Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Выделение и очистка микрососудистых и макрососудистых эндотелиальных клеток из образцов, полученных из легких

Published: February 3, 2023 doi: 10.3791/64885
Automatic Translation
1,2, 2, 2,3, 2,3, 1, 4, 4,5, 1,2, 2,3, 1, 6,7, 1, 1,2
1Department of Medical, Oral and Biotechnological Sciences, “G. d’Annunzio” University of Chieti-Pescara, 2Center on Advanced Studies and Technology (CAST), “G. d’Annunzio” University of Chieti-Pescara, 3Department of Medicine and Aging Sciences, University “G. d’Annunzio” of Chieti-Pescara, 4U.O. di Chirurgia Toracica e dei Trapianti di Polmone, Fondazione IRCCS Ca’ Granda - Ospedale Maggiore Policlinico di Milano, 5Dipartimento di Fisiopatologia Medico-Chirurgica e dei Trapianti, Università degli Studi di Milano, 6Department of Pharmaceutical Sciences, Università degli Studi di Milano, 7Unit of Cell and Molecular Biology in Cardiovascular Diseases, Centro Cardiologico Monzino IRCCS

Summary

Несмотря на сложную задачу, выделение эндотелиальных клеток легких имеет важное значение для исследований воспаления легких. В настоящем протоколе описана процедура выделения макрососудистых и микрососудистых эндотелиальных клеток с высоким выходом и высокой чистотой.

Abstract

Наличие клеток, выделенных из здоровых и больных тканей и органов, представляет собой ключевой элемент для подходов персонализированной медицины. Хотя биобанки могут предоставить широкую коллекцию первичных и иммортализированных клеток для биомедицинских исследований, они не покрывают все экспериментальные потребности, особенно те, которые связаны с конкретными заболеваниями или генотипами. Эндотелиальные клетки сосудов (ЭК) являются ключевыми компонентами иммунной воспалительной реакции и, таким образом, играют центральную роль в патогенезе различных заболеваний. Примечательно, что ЭК из разных сайтов демонстрируют разные биохимические и функциональные свойства, что делает наличие определенных типов ЭК (т. е. макрососудистых, микрососудистых, артериальных и венозных) необходимым для разработки надежных экспериментов. Здесь подробно проиллюстрированы простые процедуры получения высокопродуктивных, практически чистых макрососудистых и микрососудистых эндотелиальных клеток человека из легочной артерии и паренхимы легких. Эта методология может быть легко воспроизведена с относительно низкими затратами любой лабораторией для достижения независимости от коммерческих источников и получения фенотипов/генотипов ЕС, которые еще недоступны.

Introduction

Эндотелий сосудов выстилает внутреннюю поверхность кровеносных сосудов. Он играет ключевую роль в регуляции свертываемости крови, сосудистого тонуса и иммунно-воспалительных реакций 1,2,3,4. Хотя культура эндотелиальных клеток (ЭК), выделенных из образцов человека, имеет важное значение для исследовательских целей, следует отметить, что ЭК из разных кровеносных сосудов (артерий, вен, капилляров) выполняют определенные функции. Они не могут быть полностью воспроизведены эндотелиальными клетками пупочной вены человека (HUVEC), которые легко доступны и широко используются в исследованиях патофизиологии эндотелия сосудов 5,6. Например, микрососудистые эндотелиальные клетки легких человека (HLMVEC) играют ключевую роль в воспалении легких, контролируя рекрутирование и накопление лейкоцитов 4,7. Таким образом, экспериментальная установка, направленная на воспроизведение воспаления легких с высокой точностью, должна включать HLMVEC. С другой стороны, дисфункция ЭК может наблюдаться при нескольких патологиях; таким образом, ЭК от пациента имеют основополагающее значение для построения надежной модели заболевания in vitro. Например, выделение фрагментов ЭК из легочной артерии (ГПАЭК), рассеченных из эксплантированных легких людей, страдающих муковисцидозом (МВ), позволило выявить механизмы эндотелиальной дисфункции при этом заболевании 8,9.

