Summary
该协议描述了一种有效且廉价的方法，该方法使用液体培养基来评估化学毒物对成年 黑腹果蝇活力的影响。
Abstract
人类工业产生数十万种化学物质，其中许多尚未对环境安全或对人类健康的影响进行充分研究。目前在哺乳动物身上的测试方法昂贵、劳动密集型和耗时，加剧了这种化学安全信息的缺乏。最近，科学家和监管机构一直致力于开发用于化学安全测试的新方法（NAM），这些方法更便宜，更快速，并减少动物的痛苦。即将出现的关键不结盟运动之一是使用无脊椎动物生物作为哺乳动物模型的替代品，以阐明包括人类在内的远亲物种的保守化学作用模式。为了推进这些努力，在这里，我们描述了一种使用果蝇 Drosophila melanogaster来评估化学安全性的方法。该协议描述了一种简单，快速且廉价的程序，用于测量暴露的成年果蝇的生存能力和摄食行为。此外，该协议可以很容易地适应于生成基因组和代谢组学方法的样品。总体而言，该协议代表了将 果蝇 建立为用于精密毒理学的标准模型的重要一步。
Introduction
人类经常接触各种来源的化学物质，包括空气1、食物2、水3、4、药物5、清洁剂6、个人护理产品7、工业化学品7和建筑材料7。此外，每年引入数千种新化学品8，其中许多未经适当的健康和环境安全审查。缺乏足够的化学安全性测试部分源于过度依赖哺乳动物模型，如小鼠和大鼠。虽然这种啮齿动物模型提供了丰富的信息，但这些系统中的化学安全测试昂贵、耗时，并且经常给试验动物带来不可接受的痛苦程度9。
与哺乳动物化学品安全测试相关的财政和伦理负担，以及哺乳动物研究的耗时性，是导致新化学品数据匮乏的主要因素。为了解决这个问题，美国环境保护署（EPA）、欧洲化学品管理局（ECHA）、加拿大卫生部和其他机构正在实施将新方法（NAM）纳入监管框架的措施10，从而使北美和欧洲的政策符合替代，减少和改进动物使用的国际目标（3R原则）11，12,13,14.NAM包括主要基于体外和计算机模型的各种测定，这些分析提供了对化学毒性的机理理解，而不是观察对哺乳动物测试物种造成的逆境，从而提高了化学风险评估的数据生成率，同时仍产生高保真输出15.然而，这些方法尚未被证明可以防止全身毒性，包括涉及器官间通讯和内分泌信号传导的重要生物过程的破坏。此外，它们无法解释特定组织中化学物质的生物积累，单个化合物被吸收和分泌的能力以及行为与化学品暴露之间的相互作用。
由于体外和计算模型的局限性，成功利用NAMs减少或替代哺乳动物模型还应包括无脊椎动物体内模型，如果蝇、黑腹果蝇等。先前的飞行研究表明，这种生物非常适合研究保护动物细胞免受有毒分子侵害的保守遗传途径16,17,18,19,20,21,22。此外，苍蝇显示出与人类的显着遗传相似性，包括超过65%的人类疾病的功能同源物23,24,25，以及重要功能通路的更大保护性26。这些特征，加上它们相对较短的生命周期、低维护成本和易于观察到的行为反应，使果蝇非常适合用作毒理学模型27,28,29,30。此外，苍蝇的通量比啮齿动物模型高得多，并且可以捕获其他非有机体NAM不容易检测到的新陈代谢，生理和激素信号传导的影响9。
此处描述的方案代表了一个框架，用于测试化学暴露对成年 果蝇的影响。该方法旨在高效、廉价且可重现，同时还最大限度地减少了研究人员必须与测试化学品接触的时间，并适应代谢组学和其他组学方法的样品收集。该方案针对每个实验测试一种化学物质进行了优化，但可以轻松适应其他实验参数，例如各种溶剂或化学品组合。
Protocol
注意：本协议中的所有步骤均戴丁腈手套。根据每种评估化学品的安全数据表，穿上实验室外套、护目镜和/或呼吸器。
1. 小瓶和湿度室的准备
注意：步骤1.1-1.5可以在开始其他实验部分之前随时完成。在小瓶制备过程中，必须始终佩戴丁腈手套，以防止污染。
- 堆叠四张1级纤维素色谱纸（见 材料表），并将它们切成2条。使用包含花形模具的 1.5 英寸纸打孔器冲出花形滤纸插入物。
- 使用 22 mm x 220 mm 未上漆的木销将滤纸推到直径为 28.5 mm 的聚丙烯小瓶底部。确认一叠滤纸牢固地位于小瓶底部。
- 将准备好的小瓶存放在塑料或纸板托盘中，并将托盘放入大（~280 mm x 240 mm）塑料袋中直至使用。
- 通过在 606.24 mm x 225.42 mm x 403.22 mm 塑料桶的塑料盖上切一个 120 mm x 280 mm 的孔来构建湿度室（参见 材料表）。在孔上粘上网以允许气流。
