Summary
本文介绍了通过分离小鼠主动脉，然后提取钙化的细胞外囊泡来观察矿化潜力来获取和评估血管钙化的方法。
Abstract
心血管疾病是世界上导致死亡的主要原因，血管钙化是心血管事件最重要的预测指标;然而，目前没有血管钙化的治疗或治疗选择。钙化始于专门的细胞外囊泡（EV），其通过聚集钙和磷酸根离子作为成核病灶。该协议描述了获取和评估鼠主动脉钙化并分析相关提取的EV的方法。首先，对小鼠进行大体解剖以收集任何相关器官，例如肾脏、肝脏和肺。然后，分离鼠主动脉并从主动脉根部切除到股动脉。然后将两到三个主动脉汇集并在消化溶液中孵育，然后进行超速离心以分离感兴趣的 EV。接下来，通过在高磷酸盐溶液中孵育并测量 340 nm 波长处的光吸光度来确定 EV 的矿化潜力。最后，使用胶原蛋白水凝胶观察EV在 体外产生的钙化矿物形成和成熟。
Introduction
钙化是心血管疾病死亡率和发病率的最重要预测指标1.钙化会由于钙和磷酸盐矿物质的堆积而改变动脉壁力学2。在动脉粥样硬化中，钙化会加剧局部压力并导致斑块破裂，这是心脏病发作的主要原因。内侧钙化（通常由慢性肾脏疾病引起）更为普遍，可导致显著的动脉僵硬、功能障碍和心脏超负荷2，3。目前，没有治疗或预防血管钙化的治疗选择。
血管平滑肌细胞 （VSMC） 采用成骨细胞样表型并释放钙化细胞外囊泡 （EV），这些囊泡对新生矿物质进行成核，从而驱动钙化4，5，6。这个过程类似于骨7中成骨细胞的生理矿化。尽管血管壁和骨基质中的矿化终点相似，但钙化EVs的起源机制在两种组织中不同8。有许多类型的模型用于研究血管钙化。在体外，细胞培养模型用专门的培养基模拟VSMC的成骨转变和随后的矿物形成。
在研究 体内 钙化时，使用的模型取决于所研究的钙化类型。高脂血症小鼠模型通常用于研究动脉粥样硬化性钙化，这在富含脂质的斑块中显得更局灶性9。相比之下，内侧钙化在整个脉管系统中更为普遍，并且通常使用慢性肾脏疾病模型进行研究，该模型采用富含腺嘌呤的饮食方案来诱导肾衰竭或手术技术切除肾脏的重要部分10，11。积极的血管钙化模型使用了高脂血症和慢性肾脏疾病模型的组合12。该协议提供了一种评估小鼠主动脉血管钙化的方法，用于内侧和动脉粥样硬化钙化，从主动脉壁中提取EV，并观察从 体外 细胞培养模型获得的EV中的矿化潜力。未来的研究可以将这些程序用于血管钙化的机制分析，并评估潜在的治疗干预措施。
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Protocol
体内工作由佛罗里达国际大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准和监督，并符合当前的美国国立卫生研究院（NIH）指南。对于该协议，该过程不会因小鼠的应变，体重，年龄和性别而异。正在研究的钙化类型，饮食和治疗可能会改变研究的长度和所用小鼠的重量，并且可能取决于研究中使用的小鼠的特定品系和性别。对于该协议，使用雄性和雌性C57BL / 6J小鼠，并喂食钙化饮食。小鼠在20周至24周大之间被处死。
1.主动脉的分离和切除
- 荧光标记
- 在安乐死前48小时，通过静脉注射 以 每25g100μL的推荐剂量向小鼠注射20μM OsteoSense 680，一种荧光成像剂。
- 在通风橱下，将带有四个 T 形针的聚苯乙烯泡沫塑料板、一个衬有纸巾的桶、一个塞满纸巾的 50 mL 管、一个 1.5 mL 微量离心管、解剖工具（见 材料表）和乙醇放入喷雾瓶中。将装有PBS的烧杯放在冰上。
- 抽血
- 将 2 mL 异氟醚加入塞满纸巾的 50 mL 锥形管中。将管子放入桶中，并用盖子将其关闭。
注意：异氟醚应在通风良好的空间中处理，由于短期暴露的毒性，废气不得再循环。 - 一次将一只鼠标转移到存储桶中。镇静后，将鼠标放在背侧位置的纸巾上。用非惯用手掌握住鼠标，用拇指和食指将耳朵放回原处。
- 用镊子切除其中一只眼睛。将鼠标保持在 1.5 mL 管上方开始采血，在此期间应采集 1 mL 血液。一旦血液停止排出，将鼠标放回桶中以进一步镇静。
- 将 2 mL 异氟醚加入塞满纸巾的 50 mL 锥形管中。将管子放入桶中，并用盖子将其关闭。
- 安乐死
- 将纸巾放在解剖垫上。一旦鼠标镇静，将鼠标以仰卧姿势放在垫子上。使用 T 形销将鼠标固定在仰卧位置以按住每个肢体。
- 用酒精喷洒在小鼠的腹部。用镊子提起胸部区域的皮肤。用剪刀将内侧线切入胸腔。一旦胸骨从中心切下来，就切开胸腔两侧的横膈膜。
- 如有必要，切掉胸腔的额部以暴露心脏和肺部。
- 器官切除
- 使用镊子，提起皮肤并在中线做一个切口。去除多余的皮肤或脂肪。去除生殖器官和膀胱，以及中线以外的任何脂肪。
- 将胃肠道 （GI） 器官移到右侧，并沿着中线的肠道移动。一旦找到，抬起中线，并将胃肠道切除到胃部。
- 通过将肾脏从中线抬起来切除肾脏。切得尽可能靠近肾脏。
- 接下来，通过抬起叶并从中线切开来开始切除肝脏。
- 灌注心脏和主动脉。使用 10 mL 注射器将冷 PBS 注入右心室。等待肺部充气并变白。取出肺部，以及任何多余的横膈膜或胸腔。
- 骨切除
- 打开一把宽的剪刀，将它们放在鼠标尾巴上方的下部区域。向下切割，然后开始从皮肤上抬起脊柱。去除中线两侧的脂肪。一旦皮肤脱落，通过在心脏上方切割来切除脊柱和完整的器官。如果转运到立体镜，请将脊柱和完整的器官放在冰桶中的PBS烧杯中。
- 将脊柱和器官移入解剖盘中。装满冰冷的PBS。用针头钉住脊柱和胸腔。
- 在解剖显微镜下，用镊子小心地抬起心脏，然后开始在脊柱上方和主动脉下方切割。继续此操作，直到到达脊柱底部。从解剖盘中取出脊柱，并固定心脏和任何多余的脂肪或肌肉。
- 显微切割
- 从心脏正下方的区域开始，确定三个管状结构：食道、腔静脉和主动脉。切除食道和腔静脉，以获得清晰的主动脉视野。
- 使用显微解剖钳和剪刀，开始提起脂肪组织并尽可能靠近主动脉切割。一定不要切开主动脉。沿着内侧线继续，直到所有主动脉和股动脉都暴露出来。
- 在心脏处，去除所有脂肪组织，露出主动脉弓处的三个分支。通过将显微切割剪刀插入左心室并切割主动脉周围的肌肉，从左心室移除主动脉根部。
- 分离并清洁主动脉后，使用近红外扫描仪对主动脉进行成像，以可视化血管钙化。
- 使用自定义 MATLAB 脚本（补充文件 1）量化钙示踪剂的总信号，并将其归一化为总扫描的主动脉区域。MATLAB 脚本使用生物信息学工具箱加载项运行。首先从主动脉的近红外扫描将MATLAB定向到TIFF文件的位置，然后打开单个文件，并从TIFF文件中提取像素强度值。
- 将图像呈现给用户后，选择钙化程度最大的主动脉作为比例最大值。
- 当 MATLAB 在命令窗口中询问“图像中有多少个标本？”时，输入当前图像中的主动脉数量，然后逐个选择每个主动脉。选择主动脉后，MATLAB 将创建一个二值图像，其中包含主动脉总面积的掩码和另一个带有主动脉钙化区域的掩码的二值图像。然后使用这些遮罩图像的值来确定总钙化面积、主动脉总面积、钙化阳性面积百分比和钙化面积的平均强度。
- 要选择主动脉，请在屏幕上最新图形上感兴趣的主动脉周围创建一个框，方法是单击左键选择四个角并在图像周围创建一个框。要关闭该框，请双击第一个角。
注意：阈值可能因所使用的钙化模型而异。由用户决定什么值决定了血管钙化的正信号。为实验设置阈值后，该阈值必须在整个实验期间保持不变。
- 提取定量数据后，使用 Tukey 事后检验执行单因素方差分析，以显示组之间的显著性。
2. 从主动脉中分离和提取电动汽车
注意：一旦主动脉被分离并移除，就可以从组织中提取EV。使用消化溶液和多次离心循环，可以收集 EV 并用于许多不同的技术，包括钙化测定、凝胶电泳和免疫印迹13。用于隔离和提取EV的协议如下：
- 扫描主动脉后，立即汇集两到三个主动脉以产生足够的蛋白质浓度。
- 制备含有 0.25 M 蔗糖、0.12 M 氯化钠 （NaCl）、0.01 M 氯化钾 （KCl）、0.02 M 三盐酸盐和 600 U/mL 胶原酶的消化溶液13。
- 在37°C下在1.5mL消化溶液中孵育2至3个混合的主动脉2小时。 收集解决方案。将溶液以1，000× g 离心15分钟以除去细胞碎片。
- 将上清液以33，000× g 再离心30分钟以除去微泡。收集并评估上清液的钙化电位（见第3节）。
注意：如果要对EV进行凝胶电泳和蛋白质免疫印迹，请按照以下步骤操作。 - 将上清液以100，000 ×g 超速离心1小时以分离感兴趣的EV。
- 当上清液进行超速离心时，通过加入蛋白酶抑制剂并涡旋直至溶解来制备RIPA裂解和提取缓冲液（参见 材料表）。
- 超速离心完成后，吸出上清液，留下含有EV的沉淀。将沉淀悬浮在制备的RIPA裂解物和蛋白酶抑制剂混合物中。样品已准备好进行凝胶电泳和蛋白质印迹。
3.用光散射吸光度评估细胞外囊泡的钙化潜力
注意：为了测量 EV 的实时矿物形成，我们使用了一种最初开发的测定法，用于研究来自细胞培养物的生长板软骨 EV 的矿物形成14。由于磷酸钙沉积是钙化的标志，因此磷酸钙化合物形成导致的光散射吸光度增加表明钙化电位14。 体外 VSMC模型便于测量EV的钙化电位。在该技术中，带有短波长滤光片的酶标仪可以量化EV的 体外 钙化。吸光度读数记录在340nm处，较高的吸光度表明更多的磷酸钙矿物形成。光散射吸光度测定的方案如下：
- 将VSMC的条件收集培养基以1，000× g 离心5分钟以除去细胞碎片14。
- 将上清液以33，000× g 离心30分钟，收集上清液，并将其转移到新管中。
注意：收集的上清液中EV的存在可以通过动态光散射（DLS）或纳米颗粒跟踪分析（NTA）来确认 - 制备300mM磷酸钠一元（NaH2PO4）无菌溶液。如有必要，过滤溶液以确保无菌条件。
- 向 EV 样品中加入 1% （v/v） 的 300 mM NaH2PO4 ，并轻轻移液溶液以充分混合。将 200 μL 混合物溶液转移到 96 孔板中。在酶标仪中于37°C孵育96孔板。
- 将酶标仪设置为每1分钟记录340nm波长处的吸光度。
4.用胶原水凝胶评估细胞外囊泡的钙化矿物形成
注意：通过胶原蛋白水凝胶观察到EV的聚集和微钙化的形成。这些水凝胶充当支架，模仿体内观察到的胶原蛋白密度15。这证明了胶原蛋白对钙化生长的影响。评估水凝胶中EV矿物形成的方案如下：
- 第一天
- 在DMEM中制备2.5毫克/毫升的胶原蛋白溶液。在胶原蛋白/ DMEM混合物中缓慢加入5 M氢氧化钠，直到颜色变为红色。检查溶液的pH值是否约为7。
注意：如果解决方案变为紫色并且变得太基本，请重新启动该过程。 - 将 300 μL pH 值为 7 的 2.5 mg/mL 胶原蛋白溶液移液到 8 孔室玻璃的每个孔中。在37°C和5%CO2 控制湿度下孵育72小时。
- 在DMEM中制备2.5毫克/毫升的胶原蛋白溶液。在胶原蛋白/ DMEM混合物中缓慢加入5 M氢氧化钠，直到颜色变为红色。检查溶液的pH值是否约为7。
- 第四天
- 向孔中加入 300 μL DMEM 作为对照。
- 将先前收集的 300 μL EV 培养基样品加入剩余孔中。
- 在37°C和5%CO2 受控湿度下孵育6天。
- 第10天
- 准备 2.5 μL 骨感 680EX 和 22.5 μL DMEM。
- 将 2.5 μL 骨感和 DMEM 混合物移液到每个孔中。在37°C和5%CO2 控制湿度下孵育24小时。
- 第11天
- 使用适用于骨感荧光的滤光片对水凝胶进行成像。使用倒置显微镜通过盖玻片室的底部或使用长工作距离物镜从顶部成像它们。
- 使用 ImageJ 中提供的 颗粒分析 选项评估收集的图像中的钙化次数和钙化大小。
- 使用 图像 |调整 |阈值 命令，用于对图像进行二值化，以便只有骨感信号显示为白色。使用 “分析”|”分析粒子 命令以获取图像中每个钙化的信息。确保对分析的每个图像使用相同的阈值参数以确保一致性。
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Representative Results
提取主动脉后，使用近红外光学扫描仪成像显示主动脉的视觉表现以及血管钙化（图1）。扫描荧光图像中的像素强度值表示钙化的分布，此处使用彩色热图显示。定量方法包括识别阳性阈值并报告主动脉面积的百分比，其值大于该阈值和/或报告主动脉内像素的平均荧光强度。如图 2 和 图3所示，市售的原代人冠状动脉平滑肌细胞用于演示该技术。来自VSMC的调节介质可用于测量电动汽车的钙化电位。使用酶标仪通过480nm处的光吸收率测量随时间变化的矿物形成（图2A，B）。矿化快速阶段的线性回归显示，与对照样品相比，亲钙化样品的吸光度增加速度快1.5倍。在胶原水凝胶中，钙沉积可以通过成像骨感荧光可视化（图3A，B）。单个钙化表现为水凝胶内的骨感阳性区域。
图 1：解剖后主动脉成像。 扫描后，可以在C57BL / 6J小鼠的主动脉内看到钙化。与对照小鼠（右）的两个主动脉相比，在整个患有慢性肾脏疾病的小鼠（最左）的主动脉中观察到更高的Osteosense信号。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：用于测量 EV 钙化电位的矿物吸光度。 （一，二）与正常对照培养基（浅灰线）相比，340 nm 处的光散射在从促钙化培养基（暗线）培养的 VSMC 获得的条件培养基中具有更高的吸光度。（C）测定前20分钟的线性回归显示促钙化样品中的矿物形成更快。缩写：EV = 细胞外囊泡;VSMC=血管平滑肌细胞。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：胶原蛋白水凝胶中条件培养基的矿物质形成。 将来自（A）对照细胞和（B）细胞在促钙化培养基中培养21天的条件培养基置于胶原水凝胶中。远红色Osteosense荧光的成像显示（A）对照样品中的最小信号和（B）存在由在促钙化条件下培养的细胞的条件培养基形成的矿物质。刻度 = 5 μm。 请点击此处查看此图的大图。
补充文件 1：用于量化钙示踪剂总信号的自定义 MATLAB 脚本。请点击此处下载此文件。
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Discussion
执行协议时，重要的是要注意获得成功结果的关键步骤。在小鼠主动脉的分离过程中，正确进行灌注至关重要。注射PBS时，必须注意不要刺穿右心室。这将导致液体直接从心室泄漏出来，无法通过肺部循环，在主动脉内留下血液。一旦灌注正确进行并开始显微解剖，必须在完成和扫描之前从主动脉中取出所有脂肪和脂肪组织。剩余的脂肪将导致主动脉在将数据标准化为总组织大小时显得更大。
由于解剖过程中小鼠主动脉的大小有限，因此通常会将主动脉刺穿或切成两半。如果发生这种情况，建议继续正常解剖。主动脉碎片可以靠近放置以进行成像。主动脉也可以成片放入消化溶液中，用于EV隔离。当开始分离EV时，需要多个主动脉才能产生足够的蛋白质。这种限制意味着必须解剖更多的小鼠以收集适量的组织以产生可靠的结果。
在演示的方法中，我们展示了如何直接从培养中的VSMC的条件培养基中测量EV的矿化潜力。光散射协议是一种用于实时测量电动汽车矿物形成的简单方法14。这提供了对电动汽车内钙化发生的时期的深入了解。胶原蛋白水凝胶为指导EV的聚集和钙化提供了一个平台，用于矿化的三维分析15。到目前为止，我们仅对 体外 研究中的电动汽车进行了这些分析;然而，在未来的研究中，我们将寻求调整这些方法来分析从小鼠主动脉分离的电动汽车的矿化潜力。
心血管疾病是世界上导致死亡的主要原因，钙化是发病率和死亡率的最重要预测指标。通过确定EV导致钙化的机制，未来的研究可以集中在通过抑制导致钙化EV释放的途径以及直接与矿化过程相互作用来控制矿物质生长作为治疗策略。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）国家心脏，肺和血液研究所（1R01HL160740和5 T32GM132054-04）和佛罗里达心脏研究基金会的资助。我们要感谢Kassandra Gomez帮助合成和成像水凝胶。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well chambered coverglass | Thermo Scientific | 155409PK | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 20 G 1 inch Needle | BD | 305175 | |
| Collagen, High Concentraion, Rat Tail | Corning | 354249 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | LS004174 | |
| Curved Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-8254 | |
| Dissection Dish | Living Systems Instrumentation | DD-90-S | |
| Dissection Pan and Wax | United Scientific Supplies | DSPA01-W | |
| DMEM | Cytiva | SH30022.FS | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| LI-COR Odyssey | LI-COR | DLx | |
| Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5677 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5600 | |
| Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip) | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | B11229 | |
| OsteoSense 680EX | Perkin Elmer | NEV10020EX | |
| Pierce Protease Inhibitor | Thermo Scientific | A32963 | |
| Potassium Chloride | Fischer Chemical | P217 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | G Biosciences | 786-489 | |
| Sodium Chloride | Fischer Chemical | BP358 | |
| Sodium Hydroxide | Thermo Scientific | A4782602 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Synergy HTX Multimode Reader | Agilent | ||
| Tissue culture plate, 96-well | Thermo Fisher | 167008 | |
| T-Pins | United Scientific Supplies | TPIN02-PK/100 | |
| Tris Hydrochloride | Fischer Chemical | BP153 |
References
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