Таким образом, протоколы, направленные на оптимизацию выделения ЭК из различных источников/органов, в том числе в болезненных состояниях, необходимы для предоставления исследователям ценных исследовательских инструментов, особенно когда эти инструменты не являются коммерчески доступными. Ранее сообщалось о протоколах изоляции HLMVEC и HPAEC 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Во всех случаях ферментативное переваривание образцов легких приводило к смешанным клеточным популяциям, которые очищали с использованием специальных селективных сред и сортировки клеток на основе магнитных шариков или цитометрических данных. Дальнейшая оптимизация этих протоколов должна быть направлена на решение двух основных проблем при выделении ЕС: (1) загрязнение клеток и тканей, которое должно быть решено при как можно более раннем прохождении культивирования, чтобы свести к минимуму репликативное старение ЭК20; и (2) низкий выход первичных изолятов ЕС.

В этом исследовании описывается новый протокол для выделения высокопроизводительных и высокочистых HLMVEC и HPAEC. Эта процедура может быть легко применима и дает практически чистые макрососудистые и микрососудистые ЭК за несколько шагов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Это исследование было одобрено, и протокол соответствовал рекомендациям комитета по этике исследований на людях Университета Кьети-Пескара (#237_2018bis). На рисунке 1 показано выделение эндотелиальных клеток из сегментов (длиной 1-3 см) легочной паренхимы или легочной артерии у идентифицированных людей (с письменного согласия), перенесших торакальную операцию по различным причинам, таким как пневмоторакс или лобэктомия. В последнем случае хирурги также собрали сегмент легочной артерии. Примечательно, что хирурги были точно проинструктированы собирать образцы без рака. Представленный протокол был оптимизирован для получения максимально возможного выхода и чистоты.

1. Экспериментальная подготовка

  1. Восстановление коллагеназы
    1. Растворите порошок коллагеназы в фосфатно-буферном физиологическом растворе без CaCl 2 и MgCl 2 (PBS-, см. Таблицу материалов) в концентрации2 мг / мл и отфильтруйте раствор с помощью порового фильтра 0,22 мкм.
    2. Приготовьте аликвоты объемом 5 мл и храните их при температуре -20 °C. Перед использованием разморозьте и разогрейте аликвоты до 37 °C.
  2. Покрытие пластин
    1. Для покрытия пластины пипеткой вводят 1,5% раствор желатина или 50 мкг/мл фибронектина (см. Таблицу материалов) в культуральную пластину (500 мкл достаточно, чтобы покрыть поверхность каждой лунки 6-луночной пластины) и инкубируют в течение 1 ч при 37 °C.
    2. После инкубации удалите излишки желатина и промойте лунки PBS−-. Аспирируйте PBS−− и дайте пластине высохнуть в стерильном колпаке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для восстановления желатина растворите порошок в воде до получения 1,5% раствора, затем автоклавируйте его и храните при температуре 4 ° C. Желатин при 1,5% не является жидким при 4 ° C; Поэтому перед нанесением покрытия на плиту его необходимо прогреть. В качестве альтернативы, для покрытия пластины можно использовать любой коммерческий раствор желатина, подходящий для клеточных культур.

2. Пробоподготовка

  1. Паренхима легких
    1. Вымойте собранные образцы, погрузив их в пробирку объемом 50 мл, содержащую PBS-.
    2. Переложите образцы в стерильную чашку Петри и вручную измельчите образец хирургическими ножницами (оптимальный размер: >2 см) на мелкие фрагменты размером около 3-4 мм каждый.
  2. Сегмент(ы) артерии
    1. Вымойте собранные образцы, погрузив их в пробирку объемом 50 мл, содержащую PBS-.
    2. Перенесите его в стерильную чашку Петри, не измельчая, так как фрагментация увеличит площадь поверхности поперечного сечения сегмента артерии, тем самым увеличивая возможность выделения не-EC.

