Summary
Patient-derived organoids (PDO) är en tredimensionell (3D) kultur som kan efterlikna tumörmiljön in vitro. Vid höggradig serös äggstockscancer utgör SUB en modell för att studera nya biomarkörer och terapier.
Abstract
Organoider är 3D-dynamiska tumörmodeller som kan odlas framgångsrikt från patient-härledd äggstockstumörvävnad, ascites eller pleuravätska och hjälper till vid upptäckten av nya terapier och prediktiva biomarkörer för äggstockscancer. Dessa modeller rekapitulerar klonal heterogenitet, tumörmikromiljön och cell-cell- och cell-matrisinteraktioner. Dessutom har de visat sig matcha den primära tumören morfologiskt, cytologiskt, immunhistokemiskt och genetiskt. Således underlättar organoider forskning om tumörceller och tumörmikromiljön och är överlägsna cellinjer. Det nuvarande protokollet beskriver distinkta metoder för att generera patient-härledda äggstockscancerorganoider från patienttumörer, ascites och pleuravätskeprover med en högre än 97% framgångsgrad. Patientproverna separeras i cellulära suspensioner genom både mekanisk och enzymatisk nedbrytning. Cellerna pläteras sedan med hjälp av ett basalmembranextrakt (BME) och stöds med optimerade tillväxtmedier som innehåller kosttillskott som är specifika för odling av höggradig serös äggstockscancer (HGSOC). Efter att ha bildat initiala organoider kan SUB: erna upprätthålla långsiktig kultur, inklusive passaging för expansion för efterföljande experiment.
Introduction
År 2021 diagnostiserades cirka 21 410 kvinnor i USA nyligen med epitelial äggstockscancer och 12 940 kvinnor dog av denna sjukdom1. Även om tillräckliga framsteg har gjorts inom kirurgi och kemoterapi, utvecklar över 70% av patienterna med avancerad sjukdom kemoterapeutisk resistens och dör inom 5 år efter diagnos 2,3. Därför behövs nya strategier för att behandla denna dödliga sjukdom och representativa, tillförlitliga modeller för preklinisk forskning.
Cancercellinjer och patient-derived xenografts (PDX) skapade från primära äggstockstumörer är de viktigaste instrumenten som används i äggstockscancerforskning. En stor fördel med cancercellinjer är deras snabba expansion. Men deras kontinuerliga kultur resulterar i fenotypiska och genotypiska förändringar som får cancercellinjerna att avvika från det ursprungliga primära cancertumörprovet. På grund av de befintliga skillnaderna mellan cancercellinjen och den primära tumören misslyckas läkemedelsanalyser som har positiva effekter i cellinjer att ha samma effekter i kliniska prövningar2. För att övervinna dessa begränsningar används PDX-modeller. Dessa modeller skapas genom att implantera färsk äggstockscancervävnad i immunbristfälliga möss. Eftersom de är in vivo-modeller liknar de mer exakt mänskliga biologiska egenskaper och är i sin tur mer prediktiva för läkemedelsutfall. Dessa modeller har dock också betydande begränsningar, inklusive kostnad, tid och resurser som krävs för att generera dem4.
SUBs erbjuder en alternativ modell för preklinisk forskning som övervinner begränsningarna hos både cancercellinjer och PDX-modeller. SUBs rekapitulerar en patients tumör och tumörmikromiljö och ger därmed en in vitro-dragbar modell idealisk för preklinisk forskning 2,3,5. Dessa 3D-modeller har självorganiseringsförmåga som modellerar den primära tumören, vilket är en egenskap som deras tvådimensionella (2D) cellinjemotsvarigheter inte har. Vidare har dessa modeller visat sig genetiskt och funktionellt representera sina modertumörer och är därmed tillförlitliga modeller för att studera nya terapier och biologiska processer. Kort sagt, de erbjuder långsiktig expansion och lagringskapacitet som liknar cellinjer men omfattar också mikromiljön och cell-cellinteraktioner som är inneboende i musmodeller 4,6.