- 从百叶窗天花板灯板（最初为 610 mm x 1220 mm）上切下一段塑料网格，以适合步骤 1.4 中使用的塑料桶底部。
注意：各种不同的塑料桶和塑料/金属网格材料可用于构建湿度室。
2.苍蝇饲养
- 在含有标准布卢明顿果蝇库存中心（BDSC）培养基的玻璃牛奶瓶中开始培养成 蝇 （至少30只成蝇）31。用用精致的工作擦拭布包裹的人造丝塞关闭瓶子。不要挤满瓶子。
注意：所需瓶子的数量取决于正在进行的化学品暴露次数和测试菌株的基因型。通常，当使用健壮和多产的库存时，可以从一个瓶子中获得数百只苍蝇。标准测定使用俄勒冈-R野生型苍蝇（BDSC原液#2057），但任何感兴趣的基因型都可以与该协议一起使用。请记住，具有低繁殖力和/或活力的受损基因型需要增加瓶培养物。 - 将培养瓶托盘在25°C，湿度约60%和12：12小时光：暗循环下孵育，直到观察到第三幼虫龄期或早期蛹期。这个阶段可以通过幼虫在瓶子侧面徘徊和瓶壁上出现蛹来识别。
注意：仅在 12：12 小时亮：暗循环的亮起期间处理苍蝇。对于坚固的库存，瓶子在所述条件下 3-4 天后达到此阶段。- 清除成年苍蝇并确定培养基的流动性。如果介质倒置时沿着瓶子的侧面流动，则介质流动性太强。将精致的任务湿巾或人造丝球插入瓶子底部，以固化苍蝇食物。
- 当苍蝇开始关闭时，清除瓶子中的所有成虫，让蛹继续关闭48小时。此时，从培养瓶中清除的任何成虫都可以转移到新瓶中以繁殖原液（参见步骤2.1）或丢弃。
- 将48小时内关闭的苍蝇转移到含有标准BDSC培养基的新瓶中。陈年3天。
注意：这些瓶子里的成虫是3-5天大，可用于致死和喂养实验。用于老化成年苍蝇的瓶子将包含卵和幼虫。因此，这些瓶子可以用来繁殖下一代苍蝇。
3. 准备苍蝇进行化学暴露
- 用CO2麻醉5-7天大的苍蝇。使用生殖器按性别对麻醉的苍蝇进行分类。有关麻醉和苍蝇的帮助，请参阅参考文献28。
- 将20只雄性或20只雌性苍蝇的组放入含有标准BDSC培养基的小瓶中。用人造丝塞关闭小瓶，并将公小瓶和母瓶分开存放。用条纹标记含有雌性苍蝇的小瓶。将装有雄性苍蝇的小瓶放在没有标记的地方，以免意外混合性别。
注意：步骤3.2中必须制备的小瓶数量由曝光实验的大小决定。如步骤5.3和5.6所述，单个测试化学品的典型测距实验至少需要40瓶雄性和40瓶雌性。步骤7.4和7.8中描述的标准剂量反应曲线实验至少需要63瓶男性和63瓶女性。 - 将小瓶在25°C，湿度约60%的培养箱中以12：12小时光：暗循环储存48小时。在此期间，以 60° 角支撑分类小瓶的托盘，以防止苍蝇在从麻醉中恢复时卡在食物中。
注意：此步骤允许苍蝇从CO2 麻醉中恢复。在暴露方案的剩余时间内不要再次麻醉苍蝇。 - 在48小时恢复期后，向步骤1.3制备的小瓶中加入0.75mL无菌纯净水。在此步骤中制备的小瓶数量应与步骤3.2中设置的小瓶数量相同。
- 通过打开装有步骤3.2中苍蝇的玻璃小瓶，将其放入准备好的塑料小瓶的口中，然后将塑料小瓶的底部敲击在台面上，将分类的，性别匹配的苍蝇转移到饥饿小瓶中。用醋酸纤维素塞（通常称为flug）关闭塑料小瓶。
- 记录在此转移中丢失的任何苍蝇（稍后转移到每个小瓶的起始苍蝇数量的记录中）。
- 用条纹标记含有雌性苍蝇的饥饿小瓶。将装有雄性苍蝇的小瓶放在没有标记的地方，以免意外混合性别。
- 准备湿度室过夜暴露。有关如何构建此腔室的说明，请参阅步骤 1.4-1.5。
- 将六条标准纸巾放在湿度室的底部。用 100 mL 水浸泡纸巾。
- 将塑料网格（步骤1.5）放在湿毛巾上，以确保小瓶不会与饱和的纸巾接触。
- 将饥饿小瓶的托盘放在湿度室内的水平位置。将湿度室置于25°C培养箱（湿度约为60%）中过夜。
注意：理想情况下，过夜饥饿期持续约16小时;但是，可以根据各个实验室时间表调整时间。
4. 储备溶液的制备
注意：在酵母蔗糖液体培养基中喂食苍蝇测试化学品。本节介绍浓缩进料介质和测试化学品的储备溶液的制备。
- 制备溶解在无菌纯化水中的4x酵母蔗糖溶液，其中含有16%蔗糖和6%酵母提取物（m / v）（参见 材料表）。在液体循环中高压灭菌溶液适当的灭菌时间（例如，1 L40分钟）。
注意：溶液可以批量制备并在-20°C下等分储存。 在使用前1天将它们放入4°C冰箱中解冻单个等分试样。 - 准备测试化学品的库存。对于初始实验，应以最高浓度制备储备溶液，以便化学品可以完全溶解在水中。