3. Ферментативное пищеварение

  1. Дважды промойте нарезанную кубиками паренхиму легких или сегмент (сегменты) легочной артерии с помощью PBS-. Этот шаг удалит большую часть остаточной крови.
  2. Поместите образцы в пробирки объемом 15 мл и инкубируйте с 5 мл коллагеназы типа 2 (см. Таблицу материалов) в течение 10 мин при 37 ° C и 5% CO2. Во время этой инкубации деградация внеклеточного матрикса высвобождает отдельные клетки и клеточные агрегаты.

4. Восстановление переваренных клеток

  1. Поместите стерильное ситечко из стали/металла (т. е. ситечко для чая с размером ячеек ~ 1 мм) в верхнюю часть пробирки для сбора объемом 50 мл.
  2. Вылейте все содержимое из пробирки объемом 15 мл на ситечко, аккуратно помассируйте переваренную ткань шпателем и промойте образец PBS-− до тех пор, пока пробирка для сбора не будет заполнена.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг устранит крупные фрагменты тканей в миллиметровом масштабе, обеспечивая большую эффективность последующих этапов фильтрации.

5. Удаление без EC путем фильтрации

  1. Отфильтруйте отток, собранный на шаге 4.2, с помощью клеточного сетчатого фильтра с размером ячеек 70 мкм и соберите отток в свежую пробирку объемом 50 мл.
  2. Затем используйте клеточный фильтр с размером ячеек 40 мкм и соберите отток в свежую пробирку объемом 50 мл. Пометьте эту трубку как «трубка 1».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти фильтрации на шагах 5.1 и 5.2 удаляют крупные клеточные агрегаты, которые часто состоят из смешанных клеточных популяций.

6. Седиментация клеточных кластеров и засев клеток

  1. Центрифугируют образцы при 30 x g в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы осаждать кластеры клеток.
  2. Осторожно извлеките надосадочную жидкость с помощью стерильной пипетки (не наливайте) и поместите ее в свежую пробирку объемом 50 мл («пробирка 2»).
  3. Суспендируйте гранулы в «пробирке 1» и заполните пробирку до 50 мл PBS-−. Заполните «пробирку 2» до 50 мл PBS−.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого этапа, обе трубки обрабатываются одинаково.
  4. Центрифугируют образцы при 300 x g в течение 5 мин при комнатной температуре.
  5. Суспендируйте гранулы с 2 мл питательной среды (см. Таблицу материалов) и засейте суспензию в две отдельные лунки предварительно покрытой 6-луночной пластины (шаг 1.2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого этапа, кормите клетки питательной средой каждые 2 дня до тех пор, пока они не достигнут слияния (примерно 1 неделя, в зависимости от размера выборки), чтобы получить разумное количество клеток для сортировки.

7. Расширение ячеек

  1. Промойте клетки 2 мл PBS с CaCl 2 и MgCl2 (PBS++, см. Таблицу материалов), чтобы удалить остаточные клетки крови (использование PBS++ важно для предотвращения отслоения клеток).
  2. Удалите PBS++ и добавьте свежую питательную среду.
  3. Повторяйте шаги 7.1 и 7.2 до тех пор, пока ячейки не достигнут слияния (примерно 1 неделя, в зависимости от размера выборки).

8. Сортировка ячеек

  1. Отделите клетки, используя 500 мкл трипсина-ЭДТА (0,05%, см. Таблицу материалов), центрифугу и ресуспендируйте гранулу 190 мкл PBS-.
  2. Добавьте 10 мкл флуоресцентного конъюгированного антитела CD31-FITC против человека (разведение 1:20, см. Таблицу материалов) и инкубируйте клеточную суспензию при 4 ° C в течение 30 мин.
  3. Промойте клетки, используя 10 мл PBS-, центрифугу при 300 x g в течение 5 мин при комнатной температуре и ресуспендируйте гранулу в 300 мкл PBS-.
  4. Изолируйте и собирайте CD31-положительные (CD31+) клетки с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) с помощью сопла 100 мкм и собирайте их в пробирку.
    1. В соответствии со стратегией стробирования сначала определите морфологию клеток, используя параметры площади бокового рассеяния, SSC-A и FSC-A. Затем выберите отдельные ячейки, используя точечную диаграмму FSC-Area/FSC-Height или SSC-Area/SSC-Height, определите положительные ячейки в отмеченном образце по сравнению с неокрашенным контрольным образцом и направьте флуоресцентные ячейки в сборную пробирку21.
  5. Центрифугируют клеточную суспензию при 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре и суспендируют гранулу в 2 мл питательной среды для посева в предварительно покрытые лунки 6-луночной пластины.

