Summary
このプロトコルは、液体培地を使用して、成虫ショ ウジョウバエメラノガスターの生存率に対する化学毒物の影響を評価する効率的で安価な方法を説明しています。
Abstract
人間の産業は何十万もの化学物質を生成しますが、その多くは環境の安全性や人間の健康への影響について十分に研究されていません。この化学物質の安全性情報の不足は、高価で労働集約的で時間のかかる哺乳類の現在の試験方法によって悪化しています。最近、科学者と規制当局は、より安価で、より迅速で、動物の苦痛を軽減する化学物質安全性試験のための新しいアプローチ方法論(NAM)の開発に取り組んでいます。出現する重要なNAMの1つは、哺乳類モデルの代替として無脊椎動物を使用して、ヒトを含む遠縁種全体で保存された化学的作用機序を解明することです。これらの取り組みを進めるために、ここではショ ウジョウバエメラノガスターを使用して化学物質の安全性を評価する方法について説明します。このプロトコルは、曝露された成虫のハエの生存率と摂食行動を測定するための単純で迅速で安価な手順を説明しています。さらに、このプロトコルは、ゲノムおよびメタボロミクスアプローチ用のサンプルを生成するために簡単に適合させることができます。全体として、このプロトコルは、ショウ ジョウバエ を精密毒物学で使用するための標準モデルとして確立する上で重要な前進を表しています。
Introduction
人間は、空気1、食品2、水3,4、医薬品5、洗浄剤6、パーソナルケア製品7、工業用化学物質7、建築材料7など、さまざまなソースからの化学物質に絶えずさらされています。さらに、毎年何千もの新しい化学物質が導入されており8、その多くは健康と環境の安全性について適切に審査されていません。この適切な化学的安全性試験の欠如は、マウスやラットなどの哺乳類モデルへの過度の依存に一部起因しています。このようなげっ歯類モデルは有益であるが、これらのシステムにおける化学的安全性試験は、高価で時間がかかり、しばしば試験動物に許容できないレベルの苦痛を引き起こす9。
哺乳類の化学物質の安全性試験に関連する財政的および倫理的負担、および哺乳類研究の時間のかかる性質は、新しい化学物質を取り巻くデータの不足の主な要因です。この問題に対処するために、米国環境保護庁(EPA)、欧州化学機関(ECHA)、カナダ保健省、およびその他の機関は、新しいアプローチ方法論(NAM)を規制の枠組みに組み込む措置を実施しています10、したがって、北米とヨーロッパの政策を、動物の使用を置き換え、削減、および改善するという国際的な目標に沿っています(3Rの原則)11。 12、13、14。NAMは、主にin vitroおよびin silicoモデルに基づくさまざまなアッセイを網羅しており、哺乳類の試験種に与えられた逆境を観察する代わりに化学的毒性のメカニズムの理解を提供し、それによって化学的リスク評価のためのデータ生成率を高めながら、忠実度の高い出力を生成します15.しかし、これらの方法は、臓器間コミュニケーションや内分泌シグナル伝達を含む重要な生物学的プロセスの混乱など、全身毒性から保護することがまだ証明されていません。さらに、特定の組織内の化学物質の生物蓄積、個々の化合物が吸収および分泌される能力、および行動と化学物質曝露の間の相互作用を説明することはできません。
in vitroおよび計算モデルの制限により、哺乳類モデルを削減または置き換えるためのNAMの使用を成功させるには、ショウジョウバエ、ショウジョウバエメラノガスターなどの無脊椎動物のin vivoモデルも含める必要があります。ハエの以前の研究は、この生物が有毒分子から動物細胞を保護する保存された遺伝的経路を研究するのに適していることを示しています16、17、18、19、20、21、22。さらに、ハエはヒトと顕著な遺伝的類似性を示しており、ヒトの疾患の65%以上の機能的ホモログ23,24,25や、重要な機能的経路のさらに大きな保存26などがある。これらの特徴は、比較的短いライフサイクル、低いメンテナンスコスト、および容易に観察可能な行動反応と相まって、ショウジョウバエを毒物学的モデルとしての使用に適しています27,28,29,30。さらに、ハエはげっ歯類モデルよりもはるかに高いスループットを持ち、他の非生物NAMでは容易に検出できない代謝、生理学、およびホルモンシグナル伝達への影響を捉えます9。