注意：水以外的溶剂可用于溶解测试化学品。请参阅有关使用替代溶剂的注意事项的讨论。 - 通过将1 g FD&C Blue No. 1（参见 材料表）溶解在10 mL无菌纯化水中，制备100x蓝色染料储备溶液。
注意：蓝色染料储备溶液可以散装并在4°C下等分储存。
5. 曝光瓶的制备：测距实验
注意：协议的步骤5和6旨在确定诱导100%致死率的最低剂量的测试化学物质和无法诱导致死表型的最高剂量。如果这些浓度已经通过先前的实验确定，请参阅步骤7和8以计算剂量 - 反应曲线。暴露培养基必须在将苍蝇添加到暴露瓶之前立即制备。
- 将八个 15 mL 离心管标记为：（i） 无化学品，（ii） 最高浓度，（iii） 1：2、1：10、1：20、1：100、1：200 和 1：1,000。
- 首先向所有八个标记的管中加入 2.5 mL 的 4x 酵母/蔗糖储备溶液，在步骤 5.1 的标记离心管中制备暴露培养基。
- 将 7.5 mL 无菌纯净水加入标有“无化学品”的试管中。该稀释液为阴性对照。
- 将 7.4 mL 的测试化学储备溶液添加到标有“最高浓度”的试管中。向该管中加入 100 μL 无菌纯化水，因此最终体积为 10 mL。计算并记录该溶液中测试化学品的摩尔浓度。
注意：向管中加入 100 μL 无菌纯化水可确保此步骤中的化学浓度与步骤 5.5 中使用的化学浓度相同，其中将蓝色染料储备溶液添加到暴露培养基中作为评估喂养行为的方法。 - 向剩余的试管中加入适量的测试化学储备溶液和无菌纯净水。每个试管的最终体积必须为 10 mL。相对于“最高浓度”试管，这些试管中测试化学品的最终浓度必须为1：2、1：10、1：20、1：100、1：200和1：1,000。
- 为步骤5.1中产生的每种暴露介质浓度准备并标记八个暴露瓶。应有八套小瓶（共64个小瓶），其中包含以下标签：无化学品，最高浓度，1：2,1：10,1：20,1：100,1：200和1：1,000。
- 将步骤5.2.3中制备的0.75mL暴露培养基移液到相应的暴露瓶中。
- 按如下方式标记八个 5 mL 单个试管：（i） 无化学品，（ii） 最高浓度，（iii） 1：2、1：10、1：20、1：100、1：200 和 1：1,000。
- 首先在八个标记的 5 mL 管中混合 500 μL 4x 酵母/蔗糖储备溶液和 20 μL 蓝色染料储备溶液，制备蓝色染料暴露培养基。
- 将 1.48 mL 无菌纯净水加入标有“无化学品”的试管中。该稀释液为阴性对照。
- 将 1.48 mL 测试化学储备溶液加入标有“最高浓度”的试管中。不向该管中添加水。计算并记录该溶液中测试化学品的摩尔浓度。
- 向剩余的试管中加入适量的测试化学储备溶液和无菌纯净水。每个管的最终体积应为2毫升。相对于“最高浓度”试管，这些试管中测试化学品的最终浓度应为1：2、1：10、1：20、1：100、1：200和1：1,000。
- 准备并标记两个暴露瓶，每种浓度的蓝色暴露介质。应有八套小瓶（共16个小瓶），其中包含以下标签：无化学品，最高浓度，1：2,1：10,1：20,1：100,1：200和1：1,000。“蓝色”一词也应该写在这些小瓶上。
- 将 0.75 mL 蓝色暴露培养基移液到相应的蓝色暴露瓶中。
6.苍蝇化学品暴露：测距实验
- 使用步骤3.7中的过夜饥饿苍蝇小瓶制备化学暴露小瓶，如下所示：
- 将四瓶饥饿的雌性苍蝇（每瓶20只苍蝇）转移到每种化学浓度的四个暴露瓶中。将这些小瓶标记为“女性”。使用步骤 3.5 中描述的相同传输方法。
- 将四瓶饥饿的雄性苍蝇（每瓶20只苍蝇）转移到每种化学浓度的四个暴露瓶中。将这些小瓶标记为“男性”。使用步骤 3.5 中描述的相同传输方法。
- 使用步骤3.7中的过夜饥饿苍蝇的小瓶制备含有蓝色染料的化学暴露瓶，如下所示：
- 将一瓶饥饿的雌性苍蝇（每瓶20只苍蝇）转移到每个化学浓度的蓝色暴露瓶中。将此小瓶标记为“女性”。使用步骤 3.5 中描述的相同传输方法。
- 将一瓶饥饿的雄性苍蝇（每瓶20只苍蝇）转移到每个化学浓度的蓝色暴露瓶中。将此小瓶标记为“男性”。使用步骤 3.5 中描述的相同传输方法。
- 记录转移后每个小瓶中存在的苍蝇数量，并记下死亡或逃逸的数量。通常，所有 20 只苍蝇都应该在一夜饥饿和转移中幸存下来。
- 将暴露瓶水平放置在新鲜制备的湿度室中（参见步骤3.6的湿度室制备）。将腔室置于湿度约为60%的25°C培养箱中，光：暗循环为12：12小时。