9. Расширение постсортировки

  1. Через два дня после сортировки клеток замените кондиционированную среду свежей питательной средой.
  2. Повторяйте шаги 7.1 и 7.2 каждые 2 дня для расширения клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Изоляция HLMEC
Основной проблемой при выделении HLMVEC является наличие загрязняющих клеток, поскольку микроскопические капилляры не могут быть легко отделены от стромальной ткани. Таким образом, достижение максимально возможной чистоты на самых ранних стадиях процесса выделения имеет решающее значение для уменьшения проходов культуры и, следовательно, старения клеток. Аналогичным образом, оптимальный протокол изоляции должен обеспечивать максимально возможный выход чистых HLMVEC. Для достижения этих целей была создана новая процедура, основанная на ранее описанных протоколах 10,11,12,14,15.

Хотя паренхима легких сильно васкуляризирована, что является отличным источником HLMVEC, она в значительной степени населена гладкомышечными клетками (SMC), коллагеновыми волокнами и фибробластами. Эти клетки, особенно SMC, могут адаптироваться к различным культуральным средам и почти во всех случаях реплицируются in vitro намного быстрее, чем другие клеточные популяции, что означает, что они захватывают смешанную клеточную культуру. Поэтому нашей первой задачей было откалибровать ферментативное переваривание паренхимы, чтобы уменьшить перенос нежелательных клеток. Поскольку коллагеназа 2 типа быстро отделяет группы эндотелиальных клеток от остальной части капилляра, мы пришли к выводу, что время переваривания образца легких может иметь решающее значение для минимизации загрязнения клеток. Поэтому в качестве первого шага время воздействия коллагеназы иссеченного фрагмента легкого было сокращено максимум до 10 мин вместо предложенных 20 мин15 (рис. 2А). После этой обработки было замечено, что часть клеточных агрегатов, включая SMC и фибробласты, все еще были связаны с длинными волокнами (рис. 2B), в то время как SMC представляли собой большинство синглетов, не относящихся к клеткам крови. Также наблюдались небольшие, компактные скопления клеток диаметром, обычно не превышающим 10-20 мкм, без элементов, относящихся к фрагментам стромальной ткани (т.е. крупным волокнам) (рис. 2B). Была выдвинута гипотеза, что эти мелкие клеточные агрегаты могут состоять в основном из HLMVEC.

Следуя этой гипотезе, были проведены последовательные этапы фильтрации, чтобы максимизировать восстановление HLMVEC. Для первой фильтрации использовали металлическое ситечко, и образец массировали пинцетом, чтобы облегчить выход HLMVEC из капилляров (рис. 2C, справа). Цель этого шага состояла в том, чтобы удалить большие скопления гладкомышечных клеток и фибробластов, все еще связанных с внеклеточным матриксом. Затем отток фильтровали с помощью последовательности сетчатых фильтров размером 70 мкм и 40 мкм для удаления остаточных крупных, хотя и не видимых глазу, агрегатов (рис. 2C, посередине, слева). Для удаления клеточных синглетов образцы центрифугировали при 30 x g в течение 5 мин, скорость, при которой клетки и агрегаты диаметром >7-10 мкм осаждались, оставляя, таким образом, меньшие клетки в суспензии. Эти параметры центрифугирования были выбраны на основе параметров, сообщенных Miron et al. для гранулирования циркулирующих клеток крови22. Примечательно, что после этого центрифугирования надосадочная жидкость имела красный цвет (рис. 2D), что указывает на наличие большого количества эритроцитов (~ 5 мкм в диаметре). В этот момент надосадочную жидкость осторожно удаляли и помещали во вторую пробирку. Обе пробирки, содержащие надосадочную жидкость и гранулу, заполняли PBS-− и центрифугировали при 300 x g в течение 5 мин. После центрифугирования в пробирке, содержащей надосадочную жидкость, была обнаружена красная гранула, обогащенная клетками крови, что позволяет предположить, что она также содержала большую часть эксплантированных клеточных синглетов (рис. 2E, справа).