ここで説明するプロトコルは、成虫ショ ウジョウバエに対する化学物質曝露の影響をテストするためのフレームワークを表しています。この方法は、効率的、安価、再現性があると同時に、研究者が試験化学物質と接触し、メタボロミクスやその他のオミクスアプローチのためのサンプル収集に対応する時間を最小限に抑えるように設計されています。このプロトコルは、実験ごとに単一の化学物質をテストするために最適化されていますが、さまざまな溶媒や化学物質の組み合わせなど、他の実験パラメーターに簡単に対応できます。
Protocol
注意: このプロトコルのすべてのステップでニトリル手袋を着用してください。評価された各化学物質の安全データシートに従って、白衣、目の保護具、および/または呼吸用保護具を着用してください。
1.バイアルおよび湿度チャンバーの準備
注意: 手順1.1〜1.5は、他の実験セクションを開始する前にいつでも完了できます。ニトリル手袋は、汚染を防ぐためにバイアル調製中は常に着用する必要があります。
- グレード1セルロースクロマトグラフィー紙( 材料表を参照)を4枚積み重ね、幅の広いストリップに2つにカットします。花の形のダイを含む1.5インチのペーパーパンチを使用して、花の形のろ紙インサートを打ち抜きます。
- 22 mm x 220 mmのニスを塗っていない木製ダボを使用して、ろ紙を直径28.5 mmのポリプロピレンバイアルの底に押し込みます。ろ紙のスタックがバイアルの底にしっかりと配置されていることを確認します。
- 準備したバイアルをプラスチックまたは段ボールのトレイに保管し、トレイを使用するまで大きな(~280 mm x 240 mm)ビニール袋に入れます。
- 606.24 mm x 225.42 mm x 403.22 mmのプラスチック製浴槽のプラスチック蓋に120 mm x 280 mmの穴を開けて、湿度チャンバーを構築します( 材料表を参照)。空気の流れを可能にするために穴の上にメッシュを接着します。
- ルーバー付きシーリングライトパネル(元々は610 mm x 1220 mm)からプラスチックグリッドの一部を切り取り、手順1.4で使用したプラスチック製の浴槽の底に収まります。
注意: さまざまなプラスチック浴槽とプラスチック/金属グリッド材料を使用して、湿度チャンバーを構築できます。
2.フライ飼育
- 標準的なブルーミントン ショウジョウバエ ストックセンター(BDSC)培地31を含むガラスミルクボトルで成虫のハエ(最低30匹の成虫)の培養を開始します。繊細なタスクワイプで包まれたレーヨンプラグでボトルを閉じます。ボトルを混雑させないでください。
注:必要なボトルの数は、実施されている化学物質への曝露の数と試験株の遺伝子型によって異なります。通常、丈夫で繁殖力のあるストックを使用すると、1本のボトルから数百匹のハエを得ることができます。標準アッセイではOregon-R野生型ハエ(BDSC stock #2057)を使用しますが、このプロトコルでは目的の遺伝子型を使用できます。繁殖力および/または生存率が低い遺伝子型が損なわれると、ボトル培養を増やす必要があることを忘れないでください。 - 培養ボトルのトレイを25°Cで湿度約60%、明暗サイクル12:12でインキュベートし、3匹目の幼虫期または初期の蛹期が観察されます。この段階は、ボトルの側面をさまよう幼虫の存在とボトルの壁に蛹が現れることによって識別できます。
注意: 12:12時間のライト:ダークサイクルのライトオン期間中にのみハエを処理します。堅牢な在庫の場合、ボトルは記載された条件下で3〜4日後にこの段階に達します。- 成虫のハエを取り除き、メディアの流動性を判断します。反転したときにメディアがボトルの側面に沿って流れる場合、メディアは流動性が高すぎます。繊細なタスクワイプまたはレーヨンボールをボトルの底に挿入して、フライフードを固めます。
- ハエが閉じ始めたら、すべての成虫をボトルから取り除き、蛹が48時間閉じ続けるようにします。この時点で、培養ボトルから除去された成虫は、ストックを繁殖させるために新しいボトルに移すか(ステップ2.1を参照)、廃棄することができます。
- 48時間以内に閉じ込められたハエを、標準のBDSC培地を含む新しいボトルに移します。3日間の年齢。
注:これらのボトルの成虫は生後3〜5日で、致死率と摂食実験に使用できます。成虫のハエを老化させるために使用されるボトルには、卵と幼虫が含まれます。その結果、これらのボトルは次世代のハエを繁殖させるために使用することができます。
3.化学物質暴露のためのハエの準備
- 5〜7日齢の麻酔はCO2で飛ぶ。麻酔をかけたハエを性器を使って性別で分類します。ハエの麻酔と性別の支援については、参考文献28を参照してください。