- 在化学品暴露开始后24和48小时检查暴露瓶。计算并记录每个时间点每个小瓶中的死苍蝇数量。
注意：死亡用作该测定的读数，但该方案可以调整用于检查其他表型。暴露的苍蝇通常在这些时间点收集用于转录组学和代谢组学研究。 - 在化学品暴露开始后24小时检查蓝色暴露瓶。使用以下技术来确定暴露的苍蝇是否消耗了蓝色暴露介质：
- 检查小瓶壁是否有蓝色粪便的迹象，这些粪便在暴露瓶的侧面和水槽上显示为小点。
- 用CO2 麻醉苍蝇并检查腹部是否存在蓝色染料。
注意：通常，蓝色暴露瓶在24小时后进行分析。但是，此步骤可以在48小时执行。正常进食的苍蝇腹部有一条蓝色条纹，表明暴露介质已进入肠道。 - 检查苍蝇的异常摄食行为，例如反流、作物扩张和肠道屏障功能崩溃（通过整个生物体中蓝色染料的出现来表明，而不仅仅是局限于胃肠道，通常称为蓝精灵32,33）。
- 将所有受污染的小瓶、滤纸、水槽和苍蝇丢弃在适当的化学废物容器中。如果活苍蝇留在小瓶中，请冷冻小瓶以杀死苍蝇，然后再将它们丢弃在适当的废物容器中。
注意：暴露瓶和苍蝇的处置由实验中分析的化学物质决定。始终遵循化学品安全数据表上概述的化学品安全程序。如果测距实验中使用的浓度以最低剂量杀死苍蝇，请使用稀释系列重复第6节，从杀死100%动物的最低浓度开始。
7. 暴露瓶的制备：生成剂量反应曲线
注意：步骤5和6中概述的方案旨在广泛确定引发表型所需的化学浓度。方案的步骤7和8用于计算准确的剂量 - 反应曲线。
- 使用以下方法计算必须分析以生成剂量反应曲线的测试化学浓度：
- 确定在48小时杀死100%暴露苍蝇的测试化学品的最低浓度。
- 在48小时确定对活力没有影响的测试化学品的最高浓度。
- 计算在步骤7.1.1和7.1.2中确定的浓度之间平均分布的另外四种浓度。
- 在9个单独的15 mL离心管上标记摩尔浓度为以下浓度：（i）无化学物质，（ii）步骤7.1.1中确定的浓度，（iii）步骤7.1.2中确定的浓度，（iv）在步骤7.1.3中确定的浓度，（v）步骤7.1.1中确定的浓度的两倍，（vi）步骤7.1.2中确定的浓度的1：2稀释。
注意：包括7.1.1中确定的浓度的两倍浓度和步骤7.1.2中确定的浓度的1：2稀释度对于准确计算剂量 - 反应曲线很重要。 - 首先将 2.5 mL 的 4x 酵母/蔗糖储备溶液添加到步骤 7.2 中制备的九个标记的单独 15 mL 离心管中，以制备暴露培养基。
- 将 7.5 mL 无菌纯净水加入标有“无化学品”的试管中。该稀释液为阴性对照。
- 向剩余的试管中加入适量的测试化学储备溶液和无菌纯净水。每个试管的最终体积必须为 10 mL。单个试管内化学品的最终浓度应等于写在试管外部的浓度。
- 为步骤7.2中产生的每种浓度的暴露介质准备并标记12个暴露瓶。应该有九套小瓶（总共108个小瓶）。
- 将 0.75 mL 暴露培养基移液到相应的暴露瓶中。
注意：步骤 7.6 到 7.8 是可选的。如果已知在步骤7.2中制备的测试化学浓度不影响摄食行为，则可以跳过这些步骤。 - 为蓝色暴露培养基制备并标记九种不同的 5 mL 管，其浓度与步骤 7.2 中使用的浓度系列相同。
- 首先混合 500 μL 4x 酵母/蔗糖储备溶液和 20 μL 蓝色染料储备溶液，制备蓝色染料暴露培养基。
- 将 1.48 mL 纯净无菌水加入标有“无化学物质”的试管中。该稀释液为阴性对照。
- 向剩余的试管中加入适量的测试化学储备溶液和纯净的无菌水。每个试管的最终体积必须为 2 mL。单个试管内化学品的最终浓度应等于写在试管外部的浓度。
- 为每种浓度的蓝色暴露介质准备并标记两个暴露瓶。应有九组小瓶（总共18个小瓶），每组小瓶标有步骤7.2中列出的浓度。“蓝色”一词也应该写在这些小瓶上。
- 将 0.75 mL 蓝色暴露培养基移液到相应的蓝色暴露瓶中。
8. 苍蝇化学品暴露：生成剂量反应曲线
- 使用步骤3.7中的过夜饥饿苍蝇小瓶制备化学暴露小瓶，如下所示：
- 将六瓶饥饿的雌性苍蝇（每瓶20只苍蝇）转移到每种化学浓度的六个暴露瓶中。将这些小瓶标记为“女性”。使用步骤 3.5 中描述的相同传输方法。
- 将六瓶饥饿的雄性苍蝇（每瓶20只苍蝇）转移到每种化学浓度的六个暴露瓶中。将这些小瓶标记为“男性”。使用步骤 3.5 中描述的相同传输方法。
- 使用步骤3.7中的过夜饥饿苍蝇的小瓶制备含有蓝色染料的化学暴露瓶，如下所示：