Det nuvarande protokollet beskriver skapandet av SUB från patient-härledda tumörer, ascites och pleuravätskeprover med en högre än 97% framgångsgrad. SUB-kulturerna kan sedan utvidgas i flera generationer och användas för att testa läkemedelsterapikänslighet och prediktiva biomarkörer. Denna metod representerar en teknik som kan användas för att anpassa behandlingar baserat på de terapeutiska svaren hos SUB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla mänskliga vävnadsprover som samlats in för forskning erhölls enligt det protokoll som godkänts av Institutional Review Board (IRB). Protokollen som beskrivs nedan utfördes i en steril human vävnadsodlingsmiljö. Informerat skriftligt samtycke erhölls från människor. Berättigade patienter måste ha en diagnos eller förmodad diagnos av äggstockscancer, vara villiga och kunna underteckna informerat samtycke och vara minst 18 år. Tumörvävnad (malign primärtumör eller metastatiska platser), ascites och pleuravätska erhölls från samtyckande patienter vid tidpunkten för deras procedur. Dessa prover transporterades omedelbart till laboratoriet och bearbetades för organoidgenerering med hjälp av de metoder som beskrivs nedan.
1. Förberedelse av media
- Komplett förberedelse av organoidmedia
- Förbered R-spondin 1 / Noggin konditionerat medium enligt en tidigare publicerad rapport7.
OBS: R-spondin-1 / Noggin konditionerat medium är ett billigare alternativ till kommersiellt tillgängliga rekombinanta proteiner. HEK293T-celler som stabilt utsöndrar R-spondin-1 och Noggin via lentivirusmedierad transduktion var en generös gåva från Ron Bose, Washington University School of Medicine i St. Louis och Anil Rustgi, New York-Presbyterian / Columbia University Irving Medical Center 8,9,10. Kommersiellt konditionerat medium kan användas som ersättning (se materialförteckning).
- Förbered R-spondin 1 / Noggin konditionerat medium enligt en tidigare publicerad rapport7.
- För att göra det kompletta organoidmediet, kombinera 10% R-spondin 1 / Noggin konditionerat medium, 50 ng / ml EGF, 10 ng / ml FGF-10, 10 ng / ml FGF2, 1x B27, 10 mmol / L nikotinamid, 1,25 mmol / L N-acetylcystein, 1 μmol / L prostaglandin E2, 10 μmol / L SB202190, 500 nmol / L A83-01 och 10 μM ROCK-hämmare (se materialtabell).
Mediet kan förvaras vid 4 °C i upp till 3 månader. Detta medium anpassades från Hill et al.11. Koncentrationerna och ingredienserna i mediet är desamma, med tillsats av en ROCK-hämmare. - Bered organoidbasmedium genom att kombinera 500 ml av en avancerad formulering av DMEM / F12 med 1% penicillin-streptomycin, 1x dipeptid, L-alanyl-L-glutamin och 1x HEPES (10 mM) (se materialtabell).
2. Skörda organoider från ascites och pleuralvätska
OBS: Ascites och pleuralvätska måste bearbetas så snart som möjligt för bästa utbyte av organoider. Tina tidigare alikvoterad BME-, DNase- och DNas I-reaktionsbuffert (se materialförteckning) genom att lägga den på is tills innehållet är flytande.
- Skaffa ascites och pleuravätska från samtyckande patienter vid tidpunkten för standardvårdsoperationer eller procedurer och transportera vid rumstemperatur i en resebehållare till laboratoriet.
OBS: All ascites eller pleural vätskebehandling bör utföras i en steril miljö. - Överför 50 ml ascites eller pleuralvätska till 50 ml koniska rör (antalet rör beror på volymen av erhållna ascites). Centrifugera vid 1,650 x g i 5 min vid 4 °C. Efter centrifugering, använd en Pasteur-pipett av glas för att försiktigt aspirera supernatanten.
- Fortsätt genom att tillsätta 50 ml ascites eller pleuravätska till den tidigare centrifugerade pelleten och centrifugera igen vid 1,650 x g i 5 min vid 4 °C. Aspirera försiktigt supernatanten med en Pasteur-pipett av glas. Upprepa detta steg tills alla ascites eller pleuralvätska har bearbetats.
- Bered en 100 μg/ml DNas I-lösning genom att kombinera 1 000 μl nukleasfritt vatten, 100 μl DNas I-reaktionsbuffert och 10 μl DNas I.
OBS: Den DNas I-behandling som används är tillräcklig för att göra en encellssuspension oavsett närvaron av cellaggregat i vissa patientprover12. - Resuspendera varje cellpellet i 1 ml 100 μg/ml DNas I-lösning. Tillsätt försiktigt DNase I-lösningen droppvis och låt röret inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur.