Полученные гранулы суспендировали со средой для роста эндотелиальных клеток и отдельно высевали в две лунки 6-луночной пластины, которые предварительно покрывали 1,5% желатином из свиной кожи (рис. 2Е, посередине). Через 3 дня клетки промывали PBS++, кормили свежей средой и визуализировали. Как показано слева на рисунке 2E, островки ЕС были более распространены в лунке, содержащей клетки из «пробирки 1» (вверху), в то время как лунка, содержащая клетки из «пробирки 2» (внизу), была в основном заполнена одиночными и неэндотелиальными клетками.

Та же процедура была применена к менее сложному протоколу изоляции HPAEC, о котором сообщалось в нашей предыдущей работе, в которой разделение HPAEC включало использование их более короткого времени адгезии по сравнению с контаминирующими клетками8. Благодаря своему большому размеру артерии могут быть легко очищены от остаточных соединительных и жировых тканей, тем самым устраняя большую долю не-EC. Тем не менее, большая часть фибробластов и волокон внеклеточного матрикса все еще присутствовала в образцах на этой стадии, в дополнение к сосудистым SMC8. Новая процедура еще больше повысила первоначальную чистоту ЕС во время эксплантатов HPAEC (результаты не показаны).

Очистка и фенотипическая и функциональная характеристика свежевыделенных HLMVEC
В конце протокола выделения чистота HLMVEC была проанализирована путем проточного цитометрического обнаружения CD31 клеточной мембраны. Для правильной идентификации клеточного компартмента CD31+ был установлен затвор на точечном графике прямого рассеяния (FSC)/бокового рассеяния (SSC), и была идентифицирована морфологически однородная популяция клеток. Такая популяция была представлена на точечном графике FSC-Area/FSC-Height, а отдельные клетки были закрыты и проанализированы на поверхностную экспрессию CD31 (иерархическая стратегия стробирования, не показана). В лучшем случае были получены ~70% чистые одиночные клетки HLMVEC (рис. 3A, B). Следует отметить, что выход HLMVEC был значительно снижен, когда образец не был обработан сразу после операции или когда донор был пожилым или курильщиком.

Для получения более чистых препаратов HLMVEC клетки CD31+ сортировали и высевали в 1,5% культуральные планшеты, покрытые желатином. Отсортированные клетки приняли характерную эндотелиальную форму (рис. 3C), и, как сообщается на рисунке 3D, конфокальная микроскопия показала, что почти 100% клеток, очищенных FACS, были окрашены положительно на антигены EC, а именно CD31 и более специфический фактор фон Виллебранда (vWF)23. Более того, когда эти клетки были посеяны в Matrigel, они генерировали трубчатые структуры, а также HUVEC (рис. 3E), тем самым подтверждая их эндотелиальный фенотип.