- 20匹のオスまたは20匹のメスのハエのグループを、標準的なBDSC培地を含むバイアルに入れます。レーヨンプラグでバイアルを閉じ、オスバイアルとメスバイアルを別々に保管します。雌のハエを含むバイアルに縞模様の印を付けます。誤って性別が混ざらないように、オスのハエが入ったバイアルにマークを付けないでください。
注:ステップ3.2で調製する必要のあるバイアルの数は、暴露実験のサイズによって決まります。ステップ5.3および5.6で説明したように、単一の試験化学物質の一般的な距離測定実験には、少なくとも40バイアルのオスと40バイアルのメスが必要です。ステップ7.4および7.8で説明されている標準的な用量反応曲線実験には、少なくとも63バイアルの男性と63バイアルの女性が必要です。. - バイアルをインキュベーターに48時間保管し、湿度約60%の25°Cで、12:12時間の明暗サイクルで保管します。この間、麻酔から回復している間、ハエが食べ物に詰まるのを防ぐために、選別されたバイアルのトレイを60°の角度で支えます。
注:このステップにより、ハエはCO2 麻酔から回復することができます。曝露プロトコルの残りの間、ハエを再度麻酔しないでください。 - 48時間の回収期間の後、ステップ1.3で調製したバイアルに0.75 mLの滅菌精製水を追加します。このステップで準備するバイアルの数は、ステップ3.2で設定したバイアルの数と同じである必要があります。
- ステップ3.2のハエを含むガラスバイアルを開き、準備したプラスチックバイアルの口に入れ、プラスチックバイアルの底をベンチトップに軽くたたくことにより、選別された性別一致のハエを飢餓バイアルに移します。セルロースアセテートプラグ(一般にフラッグとして知られている)でプラスチックバイアルを閉じます。
- この転送で失われたハエを記録します(後で各バイアルの開始ハエ数のレコードに転送します)。
- 雌のハエを含む飢餓バイアルを縞模様でマークします。誤って性別が混ざらないように、オスのハエが入ったバイアルにマークを付けないでください。
- 一晩さらすために湿度チャンバーを準備します。このチャンバーの構築方法については、手順1.4〜1.5を参照してください。
- 湿度チャンバーの底に6枚の標準的なペーパータオルを置きます。ペーパータオルを100mLの水に浸します。
- プラスチックグリッド(ステップ1.5)を濡れたタオルの上に置き、バイアルが飽和したペーパータオルに接触しないようにします。
- 飢餓バイアルのトレイを湿度チャンバー内の水平位置に置きます。湿度チャンバーを25°Cのインキュベーター(湿度約60%)に一晩置きます。
注:理想的には、一晩の飢餓期間は約16時間続きます。ただし、タイミングは個々のラボのスケジュールに合わせて調整できます。
4. 原液の調製
注:ハエは、酵母-スクロース液体培地でテスト化学物質を与えられます。このセクションでは、濃縮供給媒体とテスト薬品のストック溶液の調製について説明します。
- 滅菌精製水に溶解した4%スクロースと16%酵母エキス(m / v)を含む6x酵母-スクロース溶液を調製します( 材料の表を参照)。溶液を適切な滅菌時間(例えば、1Lで40分)液体サイクルでオートクレーブする。
注:溶液はバルクで作成し、-20°Cでアリコートで保存できます。 個々のアリコートは、使用の1日前に4°Cの冷蔵庫に入れて解凍します。 - 試験化学物質の在庫を準備します。最初の実験では、化学物質が水に完全に溶解できるように、原液は最高濃度で作られるべきです。
注意: 水以外の溶媒を使用して、試験化学物質を溶解することができます。代替溶媒の使用に関する注意事項に関する説明を参照してください。 - 1 gのFD&C Blue No. 1( 材料表を参照)を10 mLの滅菌精製水に溶解して、100倍の青色色素原液を調製します。
注:青色染料ストック溶液はバルクで作成し、4°Cでアリコートで保存できます。
5.露光バイアルの調製:距離探索実験
注:プロトコルのステップ5および6は、100%の致死性を誘発する試験化学物質の最低用量と、致命的な表現型を誘発できない最高用量を特定するように設計されています。これらの濃度が以前の実験によってすでに決定されている場合は、用量反応曲線を計算するためのステップ7および8を参照してください。露光媒体は、露光バイアルにハエを添加する直前に調製する必要があります。
- 8本の15 mL遠沈管に、(i)化学薬品なし、(ii)最高濃度、(iii)1:2、1:10、1:20、1:100、1:200、および1:1,000のラベルを付けます。