Lägg till minst 1 ml DNase I-lösning. Om 1 ml inte räcker för att störa pelleten, tillsätt ytterligare 1 ml. - Efter inkubation, tillsätt 25 ml organoidbasmedium (steg 1.3) till cellerna och vänd försiktigt för att blanda. Centrifugera sedan vid 1,650 x g i 5 min vid 4 °C. Efter centrifugering, sug försiktigt supernatanten med en glaspasteurpipett.
- Resuspendera de nybildade cellpellets i förvärmd 5 ml 1x lysbuffert för röda blodkroppar (RBC) (se materialtabell). Ställ virveln på 458 x g och virvla lösningarna i varje koniskt rör. När lösningarna är homogena, använd en serologisk pipett för att kombinera innehållet i alla koniska rör till ett enda 50 ml koniskt rör.
- Inkubera det koniska röret som innehåller den virvlade lösningen vid rumstemperatur i 5 minuter. När inkubationen är klar centrifugeras den vid 1,650 x g i 5 minuter vid 4 °C.
OBS: Undersök pelleten. En rosa/röd pellet indikerar förekomsten av röda blodkroppar, vilket skulle kräva att buffertsteget för RBC-lysering upprepas tills pelleten inte längre är röd. - Efter centrifugering, sug försiktigt supernatanten med en glaspasteurpipett. Tvätta sedan pelleten med 10 ml PBS, virvla lösningen vid 458 x g och centrifugera vid 1 650 x g i 5 minuter vid 4 °C.
- Om en storcellpellet bildas, aspirera PBS med en glaspasteurpipett och tillsätt 1 ml organoidbasmedium (steg 1.3) ovanpå pelleten. Virvla lösningen vid 458 x g och överför 300-400 μL till ett mikrocentrifugrör. Centrifugera mikrocentrifugröret vid 1,650 x g i 5 min vid 4 °C.
OBS: Den del av cellpelleten som inte placeras i mikrocentrifugröret kan frysas ner för framtida användning (500 μL celler till 1 ml 10% DMSO i FBS). Den frysta cellpelleten kan lagras i veckor vid -80 ° C och i flera år om den placeras i flytande kväve13. - Aspirera försiktigt organoidbasmediet (steg 1.3) med en Pasteur-pipett av glas och återsuspendera i BME (se Materialförteckning) med kalla spetsar.
OBS: Mängden BME baseras på pelletens storlek. Det rekommenderas att använda 25% organoidbasmedium (steg 1.3) med resuspenderade celler till 75% BME. - Platta 40 μL alikvoter av den återsuspenderade celllösningen på en 6-brunnsplatta. Platta upp till fem alikvoter per brunn (figur 1).
- Placera omedelbart plattan i en 37 °C inkubator i 20 minuter så att BME stelnar. Efter inkubation, tillsätt försiktigt 2 ml komplett organoidmedium (steg 1.2) i varje brunn.
Figur 1: Plätering av patient-härledda organoider för äggstockscancer. Representativ bild av organoidpläteringen. Alikvoter av organoidblandningen pläteras noggrant, vilket säkerställer att inga bubblor bildas. Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Skörda organoider från vävnad
OBS: Vävnad måste bearbetas så snart som möjligt för bästa utbyte av organoider.
- Samla och transportera tumören på is i en resebehållare som innehåller PBS.
- Placera provet på en 10 cm vävnadsodlingsskål (figur 2). Hacka vävnaden med en engångsskalpell. Använd sedan den tråkiga änden av en engångsspruta, krossa vävnaden tills en homogen blandning har skapats.
- Använd pincett och placera den homogena vävnadsblandningen i ett dissociationsrör. För varje 1-2 ml homogeniserad vävnad, tillsätt 7-8 ml 1 mg / ml typ II kollagenaslösning (se materialtabell) i organoidbasmedium (steg 1.3) och 1 ml DNas I-lösning. Virvla lösningen vid 458 x g.
OBS: Mängden vävnad bestämmer mängden kollagenaslösning och antalet rör som behövs. - Använd dissociationsmaskinen (se materialförteckning) för att kondensera vävnaden medan den är i kollagenaslösningen. Kör programmet 37C_h_TDK3 (1 h) tills det är en encellssuspension.