Figure 1
Рисунок 1: Схематическое изображение процедуры. На блок-схеме показана процедура выделения эндотелиальных клеток и удаления неэндотелиальных клеток. Каждый шаг повторяет события, описанные в шагах 2-6 экспериментального протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Иллюстрация оптимизированной процедуры выделения ЕС. (A) Репрезентативное изображение образца паренхимы легкого, нарезанного небольшими фрагментами перед расщеплением коллагеназы (слева) и инкубированного в пробирке объемом 15 мл, содержащей 5 мл коллагеназы 2 типа (справа). (B) Схематическое (слева) и фактическое (справа; увеличение: 100-кратное) изображение клеточных популяций, полученных после расщепления коллагеназы. Эти популяции включают единички не-ЭК и ЭК, группы ЭК и группы не-ЭК, связанные с волокнами, которые удаляются с помощью сетчатых фильтров. (C) Последовательная фильтрация с использованием металлических сетчатых фильтров 70 мкм и 40 мкм. D) Изображение пробирки объемом 50 мл после низкоскоростного центрифугирования и до отделения надосадочных веществ от гранул в "пробирке 1" и "пробирке 2". Клеточные кластеры содержатся в грануле, в то время как отдельные клетки в основном содержатся в надосадочной жидкости. е) изображение, показывающее различные цвета и составы гранул и изолированных клеток из "пробирки 1" (вверху) и "пробирки 2" (внизу); Увеличение: 100x. Аббревиатура: EC = эндотелиальные клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Фенотипическая и функциональная характеристика HLMVEC . (A) Смешанная клеточная популяция, полученная из эксплантата паренхимы легких. (B) Обнаружение CD31 с помощью проточной цитометрии на поверхности клеток в конце первого прохождения. Процентная чистота (70%) относится к используемой стратегии иерархического стробирования. (C) Чистые HLMVEC после сортировки в прямом эфире на антиген CD31. (D) Репрезентативные иммунофлуоресцентные конфокальные микроскопические изображения положительного окрашивания CD31 (слева) и vWF (справа) (масштабная линейка: 50 мкм). (E) Снимки светлого поля были получены через 6 часов после посева HUVEC или HLMVEC на Matrigel.Увеличение (A, C, E): 100x. Сокращения: HLMVEC = микрососудистые эндотелиальные клетки легких человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Многочисленные роли, которые играют сосудистые эндотелиальные клетки в патофизиологии человека, делают эти клетки незаменимым инструментом для патогенетических и фармакологических исследований in vitro . Поскольку ЭК из разных сосудистых участков/органов проявляют специфические особенности и функции, наличие здоровых и больных ЭК из интересующего органа было бы идеальным для исследовательских целей. Например, HLMVEC необходимы для исследований воспаления легких; Таким образом, методология выделения этих клеток с высоким выходом и высокой чистотой принесет пользу различным областям исследований.

Методы выделения HLMVEC были зарегистрированы различными группами 10,11,12,14,15,17,18,19. В каждом методе внедрены инновационные подходы, такие как сортировка клеток с помощью магнитных шариков 11,12,15,17,18 или механическая диссоциация с использованием тупой канюли17,18. Настоящий протокол был разработан для сбора небольших островков эндотелиальных клеток, полученных после расщепления коллагеназой, и использовал последовательные центрифугирования на основе времени седиментации для повышения чистоты ЭК в исходной смешанной клеточной популяции. Этот момент имеет решающее значение, поскольку более высокое начальное количество клеток означает, что для достижения количества клеток, необходимого для экспериментов, необходимо меньшее количество расширений in vitro, что, в свою очередь, означает, что больше исследований может быть завершено до старения ЭК. Этот аспект строго связан со степенью чистоты изолятов HLMVEC, что также актуально для получения достоверных результатов. Более того, если образец легких очень мал по размеру и нет возможности выполнить сортировку ЭК сразу после экспланта, что, по нашему опыту, было наиболее частым сценарием, загрязняющие SMC будут расти быстрее, чем EC, тем самым захватывая культуру и снижая выход EC после сортировки клеток.