- 将一瓶饥饿的雌性苍蝇（每瓶20只苍蝇）转移到每个化学浓度的蓝色暴露瓶中。将此小瓶标记为“女性”。使用步骤 3.5 中描述的相同传输方法。
- 将一瓶饥饿的雄性苍蝇（每瓶二十只苍蝇）转移到一个蓝色暴露瓶中，每种化学浓度。将此小瓶标记为“男性”。使用步骤 3.5 中描述的相同传输方法。
- 记录转移后每个小瓶中存在的苍蝇数量。通常，所有20只苍蝇都应该在一夜饥饿和转移中幸存下来，但要确保从总数中减去任何在转移过程中死亡或逃脱的苍蝇。
- 将暴露瓶水平放置在新鲜制备的湿度室中（参见步骤3.6的湿度室制备）。将腔室置于湿度约为60%的25°C培养箱中，光：暗循环为12：12小时。
- 在化学品暴露开始后24和48小时检查暴露瓶。计算并记录每个时间点每个小瓶中的死苍蝇数量。
- 在化学品暴露开始后24小时检查蓝色暴露瓶。使用步骤 6.6 中概述的方法评估喂养行为的变化。
- 将所有受污染的小瓶、滤纸、水槽和苍蝇丢弃在适当的化学废物容器中。如果活苍蝇留在小瓶中，请冷冻小瓶以杀死苍蝇，然后再丢弃在适当的废物容器中。
注意：暴露瓶和苍蝇的处置由实验中分析的化学物质决定。始终遵循化学品安全数据表上概述的化学品安全程序。
9. 计算剂量-反应曲线
- 使用基准剂量软件（BMDS，版本3.2;见 材料表）或其他类似软件分析数据34。下面介绍使用 BMDS 软件的工作流程。
- 单击 BMDS 的 “数据”选项卡 ，然后单击 插入新数据集。输入数据集中的样本数，单击 二分类，然后单击创建 数据集。将每个仿行作为数据集中的单独行输入。
- 在生成的表格的第一列中输入剂量，在第二列中输入不包括在步骤8.3）之前死亡或丢失的任何苍蝇的起始数量，并在第三列中输入因化学暴露而死亡的苍蝇数量。
- 单击BMDS的主要 选项卡 。
- 单击“选择模型类型”菜单的 下拉箭头 ，然后单击 “二分类”。
- 单击数据集表中步骤 9.2 中的数据集启用。
- 单击“MLE 和备选项”表中所需 模型的框 进行分析。
注意：主要使用频率限制二分山模型。 - 单击 运行分析。程序将生成一个输出文件，其中包含致死率曲线和有关模型的其他详细信息。
Representative Results
长期以来，苍蝇一直是确定亚砷酸钠（NaAsO2）毒性35,36,37,38的研究模型。为了证明该方案的有效性，雄性和雌性苍蝇暴露于NaAsO2，目的是将这些结果与早期的研究进行比较。 使用上述方法，成年俄勒冈-R（BDSC 库存 #2057）男性和女性暴露于一系列 NaAsO2 浓度（0、0.01、0.02、0.1、0.2、1 和 2 mM），并在暴露开始后 48 小时对致死率进行评分（图 1A，B）。
该初步分析的目的是确定可以更精确地表征NaAsO2毒性的大致浓度范围。在随后的实验中，选择浓度（0,0.2,0.5,1,1.5,2,2.5,3,3.5和5mM），更精确地定义了NaAsO2剂量 - 反应曲线（图1C，D）。请注意，结果分析检查了诱导100%致死率的几种浓度。使用环境保护局公开的基准剂量软件版本3.2.0.125分析数据。数据被建模为“二分法”，二分山模型用于后续分析。基于该模型，喂食NaAsO2的雄性苍蝇的最终LD 10，LD 25和LD 50分别为0.30 mM，0.50 mM和0.65 mM。对于雌性苍蝇，这些值略高，LD10为0.30 mM，LD 25为0.65 mM，LD50为0.90 mM。总体而言，使用该方法获得的值与先前报道的黑腹果蝇砷毒性值相似 35,36,37,38，从而验证了该方法。
除了用于计算剂量 - 反应曲线的六个重复外，还给雄性和雌性苍蝇喂食含有1%FD&C蓝色的NaAsO2暴露溶液，使用光学显微镜在消化道中很容易看到。基于NaAsO 2喂养的苍蝇肠道内蓝色染料的存在，无论液体培养基中存在的NaAsO 2浓度如何，雄性和雌性苍蝇在化学暴露开始后24小时继续进食（图2）。 然而，观察到摄入的食物偶尔在女性的剂量高于0.2mM和男性的剂量高于0.5mM时反流（图2）。这些发现表明，反流可能在果蝇对砷中毒的反应中起关键作用。
图 1：用 NaAsO2 处理 48 小时的雄性和雌性果蝇的剂量反应曲线。 所有图表都显示了基于二分类希尔模型测试的每个NaAsO2浓度下死蝇的估计比例。（一，二）测试了广泛的NaAsO2浓度，以接近每种性别的苍蝇开始死亡的剂量。（A）显示男性数据，（B）显示女性数据。N = 4 个小瓶，每瓶 20 只苍蝇。（中，四）测试了较窄范围的NaAsO2浓度，以确定每种性别苍蝇中有10%，25%和50%死亡的精确剂量。这些剂量显示在每个图表的右侧。（C）显示男性数据，（D）显示女性数据。N = 6 个小瓶，每个小瓶 20 只苍蝇。请点击此处查看此图的大图。