OBS: Programmet måste köras om den resulterande blandningen inte är homogen (dvs. om vävnadsbitar fortfarande finns i blandningen). Om vävnaden spjälkas men lösningen är viskös, späd med organoidbasmedium (steg 1.3). - Överför den homogeniserade blandningen till ett nytt 50 ml koniskt rör och tillsätt 20-40 ml organoidbasmedium (steg 1.3). Filtrera sedan lösningen genom en 100 μm cellsil i ett nyligen märkt 50 ml koniskt rör.
- Centrifugera den filtrerade blandningen vid 1,650 x g i 5 min vid 4 °C. Aspirera sedan försiktigt supernatanten med en glaspasteurpipett.
- Bered en 100 μg/ml DNas I-lösning genom att kombinera 1 000 μl nukleasfritt vatten, 100 μl DNas I-reaktionsbuffert och 10 μl DNas I.
OBS: Den DNas I-behandling som används är tillräcklig för att göra en encellssuspension oavsett närvaron av cellaggregat i vissa patientprover12. - Resuspendera cellerna i 1 ml 100 ug/ml DNas I-lösning. Tillsätt försiktigt DNase I-lösningen droppvis och låt röret inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur.
- Efter inkubation, tillsätt 25 ml organoidbasmedium (steg 1.3) till cellerna och vänd försiktigt för att blanda. Centrifugera sedan vid 1,650 x g i 5 min vid 4 °C. Efter centrifugering, sug försiktigt supernatanten med en glaspasteurpipett.
- Resuspendera den nybildade cellpelleten i 5 ml förvärmd 1x RBC-lysbuffert. Virvla lösningarna i varje koniskt rör vid 458 x g.
- Inkubera det koniska röret som innehåller cellpelleten återsuspenderad i RBC-lysbufferten i 5 minuter. När inkubationen är klar centrifugeras vid 1,650 x g i 5 min vid 4 °C.
OBS: Undersök pelleten. En rosa/röd pellet indikerar närvaron av röda blodkroppar, vilket skulle kräva att buffertsteget för RBC-lysering upprepas tills pelleten verkar vit. - Efter centrifugering, sug försiktigt supernatanten med en glaspasteurpipett. Tvätta sedan pelleten med 10 ml PBS, virvla lösningen vid 458 x g och centrifugera vid 1 650 x g i 5 minuter vid 4 °C.
- Om en storcellpellet bildas, aspirera PBS med en glaspasteurpipett och tillsätt 1 ml organoidbasmedium (steg 1.3) ovanpå pelleten. Virvla lösningen vid 458 x g och överför 300-400 μL till ett mikrocentrifugrör. Centrifugera vid 1,650 x g i 5 min vid 4 °C.
OBS: Den del av cellpelleten som inte placeras i mikrocentrifugröret kan frysas ner för framtida användning (500 μL celler till 1 ml 10% DMSO i FBS) (steg 5.1). Den frysta cellpelleten kan lagras i veckor vid -80 ° C och i flera år om den placeras i flytande kväve13. - Aspirera försiktigt organoidbasmediet med en Pasteur-pipett av glas och återsuspendera i BME med kalla spetsar.
OBS: Mängden BME baseras på pelletens storlek. Tillsats av 25% organoidbasmedium (steg 1.3) med återsuspenderade celler till 75% BME rekommenderas. - Platta den återsuspenderade celllösningen på en platta med 6 brunnar i 40 μl alikvoter. Platta upp till fem alikvoter per brunn.
- Placera omedelbart brunnplattan i inkubatorn i 20 minuter. Efter inkubation, tillsätt försiktigt 2 ml komplett organoidmedium (steg 1.2) i varje brunn.
Figur 2: Tumörvävnad före dissektion. Representativ bild av tumörvävnad erhållen för organoidgenerering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
4. Passaging av organoider
OBS: Om provet är sammanflytande kan varje organoidbrunn passera varje vecka till två nya brunnar.
- Använd en 1 ml pipett, tillsätt 1 ml organoidbasmedium (steg 1.3) till varje brunn och pipettera mediet upp och ner direkt på organoidflikarna för att dissociera det. Samla upp allt medium som innehåller de återsuspenderade pelletsen i ett 15 ml koniskt rör.
- Centrifugera det 15 ml E-rör som innehåller blandningen vid 1,650 x g i 5 min vid 4 °C. Aspirera sedan försiktigt supernatanten med en glaspasteurpipett.
- Tillsätt 1 ml animaliskt ursprungfritt, rekombinant enzym (se materialförteckning) till cellpelleten, virvla lösningen vid 458 x g och överför till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Låt tuben inkubera i 15 minuter i ett 37 °C vattenbad.