В этом исследовании мы попытались рассмотреть эти моменты. Для этого первоначально контролировалось, что происходило с образцами легких после переваривания коллагеназы, и было выявлено значительное загрязнение различными типами клеток, особенно SMC (рис. 2), которые быстро растут и могут обгонять HLMVEC в смешанных культурах. Поэтому была разработана стратегия, направленная на минимизацию этого загрязнения сразу после пищеварения (рис. 1 и рис. 2). Примечательно, что HLMVEC с чистотой ~ 70% (рис. 3A, B) были последовательно получены на первой фазе выделения. Этот превосходный результат облегчил последующий этап очистки с помощью FACS, что привело к конечному результату получения практически чистых, функциональных HLMVEC (рис. 3C-E). Аналогичные результаты были получены, когда сегменты легочной артерии использовались в качестве исходного материала, а HPAEC были изолированными клетками, что означает, что эта методология представляет собой улучшение методологии, о которой сообщалось ранее8.

Несмотря на простоту и воспроизводимость, эта процедура имеет ключевые требования. Например, мы преуспели в выделении HLMVEC только путем обработки фрагментов легких, полученных в течение 3-6 часов после хирургического иссечения, тогда как более длительные интервалы были связаны с плохими исходами (данные не показаны). Время переваривания коллагеназы также может привести к изменчивости выхода ЭК из-за вариаций ферментативной активности24 от партии к партии. Еще один критический момент связан с состоянием образца. Паренхима легких, полученная от курильщиков или пожилых доноров, давала низкие урожаи HLMVEC. Кроме того, надосадочная жидкость низкоскоростного центрифугирования может содержать некоторые агрегаты, которые переносятся в «пробирку 2». По этой причине рекомендуется сохранять содержимое «пробирки 1» и «пробирки 2» в культуре, по крайней мере, на ранней стадии выделения клеток. Прямая сортировка клеток CD31+, как ранее описано в протоколах выделения ЕС 11,12,15,17,18, также может представлять собой хорошее решение для повышения чистоты с самого начала. Мы не применяли эту раннюю стадию сортировки из-за небольшого размера анализируемых образцов. Однако эта возможность будет проверена в будущем при реализации протокола.

Простой и надежный протокол изоляции для выделения HLMVEC и HPAEC побудит исследователей использовать этот путь для получения клеток для своих исследований, особенно когда эти клетки не являются коммерчески доступными. Например, выделение HLMEC из легких с муковисцидозом позволит построить полные дыхательные пути CF на чипе25. Кроме того, создание собственной коллекции EC позволит исследователям планировать и проводить больше экспериментов с меньшими затратами.

В заключение, этот метод, который устраняет некоторые критические моменты, которые могут возникнуть во время выделения ЭК из хирургических образцов, улучшает существующие методы, тем самым облегчая исследования патобиологии ЭК и воспаления.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что исследование проводилось без каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана средствами Министерства университетов и исследований Италии (за исключением 60% 2021 и 2022 гг.) для R. P. и грантами Итальянского фонда муковисцидоза (FFC # 23/2014) и Министерства здравоохранения Италии (L548/93) для M. R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% trypsin-EDTA 1X GIBCO 25300-054 Used to detach cells from the culture plates
Anti CD31 Antibody, clone WM59 Dako M0823 Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50
Anti vWF Antibody Thermo Fisher Scientific MA5-14029 Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100
Autoclavable surgical scissors Any Used for chopping specimens
Cell strainers 40 µm Corning 431750 Used during the second filtration
Cell strainers 70 µm Corning 431751 Using during the first filtration
Collagenase, Type 2 Worthington LS004177 Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL
Conjugated anti CD31 Antibody BD Biosciences 555445 Used for cell sorting (1:20 dilution)
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with  CaCl2 and MgCl2 Sigma-Aldrich D8662 Used for cell washing before medium change
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2 Sigma-Aldrich D8537 Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization
Endothelial Cell Growth Medium MV PromoCell C-22020 HLMVEC growth medium
Fibronectin Sigma-Aldrich F0895 Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL
Gelatin from porcine skin, type A Sigma-Aldrich G2500 Used for plate coating
Type A gelatin Sigma-Aldrich g-2500 Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5%