图2：用NaAsO2处理24小时的雄性和雌性果蝇的蓝色染料测定的代表性结果。显微照片显示苍蝇喂食浓度不断增加的NaAsO2。行（A）显示雄性苍蝇，行（B）显示雌性苍蝇，NaAsO 2的浓度从左到右增加。腹部在低浓度下胸部附近显示少量蓝色，表明暴露介质进入肠道。在较高浓度下，蓝色染料开始在口腔周围积聚，表明暴露介质正在反流。比例尺为 1 毫米。请点击此处查看此图的大图。
Discussion
果蝇黑腹果蝇正在成为NAMs的强大系统16,18,19,21。通过利用苍蝇群落可用的无与伦比的遗传资源，结合基因组学和代谢组学的最新进展，使用果蝇的化学安全性研究能够快速识别单个化合物干扰代谢、生理和细胞信号传导的分子机制（例如，见39).这种廉价的方案旨在快速定义剂量反应曲线，并随后生成用于RNA-seq和代谢组学分析的样品。此外，这种灵活的方案可以适用于任何基因型，并且可以适应许多类别的化学品。
该协议的一个值得注意的方面是化学暴露中使用的液体食物的选择，这是基于以前的研究，但与果蝇18,22的大多数毒理学研究使用的固体培养基不同。选择这种特定的液体培养基以反映标准固体BDSC培养基的营养成分，该培养基在该协议中也喂食苍蝇，以确保苍蝇获得一致的营养。液体进料介质的简单性具有许多优点。液体介质比固体食品更容易处理，固体食品需要融化和重新固化或从粉末中重组。液体介质还可以提高系统的通量，确保整个进料介质中的均匀化学品分布，并减少处理有害化合物所花费的时间。此外，介质不需要加热溶液，这有助于测试挥发性测试化合物。最后，由于食品溶液中包含的成分相对较少，因此测试化学品和其他膳食成分之间的不良副反应最小化。食品中使用的酵母也是无活性的，进一步限制了喂养培养基的反应性。但是，请注意，该方法不适合测试发育或幼虫毒性。
协议中使用的一些材料可以替代，例如使用玻璃飞瓶而不是聚丙烯。然而，所使用的材料被选择为惰性和一次性的，以避免试剂之间不必要的化学反应和清洁玻璃器皿可能导致的化学暴露。
使用液体食品需要一种送餐工具。为此目的选择了醋酸纤维素滤纸，因为它具有柔韧性和惰性28。其他研究人员使用类似的协议，但使用其他车辆，例如精致的任务湿巾或玻璃纤维过滤器29,30。醋酸纤维素滤纸满足了这些需求，因为它是一种惰性载体，可以切割成理想的形状，以将其放入飞瓶的底部，纸和小瓶壁之间没有大的间隙，防止由于苍蝇卡在介质或载体本身中而死亡。
该系统的一个重要限制是化学品的最大可测试浓度与化学品的溶解度有关。非水溶性化合物需要额外的溶剂，这可能导致与目标化学品的额外或协同效应。这也可能导致无法制备足够浓缩以在所有生物体中达到所需终点的储备溶液的情况，因此限制了对结果数据的分析31。为了解决这个问题，可以通过向食品溶液中添加高达0.5%的二甲基亚砜来测试水溶性低的化学品。也可以使用其他溶剂，但需要对每种感兴趣的溶剂进行额外的研究，以确定溶液中可接受的最大溶剂浓度，以最大限度地提高溶解度，同时最大限度地减少溶剂对生物体的影响。
对果蝇嗅觉反应的广泛表征描述了果蝇如何避免食用有毒化合物40,41，从而减少对处理培养基的摄食。蓝色染料测定通过允许研究人员有效地筛选喂食每种浓度的实验化学品42,43,44的苍蝇的摄食行为来解决这一现象。苍蝇胃肠道中是否存在蓝色表明苍蝇是否一直在食用含有有毒物质的培养基。尽管存在更复杂的评估苍蝇摄食行为的方法，例如苍蝇液体 - 食物相互作用计数器45，但这种定性方法更适合更高通量的筛选。
该协议的一个值得注意的方面是，它已针对48小时暴露期进行了优化，而无需转移苍蝇或向暴露瓶中添加额外的液体。使用湿度室并将湿度室放置在保持高湿度的培养箱中可防止包含进料介质的滤纸在此期间变干。该方案可以适用于更长的暴露时间，但必须调整方法以确保滤纸不会变干，也不会因干燥而导致溶液浓度或致死率发生显着变化。
最后，该协议的一个重要特征是它可以很容易地适应遗传变异，这使得研究人员能够利用果 蝇 的大量遗传工具来扩展这些对野生型生物的初步研究，以更好地了解 体内化学作用的机制。在这方面，可以很容易地修改上述协议，以补充Peterson和Long先前描述的JoVE协议，该协议允许对野生捕获的苍蝇进行毒理学分析18。
由于以前对果蝇32,33,34,35,36中亚砷酸钠毒性的研究多种多样，因此俄勒冈R苍蝇用这种化合物处理以证明我们系统的功效。雄性苍蝇的LD 50为0.65 mM，雌性苍蝇的LD50为0.90 mM。这与以前对亚砷酸钠处理的成年果蝇的研究一致。例如，Goldstein和Babich37发现50%的苍蝇（混合性别）在暴露于0.5mM NaAsO27天后死亡。虽然这比目前观察到的剂量略低，但他们的方法和这种方法之间的差异（包括使用固体暴露介质，更长的时间尺度和混合性别）可能解释了这种差异。重要的是，这两种方法都产生了总体相似的LD50值。
使用该协议的实验观察可用于为后续的行为或机制研究找到遗传和分子靶标。暴露方法也可用于治疗 果蝇 以进行代谢组学和蛋白质组学的采样，使该协议非常适合不断发展的精准毒理学领域（从精准医学领域建模46）。在这方面，可以在步骤8之后收集暴露的苍蝇，以进行随后的基因组和代谢组学分析。然后可以按照Li和Tennessen47的描述，从步骤3开始处理在步骤8中收集的样品。
最终，从上述实验中获得的数据，以及任何随后的代谢组学和蛋白质组学数据，理想情况下将用于跨物种比较。如前所述，26，这种跨物种研究是强大的，能够确定单个化学物质如何干扰保守的生物途径。因此，上述协议可用于发现响应跨门的单个有毒物质的进化共性，并有助于为化学安全监管提供信息。
Disclosures
无需披露利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢我们的员工帮助测试和优化此协议：Ameya Belamkar，Marilyn Clark，Alexander Fitt，Emma Rose Gallant，Ethan Golditch，Matthew Lowe，Morgan Marsh，Kyle McClung，Andy Puga，Darcy Rose，Cameron Stockbridge和Noelle Zolman。我们还要感谢精准毒理学小组的同事，特别是我们的暴露小组同行，帮助确定了协议的目标。
该项目根据第965406号赠款协议获得了欧盟地平线2020研究与创新计划的资助。本出版物中介绍的工作是作为ASPIS集群的一部分进行的。本输出仅反映作者的观点，欧洲联盟不对其中所载信息的任何使用负责。该出版物也是在印第安纳州临床和转化科学研究所的支持下实现的，该研究所部分由美国国立卫生研究院，国家推进转化科学，临床和转化科学中心奖的第UL1TR002529号资助。内容完全由作者负责，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。该项目的部分内容得到了印第安纳大学授予JRS和PhyloTox财团的资金支持。JMH和EMP得到了NIH对布卢明顿果蝇种群中心P40OD018537奖的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 inch flower lever action craft punch | Bira Craft | HCP-115-024 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | VWR | 89039-666 | High-Performance Centrifuge Tubes with Flat or Plug Caps, Polypropylene, 15 mL |
| 2 ml Tubes | VWR | 16466-044 | Micro Centrifuge Tube with Flat Screw-Cap, conical bottom |
| 5 ml Tubes | VWR | 60818-576 | Culture Tubes, Plastic, with Dual-Position Caps |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430290 | 50 mL polypropylene centrifuge tubes, conical bottom with plug seal cap |
| Benchmark Dose Software version 3.2 | U.S. Environmental Protection Agency | ||
| Cardboard trays | Genesee Scientific flystuff | 32-122 | trays and dividers for narrow vials |
| CO2 gas pads | Genesee Scientific flystuff | 59-114 | FlyStuff flypad, CO2 anesthetizing apparatus |
| Combitips advanced, 50 mL | Eppendorf | 0030089693 | Combitips advanced, Biopur, 50 mL, light gray, colorless tips |
| Cotton balls | Genesee Scientific flystuff | 51-101 | Cotton balls, large, fits narrow vials |
| Delicate task wipes | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes, 1 Ply / 8.2" x 4.39" |
| Drosophila Vial Plugs, Cellulose Acetate (aka, Flugs) | VWR | 89168-888 | Wide |
| FD&C Blue No. 1 | Spectrum Chemical | FD110 | CAS number 3844-45-9 |
| Flies | BDSC | Stock #2057 | OregonR wildtype |
| Gloves (nitrile) | Kimtech | 55082/55081/55083 | Kimtech purple nitrile exam gloves, 5.9 mil, ambidextrous 9.5" |
| Grade 1 CHR cellulose chromatography paper | Cytvia | 3001-917 | Sheet, 46 x 57 cm |
| Mesh for humidity chamber | |||
| Multipette / Repeater (X) stream | Eppendorf | 022460811 | Repeater Xstream |
| Plastic grate | Plaskolite | 18469 (from lowes) | Plaskolite 24 in x 48 in 7.85 sq ft louvered ceiling light panels, cut down to fit in rubbermaid tubs |
| Plastic trays for glass vials | Genesee Scientific flystuff | 59-207 | Narrow fly vial reload tray |
| Polypropylene Drosophila Vial | VWR | 75813-156 | Wide (28.5 mm) |
| Rubbermaid tubs | Rubbermaid | 3769017 (from Lowes) | Rubbermaid Roughneck Tote 10 gallon 18" L x 12" W x 8 1/2" H |
| Sucrose ultra pure | MP Biomedicals, Inc. | 821721 | |
| Tube racks for wide-mouthed tubes | Thermo scientific | 5970-0230 | Nalgene Unwire Test tube racks, for 30 mm tubes |
| Water Purification System | Millipore Milli-Q | ZMQ560F01 | Millipore Milli-Q Biocel Water Purifier |
| Yeast extract | Acros Organics | 451120050 | CAS number 84604-16-0 |
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