- Efter inkubation centrifugeras vid 1,650 x g i 5 min vid 4 °C. Aspirera sedan försiktigt supernatanten med en glaspasteurpipett.
- Återsuspendera pelleten i BME.
OBS: Mängden BME baseras på pelletens storlek. Tillsats av 25% organoidbasmedia (steg 1.3) med återsuspenderade celler till 75% BME rekommenderas. - Platta den återsuspenderade celllösningen till en platta med 6 brunnar i 40 μl del. Platta upp till fem alikvoter per brunn. När alla alikvoter har pläterats, placera omedelbart brunnsplattan i inkubatorn i 20 minuter. Efter inkubation, tillsätt försiktigt 2 ml komplett organoidmedium (steg 1.2) i varje brunn.
5. Frysning och upptining av organoider
- Frysning av organoider
- Börja med steg 4.1-4.4.
- Resuspendera cellpelleten i 0,5-1 ml frysmedium för återvinningscellkultur (se materialtabell) och överför 1 ml till varje kryovial.
- Placera sedan kryovialerna i en isopropanolfylld behållare vid -80 ° C i upp till 2 veckor innan du överför dem till en flytande kvävetank för långvarig lagring13.
- Upptining av organoider
- Ta bort proverna från tanken med flytande kväve och tina vid 37 °C vattenbad.
- Efter upptining, överför till ett 15 ml koniskt rör och centrifugera vid 1 650 x g i 5 minuter vid 4 °C. Efter centrifugering, sug försiktigt supernatanten med en glaspasteurpipett.
- Återsuspendera pelleten i BME.
OBS: Mängden BME baseras på pelletens storlek. Tillsats av 25% organoidbasmedia (steg 1.3) med återsuspenderade celler till 75% BME rekommenderas. - Platta den återsuspenderade celllösningen på en platta med 6 brunnar i 40 μl alikvoter. Placera upp till fem alikvoter per brunn.
- Placera omedelbart plattan i inkubatorn i 20 minuter. Efter inkubation tillsätt försiktigt 2 ml komplett organoidmedium (steg 1.2) till brunnarna.
6. Inbäddning och generering av formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) glas för att utvärdera organoidkompositionen
- Efter odling av organoider i minst 10 dagar för att säkerställa tillräcklig storlek, avlägsna hela organoidmediet från brunnarna och tillsätt 1 ml 2% paraformaldehydfixeringsmedel (PFA). Inkubera vid rumstemperatur i 5-10 min.
- Efter inkubation, tvätta de odlade organoidalikvoterna 3x i 5 minuter varje gång med 1 ml PBS.
- Ta bort PBS från varje brunn och tillsätt 1 ml varm 2% agar i avjoniseradH2Otill varje brunn. När du tillsätter agar, lyft de odlade organoidalikvoterna från plattan med en spatel.
OBS: Det är viktigt att inte låta agarn stelna innan de odlade organoidalikvoterna lyfts.- Låt agarn stelna i brunnen vid rumstemperatur.
- Frigör den stelnade agaren från brunnen med en liten spatel och förvara den i en kassett i upp till 48 timmar (se materialförteckning) vid 4 °C i 70 % etanol tills bearbetning14.
- Bädda in proverna i paraffin 15, skär glasen till en tjocklek av 5 μm och färga objektglasen med hematoxylin och eosin (H&E, se materialförteckning) färgning med ett standardprotokoll15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att generera SUB röts proverna mekaniskt och enzymatiskt till encellssuspensioner. Cellerna återsuspenderades sedan i BME och kompletterades med specifikt konstruerade medier (figur 3). Organoider etableras typiskt under en tidsram på 10 dagar, varefter de visar diskreta organoider i kultur (figur 4).