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Muller, W. A. Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response. Trends in Immunology. 24 (6), 326-333 (2003).
  2. Sumpio, B. E., Timothy Riley, J., Dardik, A. Cells in focus: Endothelial cell. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 34 (12), 1508-1512 (2002).
  3. Lüscher, T. F., Tanner, F. C. Endothelial regulation of vascular tone and growth. American Journal of Hypertension. 6, 283-293 (1993).
  4. Marki, A., Esko, J. D., Pries, A. R., Ley, K. Role of the endothelial surface layer in neutrophil recruitment. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 503-515 (2015).
  5. Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. W. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Journal of Visualized Experiments. (3), e183 (2007).
  6. Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. Journal of Visualized Experiments. (66), e4032 (2012).
  7. Dejana, E., Corada, M., Lampugnani, M. G. Endothelial cell-to-cell junctions. FASEB Journal. 9 (10), 910-918 (1995).
  8. Plebani, R., et al. Establishment and long-term culture of human cystic fibrosis endothelial cells. Laboratory Investigation. 97 (11), 1375-1384 (2017).
  9. Totani, L., et al. Mechanisms of endothelial cell dysfunction in cystic fibrosis. Biochimica Et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1863 (12), 3243-3253 (2017).
  10. Gaskill, C., Majka, S. M. A high-yield isolation and enrichment strategy for human lung microvascular endothelial cells. Pulmonary Circulation. 7 (1), 108-116 (2017).
  11. Hewett, P. W. Isolation and culture of human endothelial cells from micro- and macro-vessels. Methods in Molecular Biology. 1430, 61 (2016).
  12. van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
  13. Comhair, S. A. A., et al. Human primary lung endothelial cells in culture. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (6), 723-730 (2012).
  14. Visner, G. A., et al. Isolation and maintenance of human pulmonary artery endothelial cells in culture isolated from transplant donors. The American Journal of Physiology. 267, 406-413 (1994).
  15. Mackay, L. S., et al. Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema. Respiratory Research. 14 (1), 23 (2013).
  16. Ventetuolo, C. E., et al. Culture of pulmonary artery endothelial cells from pulmonary artery catheter balloon tips: considerations for use in pulmonary vascular disease. The European Respiratory Journal. 55 (3), 1901313 (2020).
  17. Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 1458 (2019).
  18. Wong, E., Nguyen, N., Hellman, J. Isolation of primary mouse lung endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (177), e63253 (2021).
  19. Kraan, J., et al. Endothelial CD276 (B7-H3) expression is increased in human malignancies and distinguishes between normal and tumour-derived circulating endothelial cells. British Journal of Cancer. 111 (1), 149-156 (2014).
  20. Khan, S. Y., et al. Premature senescence of endothelial cells upon chronic exposure to TNFα can be prevented by N-acetyl cysteine and plumericin. Scientific Reports. 7 (1), 39501 (2017).
  21. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
  22. Miron, R. J., Chai, J., Fujioka-Kobayashi, M., Sculean, A., Zhang, Y. Evaluation of 24 protocols for the production of platelet-rich fibrin. BMC Oral Health. 20 (1), 310 (2020).
  23. Lenting, P. J., Christophe, O. D., Denis, C. V. von Willebrand factor biosynthesis, secretion, and clearance: Connecting the far ends. Blood. 125 (13), 2019-2028 (2015).
  24. Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-lot variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).
  25. Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. 21 (4), 606-615 (2021).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 192 Эндотелиальные клетки эксплантат эндотелий легкие выделение клеток воспаление
Выделение и очистка микрососудистых и макрососудистых эндотелиальных клеток из образцов, полученных из легких
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Plebani, R., D'Alessandro, A.,… More

Plebani, R., D'Alessandro, A., Lanuti, P., Simeone, P., Cinalli, M., Righi, I., Palleschi, A., Mucci, M., Marchisio, M., Cappabianca, F., Camera, M., Mucilli, F., Romano, M. Microvascular and Macrovascular Endothelial Cell Isolation and Purification from Lung-Derived Samples. J. Vis. Exp. (192), e64885, doi:10.3791/64885 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter