Summary
Органоиды, полученные от пациента (PDO), представляют собой трехмерную (3D) культуру, которая может имитировать опухолевую среду in vitro. При серозном раке яичников высокой степени злокачественности PDO представляют собой модель для изучения новых биомаркеров и терапевтических средств.
Abstract
Органоиды представляют собой 3D-динамические модели опухолей, которые могут быть успешно выращены из ткани опухоли яичников, асцита или плевральной жидкости пациента и помогают в открытии новых терапевтических средств и прогностических биомаркеров рака яичников. Эти модели повторяют клональную гетерогенность, микроокружение опухоли и взаимодействия между клетками и клетками и матриксом. Кроме того, было показано, что они соответствуют первичной опухоли морфологически, цитологически, иммуногистохимически и генетически. Таким образом, органоиды облегчают исследования опухолевых клеток и микроокружения опухоли и превосходят клеточные линии. Настоящий протокол описывает различные способы получения органоидов рака яичников пациента из образцов опухолей, асцита и плевральной жидкости пациента с вероятностью успеха более 97%. Образцы пациентов разделяются на клеточные суспензии путем механического и ферментативного сбраживания. Затем клетки покрываются с использованием экстракта базальной мембраны (BME) и поддерживаются оптимизированными питательными средами, содержащими добавки, специфичные для культивирования серозного рака яичников высокой степени злокачественности (HGSOC). После формирования исходных органоидов PDO могут поддерживать долгосрочную культуру, включая передачу для расширения для последующих экспериментов.
Introduction
В 2021 году примерно у 21 410 женщин в Соединенных Штатах был впервые диагностирован эпителиальный рак яичников, и 12 940 женщин умерли от этого заболевания1. Несмотря на то, что в хирургии и химиотерапии были достигнуты достаточные успехи, более 70% пациентов с прогрессирующим заболеванием развивают химиотерапевтическую резистентность и умирают в течение 5 лет после постановки диагноза 2,3. Таким образом, срочно необходимы новые стратегии лечения этого смертельного заболевания и репрезентативные, надежные модели для доклинических исследований.
Линии раковых клеток и ксенотрансплантаты, полученные от пациентов (PDX), созданные из первичных опухолей яичников, являются основными инструментами, используемыми в исследованиях рака яичников. Основным преимуществом линий раковых клеток является их быстрое распространение. Однако их постоянное культивирование приводит к фенотипическим и генотипическим изменениям, которые заставляют линии раковых клеток отклоняться от исходного образца первичной раковой опухоли. Из-за существующих различий между линией раковых клеток и первичной опухолью анализы лекарств, которые оказывают положительное влияние на клеточные линии, не имеют таких же эффектов в клинических испытаниях2. Для преодоления этих ограничений используются модели PDX. Эти модели создаются путем имплантации свежей ткани рака яичников иммунодефицитным мышам. Поскольку они являются моделями in vivo , они более точно напоминают биологические характеристики человека и, в свою очередь, более предсказывают результаты приема лекарств. Однако эти модели также имеют существенные ограничения, включая стоимость, время и ресурсы, необходимые для их создания4.
PDO предлагают альтернативную модель для доклинических исследований, которая преодолевает ограничения как линий раковых клеток, так и моделей PDX. PDO повторяют опухоль пациента и микроокружение опухоли и, таким образом, обеспечивают управляемую модель in vitro, идеально подходящую для доклинических исследований 2,3,5. Эти 3D-модели обладают возможностями самоорганизации, которые моделируют первичную опухоль, что является особенностью, которой не обладают их двумерные (2D) аналоги клеточной линии. Кроме того, было показано, что эти модели генетически и функционально представляют свои родительские опухоли и, таким образом, являются надежными моделями для изучения новых терапевтических и биологических процессов. Короче говоря, они предлагают возможности долгосрочного расширения и хранения, аналогичные клеточным линиям, но также охватывают микроокружение и межклеточные взаимодействия, присущие мышиным моделям 4,6.
Настоящий протокол описывает создание PDO из образцов опухолей, асцита и плевральной жидкости, полученных от пациентов, с вероятностью успеха более 97%. Затем культуры PDO могут быть расширены для нескольких поколений и использованы для тестирования чувствительности лекарственной терапии и прогностических биомаркеров. Этот метод представляет собой технику, которая может быть использована для персонализации лечения на основе терапевтических реакций PDO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все образцы тканей человека, собранные для исследования, были получены в соответствии с протоколом, одобренным Институциональным наблюдательным советом (IRB). Протоколы, изложенные ниже, были выполнены в стерильной среде культивирования тканей человека. Информированное письменное согласие было получено от людей. Подходящие пациенты должны были иметь диагноз или предполагаемый диагноз рака яичников, быть готовыми и способными подписать информированное согласие и быть не моложе 18 лет. Опухолевая ткань (злокачественная первичная опухоль или метастатические участки), асцит и плевральная жидкость были получены от согласившихся пациентов во время процедуры. Эти образцы были немедленно доставлены в лабораторию и обработаны для получения органоидов с использованием методов, описанных ниже.
1. Подготовка СМИ
- Полная подготовка органоидных сред
- Подготовьте кондиционированную среду R-спондин 1 / Noggin в соответствии с ранее опубликованным отчетом7.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кондиционированная среда R-спондин-1 / Noggin является более доступной альтернативой коммерчески доступным рекомбинантным белкам. Клетки HEK293T, стабильно секретирующие R-спондин-1 и Noggin посредством лентивирус-опосредованной трансдукции, были щедрым подарком от Рона Бозе, Медицинской школы Вашингтонского университета в Сент-Луисе, и Анила Рустги, Медицинского центра Ирвинга Нью-Йоркского пресвитерианского / Колумбийского университета 8,9,10. В качестве заменителя может быть использована коммерческая кондиционированная среда (см. Таблицу материалов).
- Подготовьте кондиционированную среду R-спондин 1 / Noggin в соответствии с ранее опубликованным отчетом7.
- Чтобы получить полную органоидную среду, смешайте 10% кондиционированную среду R-спондина 1/Noggin, 50 нг/мл EGF, 10 нг/мл FGF-10, 10 нг/мл FGF2, 1x B27, 10 ммоль/л никотинамида, 1,25 ммоль/л N-ацетилцистеина, 1 мкмоль/л простагландина E2, 10 мкмоль/л SB202190, 500 нмоль/л A83-01 и 10 мкМ ингибитора ROCK (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Среду можно хранить при температуре 4 °C до 3 месяцев. Эта среда была адаптирована из Hill et al.11. Концентрации и ингредиенты среды такие же, с добавлением ингибитора ROCK. - Приготовьте органоидную базовую среду, объединив 500 мл усовершенствованного состава DMEM/F12 с 1% пенициллин-стрептомицином, 1x дипептидом, L-аланил-L-глутамином и 1x HEPES (10 мМ) (см. Таблицу материалов).
2. Забор органоидов из асцита и плевральной жидкости
ПРИМЕЧАНИЕ: Асцит и плевральная жидкость должны быть обработаны как можно скорее для получения наилучшего выхода органоидов. Разморозьте ранее аликвотированный реакционный буфер BME, DNase I и DNase I (см. Таблицу материалов), поместив его на лед до тех пор, пока содержимое не станет жидким.
- Получите асцит и плевральную жидкость от согласившихся пациентов во время стандартных операций или процедур и транспортируйте при комнатной температуре в дорожном контейнере в лабораторию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все обработки асцита или плевральной жидкости следует проводить в стерильной среде. - Перенесите 50 мл асцита или плевральной жидкости в конические трубки объемом 50 мл (количество пробирок зависит от объема полученного асцита). Центрифуга при 1 650 x g в течение 5 мин при 4 °C. После центрифугирования используйте стеклянную пипетку Пастера, чтобы тщательно аспирировать надосадочную жидкость.
- Продолжайте, добавляя 50 мл асцита или плевральной жидкости к ранее центрифугированной грануле и снова центрифугируйте при 1,650 x g в течение 5 мин при 4 ° C. Тщательно аспирируйте надосадочную жидкость с помощью стеклянной пастеровской пипетки. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока весь асцит или плевральная жидкость не будут обработаны.
- Приготовьте раствор ДНКазы I в концентрации 100 мкг/мл, объединив 1000 мкл воды, не содержащей нуклеазы, 100 мкл реакционного буфера ДНКазы I и 10 мкл ДНКазы I.
ПРИМЕЧАНИЕ: Применяемая обработка ДНКазой I достаточна для получения одноклеточной суспензии независимо от присутствия клеточных агрегатов в некоторых образцах пациентов12. - Ресуспендируют каждую клеточную гранулу в 1 мл раствора ДНКазы I 100 мкг/мл. Аккуратно добавьте раствор ДНКазы I по каплям и дайте пробирке инкубироваться в течение 15 минут при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте минимум 1 мл раствора ДНКазы I. Если 1 мл недостаточно, чтобы нарушить гранулы, добавьте еще 1 мл. - После инкубации добавьте 25 мл органоидной основной среды (этап 1.3) в клетки и осторожно переверните для перемешивания. Затем центрифугу при 1,650 x g в течение 5 мин при 4 °C. После центрифугирования тщательно аспирируйте надосадочную жидкость с помощью стеклянной пипетки Пастера.
- Ресуспендируют вновь образованные клеточные гранулы в предварительно нагретых 5 мл 1x буфера лизиса эритроцитов (эритроцитов) (см. Таблицу материалов). Установите вихрь на 458 x g и встряхните растворы в каждой конической трубке. Как только растворы станут однородными, используйте серологическую пипетку, чтобы объединить содержимое всех конических пробирок в одну коническую пробирку объемом 50 мл.
- Инкубируйте коническую трубку, содержащую вихревый раствор, при комнатной температуре в течение 5 мин. После завершения инкубации центрифугу при 1 650 x g в течение 5 мин при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Осмотрите гранулы. Розово-красная гранула указывает на присутствие эритроцитов, что потребовало бы повторения этапа буфера лизиса эритроцитов до тех пор, пока гранула не перестанет быть красной. - После центрифугирования тщательно аспирируйте надосадочную жидкость с помощью стеклянной пипетки Пастера. Затем промыть гранулы 10 мл PBS, взболтать раствор при 458 x g и центрифуге при 1,650 x g в течение 5 мин при 4 ° C.
- Если образуется гранула с большими клетками, аспирируйте PBS с помощью стеклянной пипетки Пастера и добавьте 1 мл органоидной основной среды (этап 1.3) поверх гранулы. Встряхните раствор при 458 x g и перенесите 300-400 мкл в микроцентрифужную пробирку. Центрифугируйте микроцентрифужную пробирку при 1 650 x g в течение 5 мин при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Часть клеточной гранулы, не помещенная в микроцентрифужную пробирку, может быть заморожена для будущего использования (500 мкл клеток на 1 мл 10% ДМСО в FBS). Гранулы замороженных ячеек можно хранить в течение нескольких недель при температуре -80 °C и в течение многих лет, если поместить их в жидкий азот13. - Осторожно аспирируйте органоидную базовую среду (шаг 1.3) с помощью стеклянной пастеровской пипетки и ресуспендируйте в BME (см. Таблицу материалов) с помощью холодных наконечников.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество BME зависит от размера гранулы. Рекомендуется использовать 25% органоидную базовую среду (этап 1.3) с ресуспендированными клетками до 75% BME. - Пластина 40 мкл аликвот ресуспендированного клеточного раствора на 6-луночную пластину. Пластина до пяти аликвот на лунку (рис. 1).
- Немедленно поместите планшет в инкубатор с температурой 37 °C на 20 минут, чтобы дать BME затвердеть. После инкубации осторожно добавьте 2 мл полной органоидной среды (шаг 1.2) в каждую лунку.
Рисунок 1: Покрытие органоидов рака яичников пациента. Репрезентативное изображение органоидной обшивки. Аликвоты органоидной смеси тщательно покрывают, чтобы не образовывались пузырьки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
3. Забор органоидов из ткани
ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань должна быть обработана как можно скорее для наилучшего выхода органоидов.
- Соберите и транспортируйте опухоль на льду в дорожном контейнере, содержащем PBS.
- Поместите образец на 10-сантиметровую чашку для культивирования тканей (рис. 2). С помощью одноразового скальпеля пропустите салфетку через мясорубку. Далее, используя тупой конец одноразового шприца, раздавите ткань до создания однородной смеси.
- С помощью щипцов поместите однородную тканевую смесь в диссоциационную трубку. На каждые 1-2 мл гомогенизированной ткани добавляют 7-8 мл 1 мг/мл раствора коллагеназы II типа (см. Таблицу материалов) в среде органоидной основы (этап 1.3) и 1 мл раствора ДНКазы I. Вихревая раствор при 458 х г.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ткани будет определять количество раствора коллагеназы и количество необходимых трубок. - Используйте диссоциационную машину (см. Таблицу материалов) для разжижения ткани, пока она находится в растворе коллагеназы. Запустите программу 37C_h_TDK3 (1 ч) до тех пор, пока она не станет одноклеточной суспензией.
ПРИМЕЧАНИЕ: Программу необходимо будет перезапустить, если полученная смесь не является однородной (т.е. если кусочки ткани все еще присутствуют в смеси). Если ткань переваривается, но раствор вязкий, разбавляют органоидной основной средой (этап 1.3). - Перенесите гомогенизированную смесь в новую коническую пробирку объемом 50 мл и добавьте 20-40 мл органоидной основной среды (этап 1.3). Затем отфильтруйте раствор через сетчатое фильтр для клеток размером 100 мкм в недавно меченую коническую пробирку объемом 50 мл.
- Центрифугируйте отфильтрованную смесь при 1 650 x g в течение 5 мин при 4 °C. Затем осторожно аспирируйте надосадочную жидкость с помощью стеклянной пастеровской пипетки.
- Приготовьте раствор ДНКазы I в концентрации 100 мкг/мл, объединив 1000 мкл воды, не содержащей нуклеазы, 100 мкл реакционного буфера ДНКазы I и 10 мкл ДНКазы I.
ПРИМЕЧАНИЕ: Применяемая обработка ДНКазой I достаточна для получения одноклеточной суспензии независимо от присутствия клеточных агрегатов в некоторых образцах пациентов12. - Ресуспендируют клетки в 1 мл 100 мкг / мл раствора ДНКазы I. Аккуратно добавьте раствор ДНКазы I по каплям и дайте пробирке инкубироваться в течение 15 минут при комнатной температуре.
- После инкубации добавьте 25 мл органоидной основной среды (этап 1.3) в клетки и осторожно переверните для перемешивания. Затем центрифугу при 1,650 x g в течение 5 мин при 4 °C. После центрифугирования тщательно аспирируйте надосадочную жидкость с помощью стеклянной пипетки Пастера.
- Ресуспендировать вновь образованную клеточную гранулу в 5 мл предварительно подогретого 1x буфера для лизиса эритроцитов. Вихрите растворы в каждой конической трубке при 458 x g.
- Инкубируйте коническую трубку, содержащую клеточную гранулу, ресуспендированную в буфере лизиса эритроцитов в течение 5 мин. После завершения инкубации центрифугу при 1 650 x g в течение 5 мин при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Осмотрите гранулы. Розово-красная гранула указывает на присутствие эритроцитов, что потребовало бы повторения буферной стадии лизиса эритроцитов до тех пор, пока гранула не станет белой. - После центрифугирования тщательно аспирируйте надосадочную жидкость с помощью стеклянной пипетки Пастера. Затем промыть гранулы 10 мл PBS, взболтать раствор при 458 x g и центрифуге при 1,650 x g в течение 5 мин при 4 ° C.
- Если образуется гранула с большими клетками, аспирируйте PBS с помощью стеклянной пипетки Пастера и добавьте 1 мл органоидной основной среды (этап 1.3) поверх гранулы. Встряхните раствор при 458 x g и перенесите 300-400 мкл в микроцентрифужную пробирку. Центрифуга при 1 650 x g в течение 5 мин при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Часть клеточной гранулы, не помещенная в микроцентрифужную пробирку, может быть заморожена для будущего использования (500 мкл клеток на 1 мл 10% ДМСО в FBS) (этап 5.1). Гранулы замороженных ячеек можно хранить в течение нескольких недель при температуре -80 °C и в течение многих лет, если поместить их в жидкий азот13. - Осторожно аспирируйте органоидную базовую среду с помощью стеклянной пипетки Пастера и ресуспендируйте в BME с помощью холодных наконечников.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество BME зависит от размера гранулы. Рекомендуется добавление 25% органоидной базовой среды (этап 1.3) с ресуспендированными клетками к 75% BME. - Поместите ресуспендированный клеточный раствор на 6-луночную пластину в аликвотах 40 мкл. Пластина до пяти аликвот на лунку.
- Сразу же поместите луночную пластину в инкубатор на 20 мин. После инкубации осторожно добавьте 2 мл полной органоидной среды (шаг 1.2) в каждую лунку.
Рисунок 2: Опухолевая ткань до рассечения. Репрезентативное изображение опухолевой ткани, полученное для генерации органоидов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
4. Пассаж органоидов
ПРИМЕЧАНИЕ: Если образец сливается, каждую органоидную скважину можно еженедельно пропускать в две новые скважины.
- Используя пипетку объемом 1 мл, добавьте 1 мл органоидной основной среды (этап 1.3) в каждую лунку и пипеткой поместите среду вверх и вниз непосредственно на выступы органоидов, чтобы диссоциировать ее. Соберите всю среду, содержащую ресуспендированные гранулы, в коническую пробирку объемом 15 мл.
- Центрифугу конической пробирки объемом 15 мл, содержащей смесь в дозе 1 650 x g , в течение 5 мин при 4 °C. Затем осторожно аспирируйте надосадочную жидкость с помощью стеклянной пастеровской пипетки.
- Добавьте 1 мл рекомбинантного фермента животного происхождения (см. Таблицу материалов) в клеточную гранулу, встряхните раствор при 458 x g и перенесите в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Дайте пробирке инкубироваться в течение 15 минут на водяной бане при температуре 37 °C.
- После инкубации центрифугу при дозе 1 650 x g в течение 5 мин при 4 °C. Затем осторожно аспирируйте надосадочную жидкость с помощью стеклянной пастеровской пипетки.
- Ресуспендируйте гранулу в BME.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество BME зависит от размера гранулы. Рекомендуется добавление 25% органоидных базовых сред (этап 1.3) с ресуспендированными клетками до 75% BME. - Поместите ресуспендированный клеточный раствор в 6-луночную пластину с аликвотами 40 мкл. Пластина до пяти аликвот на лунку. После того, как все аликвоты будут покрыты, немедленно поместите лунку в инкубатор на 20 минут. После инкубации осторожно добавьте 2 мл полной органоидной среды (шаг 1.2) в каждую лунку.
5. Замораживание и размораживание органоидов
- Замораживание органоидов
- Начните с шагов 4.1-4.4.
- Ресуспендируют клеточную гранулу в 0,5-1 мл восстановительной среды для замораживания клеточных культур (см. Таблицу материалов) и переносят по 1 мл в каждую криовальную систему.
- Затем поместите криовиалы в контейнер, заполненный изопропанолом, при температуре -80 °C на срок до 2 недель, прежде чем перенести их в резервуар с жидким азотом для длительного хранения13.
- Размораживание органоидов
- Извлеките образцы из резервуара с жидким азотом и разморозьте на водяной бане при температуре 37 °C.
- После размораживания переложить в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугировать при 1,650 x g в течение 5 мин при 4 ° C. После центрифугирования тщательно аспирируйте надосадочную жидкость с помощью стеклянной пипетки Пастера.
- Ресуспендируйте гранулу в BME.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество BME зависит от размера гранулы. Рекомендуется добавление 25% органоидных базовых сред (этап 1.3) с ресуспендированными клетками до 75% BME. - Поместите ресуспендированный клеточный раствор на 6-луночную пластину в аликвотах 40 мкл. Поместите до пяти аликвот на лунку.
- Сразу же поместите тарелку в инкубатор на 20 мин. После инкубации аккуратно добавьте в лунки 2 мл полной органоидной среды (шаг 1.2).
6. Встраивание и создание фиксированных формалином парафиновых предметных стекла (FFPE) для оценки органоидного состава
- После культивирования органоидов в течение не менее 10 дней, чтобы обеспечить достаточный размер, удалите всю органоидную среду из лунок и добавьте 1 мл 2% параформальдегидного фиксатора (PFA). Инкубировать при комнатной температуре 5-10 мин.
- После инкубации культивируемые аликвоты органоидов промывают 3 раза в течение 5 мин каждый раз с 1 мл PBS.
- Удалите PBS из каждой лунки и добавьте 1 мл теплого 2% агара в деионизированном H2O в каждую лунку. При добавлении агара поднимите культивируемые органоидные аликвоты с пластины с помощью шпателя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно не дать агару затвердеть до того, как он поднимет культивируемые аликвоты органоидов.- Дайте агару застыть в лунке при комнатной температуре.
- С помощью небольшого шпателя освободите затвердевший агар из лунки и храните его в кассете до 48 ч (см. Таблицу материалов) при 4 °C в 70% этаноле дообработки 14.
- Поместите образцы в парафин 15, нарежьте предметные стекла до толщины 5 мкм и окрашивайте предметные стекла окрашиванием гематоксилином и эозином (H&E, см. Таблицу материалов) по стандартному протоколу15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для получения PDO образцы механически и ферментативно расщепляли в одноклеточные суспензии. Затем клетки ресуспендировали в BME и дополняли специально сконструированными средами (рис. 3). Органоиды обычно устанавливаются в течение 10 дней, после чего они демонстрируют дискретные органоиды в культуре (рис. 4).
Рисунок 3: Схема коллекций пациентов, сформированных в органоиды. Ткани пациента, асцит или плевральная жидкость механически или ферментативно перевариваются. Затем одноклеточная суспензия помещается в BME, где культура размножается с помощью специализированных питательных сред, адаптированных к HGSOC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные изображения двух уникальных органоидов рака яичников, полученных от пациента, через 7 дней роста. Изображения органоидов были сделаны в 40 раз. Масштабная линейка светлого поля на левом изображении составляет 100 мкм, а на правом изображении - 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Из представленного протокола был получен биобанк из 23 органоидов, который культивировался более 5 месяцев с регулярным пассажированием. Клиническая характеристика опухолей происхождения представлена в таблице 1. Большинство опухолей были поздней стадией (100%), серозной карциномой высокой степени злокачественности (92,9%) и наивными в лечении (85,7%).
| N = 23 | |
| Возраст (лет) | 63,5 ± 9,7 |
| Этап FIGO ІІ ИВ Ожидаемый |
13 (56.5) 9 (39.2) 1 (4.3) |
| Гистология Серозный высокосортный Карциносаркома Низкодифференцированная серозная |
21 (92.9) 1 (7.1) 1 (4.3) |
| Мутация BRCA Да Нет |
1 (4.3) 22 (95.7) |
| Предыдущие линии химиотерапии 0 1-5 ≥5 |
20 (85.7) 0 2 (14.2) |
Таблица 1: Характеристики биобанка PDO. Таблица содержит конкретные характеристики органоидов, сформированных с использованием настоящего протокола. Эти характеристики включают возраст, стадию FIGO (Международная федерация гинекологии и акушерства), гистологию, мутационный статус BRCA (ген BReast CAncer) и предшествующие линии химиотерапии.
Органоидные культуры могут быть оценены путем встраивания в агарозу и оценки с помощью H&E (рис. 5).
Рисунок 5: Окрашивание гематоксилином и эозином ЗОП. Репрезентативное изображение окрашивания H&E органоида рака яичников, полученного из образца пациента. Изображение было получено с 40-кратным увеличением, а масштабная линейка составляет 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Рак яичников чрезвычайно смертелен из-за его поздней стадии при постановке диагноза, а также из-за общего развития резистентности к химиотерапии. Многие успехи в исследованиях рака яичников были достигнуты за счет использования линий раковых клеток и моделей PDX; Тем не менее, существует очевидная потребность в более представительной и доступной модели in vitro . Доказано, что PDO точно представляют гетерогенность опухоли, микроокружение опухоли, а также геномные и транскриптомные особенности их первичных опухолей и, таким образом, являются идеальными доклиническими моделями для различных исследовательских подходов, таких как реализация органоидных моделей в лекарственной терапии16.
Описанный здесь протокол очень эффективен и надежен, о чем свидетельствует 97% успеха. Важно подчеркнуть, что в настоящем протоколе действительно предусмотрены важнейшие шаги, которым следует уделить пристальное внимание. Во-первых, при сборе органоидов из ткани важно убедиться, что образец полностью гомогенизирован. Это может потребовать запуска программы диссоциации более одного раза, если это необходимо. Если образец не является однородным, оставшиеся кусочки ткани могут поставить под угрозу рост органоидов. Во-вторых, поскольку рабочая температура BME составляет 2-8 °C, важно выполнять все действия, связанные с этим реагентом, на льду, чтобы избежать полимеризации. Кроме того, при ресуспендировании и нанесении покрытия BME крайне важно избегать пузырьков, так как это делает гальванические аликвоты органоидов нестабильными, вызывая их смещение с пластины. Наконец, BME, используемый в этом протоколе, был получен из опухоли Энгельбрета-Холма-Роя (EHS) и, следовательно, имеет потенциал для несогласованного состава между партиями. Эти различия могут влиять на генерацию и рост органоидов. Конкретного способа преодолеть это ограничение не существует, поскольку авторы не знают об альтернативных вариантах BME17. Дальнейшие исследования необходимы для создания альтернативных материалов для BME или 3D-каркасов. Учитывая все вышеизложенные соображения, важно подчеркнуть, что эти методы должны быть адаптированы и испытаны для различных лабораторных условий и оборудования.
Несмотря на достижения, которые органоиды могут обеспечить для исследований рака яичников, существуют ограничения на реализацию органоидных моделей. Генерация и обслуживание органоидов являются длительными и дорогостоящими процессами. Количество времени, необходимое для роста органоидов, позволяет внести загрязнение. Кроме того, изменчивость роста требует постоянного контроля, чтобы гарантировать, что количество доступных сред достаточно для развития органоидов и что загрязнение отсутствует. Кроме того, клеточный состав органоидов варьируется. Иммунные клетки присутствуют изначально, но обычно не сохраняются после второго прохождения. Это может быть преодолено с помощью добавок цитокинов в средствах массовой информации, но выходит за рамки нашей текущей работы. Стромальные клетки, по-видимому, сохраняются при прохождении, но компоненты сильно зависят от исходного образца18,19. Необходима дальнейшая работа, чтобы лучше понять точные клеточные компоненты и персистенцию каждого типа клеток. Получение органоидов у пациентов, проходящих несколько линий химиотерапии, является сложной и проблематичной. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять влияние химиотерапии на генерацию и развитие органоидов. Наконец, по нашему опыту, количество органоидов, генерируемых из определенного количества ткани, асцита или плевральной жидкости, непредсказуемо. Например, одно и то же количество опухоли, асцита или плевральной жидкости, собранной у двух разных пациентов, приведет к разным количествам органоидов. Дальнейшие исследования проводятся, чтобы получить представление о лучших типах клеток для выживания и жизнеспособности органоидов.
Тем не менее, PDO предлагают уникальные возможности для доклинических исследований по сравнению с клеточными линиями и моделями PDX. Несмотря на то, что был достигнут прогресс в диагностике и лечении рака яичников, еще предстоит проделать значительную работу, и PDO являются специальным инструментом, необходимым для продвижения исследований рака яичников.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Мы благодарны за руководство Рону Бозе, доктору медицины, доктору философии, и за помощь Барбары Блахут, доктора медицины, в создании этого протокола. Мы также хотели бы поблагодарить Медицинскую школу Вашингтонского университета в Сент-Луисе, кафедру акушерства и гинекологии и отделение гинекологической онкологии, Программу стипендий декана Вашингтонского университета и Программу развития репродуктологов за поддержку этого проекта.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 30002CI | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
| 10 cm Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
| 10 mL Serological Pipet | |||
| 100 µm Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
| 2% Paraformaldehyde Fixative | Sigma-Aldrich | ||
| 37 °C water bath | NEST | 602052 | |
| 3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| 70% Ethanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
| Agar | Lamda Biotech | C121 | |
| B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Centrifuge | |||
| Cultrex Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | basement membrane extract |
| DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
| DNase I Reaction Buffer | New England Bio Labs | M0303S | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | We use the manufacturers protocol. |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | dipeptide, L-alanyl-L-glutamine |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Fisher Scientific | NC1470670 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22900700 | |
| Microcentrifuge | |||
| Mr. Frosty Freezing Container | Fisher Scientific | 07202363S | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| p1000 Pipette with Tips | |||
| p200 Pipette with Tips | |||
| Pasteur Pipettes 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
| Pipet Controller | |||
| Prostaglandin E2 | R&D Systems | 2296 | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113802 | |
| Recombinant Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648010 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | R&D Systems | 1254/1 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
| Tissue Culture Hood | |||
| Tissue Embedding Cassette | |||
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| Type II Collagenase | Life Technologies | 17101015 | |
| Vortex |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Drost, J., Clevers, H.
- Pauli, C., et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Fujii, E., Kato, A., Suzuki, M. Patient-derived xenograft (PDX) models: Characteristics and points to consider for the process of establishment. Journal of Toxicologic Pathology. 33 (3), 153-160 (2020).
- Yang, J., et al. Application of ovarian cancer organoids in precision medicine: Key challenges and current opportunities. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 701429 (2021).
- Yang, H., et al. Patient-derived organoids: A promising model for personalized cancer treatment. Gastroenterology Report. 6 (4), 243-245 (2018).
- Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).
- Madison, B. B., et al. Let-7 represses carcinogenesis and a stem cell phenotype in the intestine via regulation of Hmga2. PLoS Genetics. 11 (8), 1005408 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Murray, E., et al. HER2 and APC mutations promote altered crypt-villus morphology and marked hyperplasia in the intestinal epithelium. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (3), 1105-1120 (2021).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Passarelli, M. C., et al. Leucyl-tRNA synthetase is a tumour suppressor in breast cancer and regulates codon-dependent translation dynamics. Nature Cell Biology. 24 (3), 307-315 (2022).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).
- Stumm, M. M., et al. Validation of a postfixation tissue storage and transport medium to preserve histopathology and molecular pathology analyses (total and phosphoactivated proteins, and FISH). American Journal of Clinical Pathology. 137 (3), 429-436 (2012).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
- Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L.
- Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Scientific Reports. 10, 12581 (2020).
- Mead, B. E., et al. Screening for modulators of the cellular composition of gut epithelia via organoid models of intestinal stem cell differentiation. Nature Biomedical Engineering. 6 (4), 476-494 (2022).