Figur 3: Schematisk bild av patientsamlingar formade till organoider. Patientvävnad, ascites eller pleuravätska smälts mekaniskt eller enzymatiskt. Den encellssuspenderade pläteras sedan till BME, där kulturen sprider sig med hjälp av specialiserade tillväxtmedier skräddarsydda för HGSOC. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativa bilder av två unika patient-härledda äggstockscancerorganoider efter 7 dagars tillväxt. Organoidbilderna togs vid 40x. Skalan för ljusfält på den vänstra bilden är 100 μm och på den högra bilden är 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Från det presenterade protokollet producerades och odlades en biobank med 23 organoider i över 5 månader med regelbunden passaging. De kliniska egenskaperna hos ursprungstumörerna presenteras i tabell 1. Majoriteten av tumörerna var avancerade (100%), högkvalitativt seröst karcinom (92,9%) och behandlingsnaiva (85,7%).
| N = 23 | |
| Ålder (år) | 63,5 ± 9,7 |
| FIGO-scenen III DROPP Avvaktan |
13 (56.5) 9 (39.2) 1 (4.3) |
| Histologi Högkvalitativ serös Karcinosarkom Lågkvalitativ serös |
21 (92.9) 1 (7.1) 1 (4.3) |
| BRCA-mutation Ja Nej |
1 (4.3) 22 (95.7) |
| Tidigare linjer av kemoterapi 0 1-5 ≥5 |
20 (85.7) 0 2 (14.2) |
Tabell 1: SUB-biobankens egenskaper. Tabellen innehåller de specifika egenskaperna hos de organoider som genereras med hjälp av detta protokoll. Dessa egenskaper inkluderar ålder, FIGO (International Federation of Gynecology and Obstetrics) stadium, histologi, BRCA (BReast CAncer gen) mutationsstatus och tidigare linjer av kemoterapi.
Organoidkulturer kan utvärderas genom inbäddning i agaros och utvärdering med H&E (figur 5).
Figur 5: Hematoxylin och eosinfärgning av SUB. Representativ bild av H&E-färgning av en organoid för äggstockscancer genererad från ett patientprov. Bilden togs vid 40x och skalstapeln är 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Äggstockscancer är extremt dödlig på grund av dess avancerade stadium vid diagnos, liksom den vanliga utvecklingen av kemoterapiresistens. Många framsteg inom äggstockscancerforskning har gjorts genom att använda cancercellinjer och PDX-modeller; Det finns dock ett uppenbart behov av en mer representativ och överkomlig in vitro-modell . SUBs har visat sig exakt representera tumörheterogeniteten, tumörmikromiljön och de genomiska och transkriptomiska egenskaperna hos deras primära tumörer och är därför idealiska prekliniska modeller för olika forskningsmetoder, såsom implementering av organoidmodeller i läkemedelsbehandling16.
Protokollet som beskrivs här är mycket effektivt och pålitligt, vilket indikeras av 97% framgångsgrad. Det är viktigt att betona att det nuvarande protokollet innehåller kritiska steg som bör ägnas stor uppmärksamhet. För det första, vid skörd av organoider från vävnad, är det viktigt att se till att provet är helt homogeniserat. Detta kan kräva att dissociationsprogrammet körs mer än en gång om det behövs. Om provet inte är homogent kan de återstående vävnadsbitarna äventyra organoidtillväxten. För det andra, eftersom BME: s arbetstemperatur är 2-8 ° C, är det viktigt att utföra alla steg som involverar detta reagens på is för att undvika polymerisation. Vid resuspendering och plätering med BME är det dessutom viktigt att undvika bubblor, eftersom detta gör de pläterade organoidalikvoterna instabila, vilket får dem att lossna från plattan. Slutligen genererades BME som används i detta protokoll från Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) tumören och har därför potential för inkonsekvent sammansättning mellan satser. Dessa skillnader kan påverka organoidgenerering och tillväxt. Det finns inget specifikt sätt att övervinna denna begränsning eftersom författarna inte känner till alternativa BME-alternativ17. Framtida forskning är nödvändig för att etablera alternativa material för BME eller 3D-ställningar. Med tanke på alla ovanstående överväganden är det viktigt att betona att dessa metoder bör anpassas och testas för olika laboratorieinställningar och utrustning.
Trots de framsteg som organoider kan ge till äggstockscancerforskning finns det begränsningar för implementeringen av organoidmodeller. Organoidgenerering och underhåll är både långa och dyra processer. Den tid som krävs för organoidtillväxt möjliggör införande av förorening. Vidare kräver tillväxtvariabilitet konstant övervakning för att säkerställa att mängden tillgängligt media är tillräcklig för organoidutveckling och att kontaminering inte är närvarande. Dessutom är organoidernas cellulära sammansättning variabel. Immunceller är närvarande initialt men kvarstår vanligtvis inte förbi den andra passagen. Detta kan övervinnas med cytokintillskott i media men ligger utanför ramen för vårt nuvarande arbete. Stromaceller verkar kvarstå genom passaging, men komponenterna är starkt beroende av det ursprungliga provet18,19. Ytterligare arbete är nödvändigt för att bättre förstå varje celltyps exakta cellulära komponenter och uthållighet. Att generera organoider från patienter som genomgår flera kemoterapilinjer är utmanande och problematiskt. Ytterligare studier är nödvändiga för att förstå effekterna av kemoterapi på organoidgenerering och utveckling. Slutligen, enligt vår erfarenhet, är antalet organoider genererade från en viss mängd vävnad, ascites eller pleuralvätska oförutsägbar. Till exempel kommer samma mängd tumör, ascites eller pleuravätska som samlas in från två olika patienter att resultera i olika mängder organoider. Ytterligare forskning utförs för att få insikt i de bästa celltyperna för organoidöverlevnad och livskraft.
Icke desto mindre erbjuder PDOs unika möjligheter för preklinisk forskning jämfört med cellinjer och PDX-modeller. Även om framsteg har gjorts när det gäller diagnos och behandling av äggstockscancer finns det fortfarande mycket arbete att göra, och SUB är ett särskilt verktyg som behövs för att främja forskningen om äggstockscancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för vägledningen från Ron Bose, MD, PhD, och hjälpen från Barbara Blachut, MD, vid upprättandet av detta protokoll. Vi vill också erkänna Washington University's School of Medicine i St. Louis's Department of Obstetrics and Gynecology och Division of Gynecologic Oncology, Washington University's Dean's Scholar Program och Reproductive Scientist Development Program för deras stöd till detta projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 30002CI | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
| 10 cm Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
| 10 mL Serological Pipet | |||
| 100 µm Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
| 2% Paraformaldehyde Fixative | Sigma-Aldrich | ||
| 37 °C water bath | NEST | 602052 | |
| 3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| 70% Ethanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
| Agar | Lamda Biotech | C121 | |
| B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Centrifuge | |||
| Cultrex Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | basement membrane extract |
| DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
| DNase I Reaction Buffer | New England Bio Labs | M0303S | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | We use the manufacturers protocol. |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | dipeptide, L-alanyl-L-glutamine |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Fisher Scientific | NC1470670 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22900700 | |
| Microcentrifuge | |||
| Mr. Frosty Freezing Container | Fisher Scientific | 07202363S | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| p1000 Pipette with Tips | |||
| p200 Pipette with Tips | |||
| Pasteur Pipettes 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
| Pipet Controller | |||
| Prostaglandin E2 | R&D Systems | 2296 | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113802 | |
| Recombinant Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648010 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | R&D Systems | 1254/1 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
| Tissue Culture Hood | |||
| Tissue Embedding Cassette | |||
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| Type II Collagenase | Life Technologies | 17101015 | |
| Vortex |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Drost, J., Clevers, H.
- Pauli, C., et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Fujii, E., Kato, A., Suzuki, M. Patient-derived xenograft (PDX) models: Characteristics and points to consider for the process of establishment. Journal of Toxicologic Pathology. 33 (3), 153-160 (2020).
- Yang, J., et al. Application of ovarian cancer organoids in precision medicine: Key challenges and current opportunities. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 701429 (2021).
- Yang, H., et al. Patient-derived organoids: A promising model for personalized cancer treatment. Gastroenterology Report. 6 (4), 243-245 (2018).
- Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).
- Madison, B. B., et al. Let-7 represses carcinogenesis and a stem cell phenotype in the intestine via regulation of Hmga2. PLoS Genetics. 11 (8), 1005408 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Murray, E., et al. HER2 and APC mutations promote altered crypt-villus morphology and marked hyperplasia in the intestinal epithelium. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (3), 1105-1120 (2021).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Passarelli, M. C., et al. Leucyl-tRNA synthetase is a tumour suppressor in breast cancer and regulates codon-dependent translation dynamics. Nature Cell Biology. 24 (3), 307-315 (2022).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).
- Stumm, M. M., et al. Validation of a postfixation tissue storage and transport medium to preserve histopathology and molecular pathology analyses (total and phosphoactivated proteins, and FISH). American Journal of Clinical Pathology. 137 (3), 429-436 (2012).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
- Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L.
- Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Scientific Reports. 10, 12581 (2020).
- Mead, B. E., et al. Screening for modulators of the cellular composition of gut epithelia via organoid models of intestinal stem cell differentiation. Nature Biomedical Engineering. 6 (4), 476-494 (2022).
