersucht werden. Unter Verwendung von Zelllinien aus verschiedenen Fischarten und Gewebeursprüngen sowie Entwicklungsstadien (ZEM2S: Embryo; ZFL: adulte Leber) kann einen wesentlichen Beitrag zu Ökotoxizitätsstudien leisten, da sie Auswirkungen im Zusammenhang mit bestimmten Stadien der Fischentwicklung und Zielorganen untersuchen kann. Daher sollten chemische Effekte mit verschiedenen Zellkulturen untersucht werden, die unterschiedliche Zielorte in Fischen widerspiegeln (z. B. Leber, Gonaden, Kieme, Gehirn), und nicht nur in einer einzelnen Zelllinie55.
Diese Protokolle können unterschiedliche Anwendungen in Ökotoxizitätsstudien haben, und ihre Verwendung ist nicht unbedingt auf die Vorhersage der akuten Toxizität von Fischen beschränkt. Zum Beispiel können sie verwendet werden, um subzytotoxische Konzentrationen zu definieren, um andere In-vitro-Toxizitätstests für Fische durchzuführen, wie z. B. die Bewertung endokrin wirksamer Wirkungen auf Fische. Darüber hinaus können die In-vitro-Zytotoxizitätsdaten auch dazu beitragen, physiologisch basierte toxikokinetische (PBTK) Modellierungen zu entwickeln und zu verbessern. Da sich PBTK auf die Verteilung einer Chemikalie in einem Organismus unter Berücksichtigung der verschiedenen Organe (wie Kieme, Leber oder Darm) konzentriert56, kann die Verwendung von Zelllinien verschiedener Fischarten und Gewebeursprünge eine nützliche Informationsquelle für dieses Modell sein. Die Ergebnisse von In-vitro-Bioassays (z. B. Zytotoxizitätsassays) liefern Eingangsdaten, die biologische Prozesse im PBTK-Modell repräsentieren, und tragen zur In-vitro- zu In-vivo-Extrapolation bei 21,56.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Acknowledgments
In Erinnerung an Dr. Márcio Lorencini, einen Mitautor dieser Arbeit, einen exzellenten Forscher auf dem Gebiet der Kosmetik, der sich der Förderung der kosmetischen Forschung in Brasilien verschrieben hat. Die Autoren danken dem Multi-User-Labor in der Abteilung für Physiologie (UFPR) für die Verfügbarkeit von Geräten und für die finanzielle Unterstützung der Koordination zur Verbesserung des Hochschulpersonals (CAPES, Brasilien) (Finanzcode 001) und der Grupo Boticario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester) | Invitrogen | C1345 | |
| Cell culture plate, 96 well plate | Sarstedt | 83.3924 | Surface: Standard, flat base |
| DMEM | Gibco | 12800-017 | Powder, high glucose, pyruvate |
| FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | Powder |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 41300021 | Powder |
| Neutral red | Sigma-Aldrich | N4638 | Powder, BioReagent, suitable for cell culture |
| Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
| Dulbeccos PBS (10X) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma-Aldrich | R7017 | Powder, BioReagent, suitable for cell culture |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | Powder |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Powder, bioreagent for molecular biology |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide 98% | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| ZFL cell line | BCRJ | 256 |
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