- 最初に2.5 mLの4x酵母/スクロースストック溶液を8つの標識チューブすべてに追加することにより、ステップ5.1の標識遠心チューブで曝露培地を準備します。
- 「化学薬品なし」とラベル付けされたチューブに7.5 mLの滅菌精製水を追加します。この希釈が陰性対照である。
- 7.4 mLの試験薬品原液を「最高濃度」とラベル付けされたチューブに追加します。このチューブに100 μLの滅菌精製水を加えると、最終的な容量は10 mLになります。この溶液中の試験化学物質のモル濃度を計算して記録します。
注:チューブに100μLの滅菌精製水を添加すると、このステップの化学物質濃度は、給餌行動を評価する方法として青色染料ストック溶液を露光媒体に添加するステップ5.5で使用される濃度と同じになります。 - 残りのチューブに適量の試験薬品原液と滅菌精製水を加えます。各チューブの最終容量は10mLでなければなりません。「最高濃度」チューブに対するこれらのチューブ内の試験化学物質の最終濃度は、1:2、1:10、1:20、1:100、1:200、および1:1,000である必要があります。
- ステップ5.1で生成された露光媒体の個々の濃度ごとに8つの露光バイアルを準備し、ラベルを付けます。次のラベルを含む8セットのバイアル(合計64バイアル)が必要です:化学物質なし、最高濃度、1:2、1:10、1:20、1:100、および1:1,000。
- ステップ5.2.3で調製した0.75mLの露光媒体を対応する曝露バイアルのセットにピペットで入れます。
- 8本の5 mL個別チューブに、(i)化学薬品なし、(ii)最高濃度、(iii)1:2、1:10、1:20、1:100、1:200、および1:1,000のラベルを付けます。
- 最初に500 μLの4x酵母/スクロースストック溶液と20 μLの青色染料ストック溶液を8本の標識5 mLチューブで混合することにより、青色色素露光培地を調製します。
- 1.48 mLの滅菌精製水を「化学薬品なし」とラベル付けされたチューブに追加します。この希釈が陰性対照である。
- 1.48 mLの試験薬品原液を「最高濃度」とラベル付けされたチューブに追加します。このチューブには水は追加されていません。この溶液中の試験化学物質のモル濃度を計算して記録します。
- 残りのチューブに適量の試験薬品原液と滅菌精製水を加えます。各チューブの最終容量は2 mlです。「最高濃度」チューブに対するこれらのチューブ内の試験化学物質の最終濃度は、1:2、1:10、1:20、1:100、1:200、および1:1,000である必要があります。
- 2つの露光バイアルを準備し、青色露光媒体の個々の濃度でラベル付けします。次のラベルを含む8セットのバイアル(合計16バイアル)が必要です:化学物質なし、最高濃度、1:2、1:10、1:20、1:200、および1:1,000。「青」という言葉もこれらのバイアルに書かれるべきです。
- 0.75 mLの青色露光媒体を対応する青色露光バイアルのセットにピペットで入れます。
6.フライ化学物質への暴露:距離探索実験
- 次のように、ステップ3.7の一晩飢えたハエのバイアルを使用して化学物質暴露バイアルを準備します。
- 飢えた雌のハエの4つのバイアル(バイアルあたり20匹のハエ)を各化学濃度の4つの曝露バイアルに移します。これらのバイアルに「女性」というラベルを付けます。手順 3.5 で説明したのと同じ転送方法を使用します。
- 飢えたオスのハエの4つのバイアル(バイアルあたり20匹のハエ)を各化学濃度の4つの曝露バイアルに移します。これらのバイアルに「男性」というラベルを付けます。手順 3.5 で説明したのと同じ転送方法を使用します。
- 次のように、ステップ3.7の一晩飢えたハエのバイアルを使用して、青色染料を含む化学物質暴露バイアルを準備します。
- 飢えた雌のハエのバイアル1本(バイアルあたり20匹のハエ)を、化学物質濃度ごとに1本の青色暴露バイアルに移します。このバイアルに「女性」というラベルを付けます。手順 3.5 で説明したのと同じ転送方法を使用します。
- 飢えたオスのハエのバイアル1本(バイアルあたり20匹のハエ)を、化学物質濃度ごとに1つの青色暴露バイアルに移します。このバイアルに「男性」というラベルを付けます。手順 3.5 で説明したのと同じ転送方法を使用します。
- 転送後に各バイアルに存在するハエの数を記録し、死亡または脱出した数をメモします。通常、20匹のハエはすべて一晩の飢餓と移動を生き残るはずです。
- 露出バイアルを新たに準備した湿度チャンバーに水平に置きます(湿度チャンバーの準備については、手順3.6を参照)。チャンバーを湿度約60%、明暗サイクル12:12の25°Cのインキュベーターに入れます。
- 化学物質暴露の開始後24時間および48時間に暴露バイアルを調べます。各時点で各バイアル内の死んだハエの数を数えて記録します。
注:このアッセイの読み出しとして死が使用されますが、プロトコルは他の表現型を調べるように適合させることができます。暴露されたハエは、トランスクリプトームおよびメタボローム研究のためにこれらの時点で一般的に収集されます。 - 化学暴露開始後24時間で青色暴露バイアルを調べます。次の手法を使用して、曝露されたハエが青色の露光媒体を消費したかどうかを判断します。
- バイアルの壁を調べて、暴露バイアルの側面とフラッグに小さな点として現れる青い糞の兆候がないか調べます。
- ハエをCO2 で麻酔し、腹部に青い染料が存在するかどうかを調べます。
注:通常、青色露光バイアルは24時間後に分析されます。ただし、この手順は代わりに48時間で実行できます。通常食べたハエは腹部に青い縞模様があり、曝露媒体が腸に入ったことを示しています。 - 逆流、作物の膨張、腸のバリア機能の崩壊などの異常な摂食行動についてハエを調べます(一般にスマーフィングと呼ばれる消化管だけでなく、生物全体に青い染料が現れることによって示されます32,33)。
- 汚染されたすべてのバイアル、ろ紙、フラッグ、およびハエは、適切な化学廃棄物容器に廃棄します。生きたハエがバイアルに残っている場合は、適切な廃棄物容器に捨てる前に、バイアルを凍結してハエを殺します。
注:暴露バイアルとハエの廃棄は、実験で分析される化学物質によって決まります。化学物質安全データシートに記載されている化学物質安全手順に常に従ってください。距離探索実験で使用された濃度が最低用量でハエを殺す場合は、100%の動物を殺した最低濃度から始めて、希釈シリーズを使用してセクション6を繰り返します。
7.曝露バイアルの調製:用量反応曲線の生成
注:ステップ5および6で概説されているプロトコルは、表現型を引き出すために必要な化学物質濃度を広く決定するように設計されています。プロトコルのステップ7および8は、正確な用量反応曲線を計算するために使用される。
- 次の方法を使用して、線量反応曲線を生成するために分析する必要があるテスト化学物質濃度を計算します。
- 48時間で暴露されたハエの100%を殺す試験化学物質の最低濃度を決定します。
- 48時間で生存率に影響を与えない試験化学物質の最高濃度を決定します。
- ステップ7.1.1と7.1.2で決定された濃度の間で均等に分布する追加の4つの濃度を計算します。
- 9本の個別の15 mL遠沈管に、(i)化学物質なし、(ii)ステップ7.1.1で決定された濃度、(iii)ステップ7.1.2で決定された濃度、(iv)7.1.3で決定された濃度、(v)ステップ7.1.1で決定された濃度の2倍、(vi)ステップ7.1.2で決定された濃度の1:2希釈。
注:7.1.1で決定された濃度の2倍の濃度と、ステップ7.1.2で決定された濃度の1:2希釈を含めることは、用量反応曲線を正確に計算するために重要です。. - まず、ステップ7.2で調製した9本の標識個体15 mL遠沈管に2.5 mLの4x酵母/スクロースストック溶液を加えて露光培地を調製します。
- 「化学薬品なし」とラベル付けされたチューブに7.5 mLの滅菌精製水を追加します。この希釈が陰性対照である。
- 残りのチューブに適量の試験薬品原液と滅菌精製水を加えます。各チューブの最終容量は10mLでなければなりません。個々のチューブ内の化学物質の最終濃度は、チューブの外側に書かれている濃度と同じである必要があります。
- ステップ7.2で生成された露光媒体の濃度ごとに12本の露光バイアルを準備し、ラベルを付けます。9セットのバイアル(合計108バイアル)が必要です。
- 0.75 mLの露光媒体を対応する露光バイアルのセットにピペットで入れます。
メモ: 手順 7.6 から 7.8 はオプションです。ステップ7.2で準備された試験化学物質濃度が摂食行動に影響しないことがわかっている場合は、これらのステップをスキップできます。 - ステップ7.2で使用したのと同じ一連の濃度の青色露光媒体用に9つの異なる5 mLチューブを準備してラベルを付けます。
- 最初に500 μLの4x酵母/スクロースストック溶液と20 μLの青色染料ストック溶液を混合して、青色色素露光媒体を調製します。
- 1.48 mLの精製滅菌水を「化学薬品なし」とラベル付けされたチューブに追加します。この希釈が陰性対照である。
- 残りのチューブに適量の試験薬品原液と精製滅菌水を加えます。各チューブの最終容量は2mLでなければなりません。個々のチューブ内の化学物質の最終濃度は、チューブの外側に書かれている濃度と同じである必要があります。
- 青色露光媒体の個々の濃度ごとに2つの露光バイアルを準備し、ラベルを付けます。9セットのバイアル(合計18バイアル)があり、バイアルの各セットにはステップ7.2にリストされている濃度でラベル付けされている必要があります。「青」という言葉もこれらのバイアルに書かれるべきです。
- 0.75 mLの青色露光媒体を対応する青色露光バイアルのセットにピペットで入れます。
8.フライ化学物質曝露:線量反応曲線の生成
- 次のように、ステップ3.7の一晩飢えたハエのバイアルを使用して化学物質暴露バイアルを準備します。
- 飢えた雌のハエの6つのバイアル(バイアルあたり20匹のハエ)を各化学濃度の6つの曝露バイアルに移します。これらのバイアルに「女性」というラベルを付けます。手順 3.5 で説明したのと同じ転送方法を使用します。
- 飢えたオスのハエの6つのバイアル(バイアルあたり20匹のハエ)を各化学濃度の6つの曝露バイアルに移します。これらのバイアルに「男性」というラベルを付けます。手順 3.5 で説明したのと同じ転送方法を使用します。
- 次のように、ステップ3.7の一晩飢えたハエのバイアルを使用して、青色染料を含む化学物質暴露バイアルを準備します。
- 飢えた雌のハエのバイアル1本(バイアルあたり20匹のハエ)を、化学物質濃度ごとに1本の青色暴露バイアルに移します。このバイアルに「女性」というラベルを付けます。手順 3.5 で説明したのと同じ転送方法を使用します。
- 飢えたオスのハエのバイアル1本(バイアルあたり20匹のハエ)を、化学物質濃度ごとに1つの青色暴露バイアルに移します。このバイアルに「男性」というラベルを付けます。手順 3.5 で説明したのと同じ転送方法を使用します。
- 転送後に各バイアルに存在するハエの数を記録します。通常、20匹のハエはすべて一晩の飢餓と移動を生き残る必要がありますが、移動中に死亡または脱出したものが合計から差し引かれるようにします。
- 露出バイアルを新たに準備した湿度チャンバーに水平に置きます(湿度チャンバーの準備については、手順3.6を参照)。チャンバーを湿度約60%、明暗サイクル12:12の25°Cのインキュベーターに入れます。
- 化学物質暴露の開始後24時間および48時間に暴露バイアルを調べます。各時点で各バイアル内の死んだハエの数を数えて記録します。
- 化学暴露開始後24時間で青色暴露バイアルを調べます。ステップ6.6で概説した方法を使用して、摂食行動の変化を評価します。
- 汚染されたすべてのバイアル、ろ紙、フラッグ、およびハエは、適切な化学廃棄物容器に廃棄します。生きたハエがバイアルに残っている場合は、適切な廃棄物容器に廃棄する前に、バイアルを凍結してハエを殺します。
注:暴露バイアルとハエの廃棄は、実験で分析される化学物質によって決まります。化学物質安全データシートに記載されている化学物質安全手順に常に従ってください。
9.用量反応曲線の計算
- ベンチマーク線量ソフトウェア(BMDS、バージョン3.2; 材料表を参照)または他の同様のソフトウェアを使用して、データを分析します34。以下では、BMDSソフトウェアを使用したワークフローについて説明します。
- BMDS の「データ」 タブ をクリックし、「 新規データ・セットの挿入」をクリックします。データセット内のサンプル数を入力し、[ 二分] をクリックして、[ データセットの作成] をクリックします。各レプリケートをデータセット内の個別の行として入力します。
- 生成された表の最初の列に線量を入力し、2番目の列にステップ8.3)の前に死亡または失われたハエを除いた開始ハエの数を、3番目の列に化学物質曝露によって死亡したハエの数を入力します。
- BMDSの メインタブ をクリックします。
- [モデルタイプの選択]メニューの ドロップダウン矢印 をクリックし、[ 二分]をクリックします。
- データセットテーブルのステップ 9.2 のデータセットの 有効化 をクリックします。
- MLE および代替案の表で、解析 に使用するモデルのボックス をクリックします。
注:頻度主義制限二分丘モデルが主に使用されました。 - [ 分析の実行] をクリックします。プログラムは、致死率曲線とモデルに関する追加の詳細を含む出力ファイルを生成します。
Representative Results
ハエは長い間、亜ヒ酸ナトリウム(NaAsO2)の毒性を測定するための研究のモデルとして役立ってきました35,36,37,38。プロトコルの有効性を実証するために、これらの結果を以前の研究と比較することを目的として、オスおよびメスのハエをNaAsO2に曝露した。 上記の方法論を用いて、成人オレゴン-R(BDSCストック#2057)の雄および雌を、ある範囲のNaAsO2濃度(0、0.01、0.02、0.1、0.2、1、および2mM)に曝露し、曝露開始後48時間で致死率をスコア化した(図1A、B)。
この初期分析の目的は、NaAsO2毒性のより正確な特徴付けを可能にする濃度のおおよその範囲を特定することであった。その後の実験において、NaAsO 2用量反応曲線をより正確に定義する濃度(0、0.2、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、および5mM)を選択した(図1C、D)。結果として得られた分析は、100%の致死性を誘発するいくつかの濃度を調べたことに注意してください。データは、環境保護庁の公開されているベンチマーク線量ソフトウェアバージョン3.2.0.125を使用して分析されました。データは「二分」としてモデル化され、二分ヒルモデルはその後の分析に使用されました。このモデルに基づいて、NaAsO2を給餌したオスのハエの最終的なLD10、LD25、およびLD50は、それぞれ0.30 mM、0.50 mM、および0.65 mMでした。メスのハエの場合、これらの値はわずかに高く、LD10は0.30 mM、LD25は0.65 mM、LD50は0.90 mMでした。全体として、この方法を使用して得られた値は、ショウジョウバエメラノガスター35,36,37,38におけるヒ素毒性について以前に報告されたものと同様であり、したがって方法論を検証します。
線量反応曲線の計算に用いた6回の反復に加えて、オスとメスのハエには、光学顕微鏡を使用して消化管で容易に見える1%FD&Cブルーを含むNaAsO2曝露溶液も与えられました。NaAsO 2を給餌したハエの腸内の青色色素の存在に基づいて、液体培地中に存在するNaAsO 2濃度に関係なく、オスとメスの両方のハエが化学物質曝露の開始後24時間摂食し続けました(図2)。 しかし、摂取した食物は、女性で0.2 mM、男性で0.5 mMを超える用量で時折逆流することが観察されました(図2)。これらの知見は、逆流がショウジョウバエのヒ素中毒に対する反応に重要な役割を果たす可能性があることを示唆している。
図1:NaAsO2で48時間処理した雄と雌のショウジョウバエの用量反応曲線。 全てのグラフは、二分ヒルモデルに基づいて試験された各NaAsO2濃度におけるハエの死骸の推定割合を示す。(A,B)広範囲のNaAsO2濃度を試験して、ハエの各雌雄が死に始める線量を概算した。(A)は男性のデータ、(B)は女性のデータを示す。N = 4バイアル、バイアルあたり20匹のハエ。(C,D)より狭い範囲のNaAsO2濃度を試験して、ハエの各性別の10%、25%、および50%が死亡した正確な用量を決定した。これらの線量は、各グラフの右側に示されています。(C)は男性のデータ、(D)は女性のデータを示す。N = 6バイアル、バイアルあたり20匹のハエ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:NaAsO2で24時間処理した雄および雌ショウジョウバエの青色色素アッセイの代表的な結果。顕微鏡写真は、NaAsO2の濃度が増加しているハエを示しています。行(A)は雄のハエ、行(B)は雌のハエを示し、NaAsO2の濃度は左から右に増加している。腹部は低濃度で胸部の近くに少量の青色を示し、曝露媒体が腸に入ったことを示しています。濃度が高いと、青色染料が口の周りに蓄積し始め、露光媒体が逆流していることを示唆しています。スケールバーは1mmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
ショウジョウバエメラノガスターは、NAMの強力なシステムとして浮上しています16,18,19,21。ハエコミュニティが利用できる比類のない遺伝資源を活用し、ゲノミクスとメタボロミクスの最近の進歩と組み合わせることにより、ショウジョウバエを使用した化学的安全性研究は、個々の化合物が代謝、生理学、および細胞シグナル伝達を妨害する分子メカニズムを迅速に特定することができます(たとえば、39を参照)。).この安価なプロトコルは、用量反応曲線を迅速に定義し、その後RNA-seqおよびメタボロミクス分析用のサンプルを生成するように設計されています。さらに、この柔軟なプロトコルは、あらゆる遺伝子型での使用に適合させることができ、多くのクラスの化学物質に対応することができます。
このプロトコルの注目すべき側面は、化学物質曝露に使用される液体食品の選択であり、これは以前の研究に基づいていますが、ショウジョウバエ18,22のほとんどの毒物学的研究で使用される固体培地とは異なります。この特定の液体培地は、ハエが一貫した栄養を確実に受けられるように、このプロトコルでハエも給餌される標準的な固体BDSC培地の栄養含有量を反映するように選択されました。液体供給媒体の単純さには多くの利点があります。液体媒体は、溶融して再固化するか、粉末から再構成する必要がある固形食品よりも取り扱いが簡単です。液体媒体はまた、システムのスループットを向上させ、供給媒体全体に化学物質を均一に分配し、危険な化合物の取り扱いに費やす時間を短縮します。さらに、媒体は溶液を加熱する必要がないため、揮発性試験化合物の試験が容易になります。最後に、食品溶液に含まれる成分が比較的少ないため、試験化学物質と他の食事成分との間の望ましくない副反応が最小限に抑えられます。食品に使用される酵母も不活性であり、摂食培地の反応性をさらに制限します。ただし、この方法は発生毒性や幼虫毒性の試験には適していないことに注意してください。
プロトコルで使用される材料の一部は、ポリプロピレンではなくガラスフライバイアルを使用するなど、代替することができます。ただし、使用される材料は、試薬間の不要な化学反応やガラス製品の洗浄に起因する可能性のある化学物質への暴露を回避するために、不活性で使い捨ての両方になるように選択されました。
液体食品の使用は、食品配達のための車両を必要とする。セルロースアセテート濾紙は、その柔軟性および不活性な性質のためにこの目的のために選択された28。他の研究者も同様のプロトコルを使用しましたが、繊細なタスクワイプやグラスファイバーフィルターなどの他の車両を使用しました29,30。セルロースアセテート濾紙は、紙とバイアルの壁の間に大きな隙間なくフライバイアルの底に収まる理想的な形状に切断できる不活性ビヒクルであり、ハエが媒体や車両自体に詰まることによる死亡を防ぐため、これらのニーズに適合しました。
このシステムの重要な制限は、化学物質の最大試験可能濃度が化学物質の溶解度に結びついていることです。非水溶性化合物は追加の溶媒を必要とし、これは目的の化学物質とのさらなるまたは相乗効果をもたらし得る。これはまた、全ての生物において所望のエンドポイントを達成するのに十分濃縮されたストック溶液を調製することができない状況を作り出すことができ、したがって、結果として得られるデータ31の分析を制限する。これに対処するために、水溶性の低い化学物質は、食品溶液に最大0.5%のジメチルスルホキシドを添加することによってテストできます。他の溶媒も使用できますが、生物への溶媒の影響を最小限に抑えながら溶解度を最大化するために、溶液内の最大許容溶媒濃度を決定するには、関心のある各溶媒について追加の研究が必要です。
ショウジョウバエの嗅覚応答の広範な特徴付けは、ハエが有毒な化合物40,41の消費をどのように回避し、処理された培地への摂食の減少につながるかを説明しています。青色色素アッセイは、研究者が実験化学物質42,43,44の各濃度を与えられたハエの摂食行動を効率的にスクリーニングできるようにすることで、この現象に対処します。ハエの胃腸管の青の有無は、ハエが毒物含有培地を食べていたかどうかを示します。ハエの摂食行動を評価するためのより洗練された方法、例えば、フライ液体食品相互作用カウンター45が存在するが、この定性的方法は、よりハイスループットのスクリーニングにより適している。
このプロトコルの注目すべき側面は、ハエを移したり、露光バイアルに液体を追加したりすることなく、48時間の曝露期間に最適化されていることです。湿度チャンバーを使用し、チャンバーを高湿度に保たれたインキュベーターに置くことで、この期間中に供給媒体を含むろ紙が乾燥するのを防ぎました。プロトコルはより長い暴露時間に適応させることができますが、ろ紙が乾燥して溶液濃度の大幅な変化や乾燥による致死性を引き起こさないように方法を調整する必要があります。
最後に、このプロトコルの重要な特徴は、遺伝的変異に容易に対応できることであり、研究者は ショウジョウバエ の膨大な数の遺伝ツールを利用して、野生型生物に関するこれらの予備研究を拡大し、 in vivoでの化学的作用のメカニズムをよりよく理解することができます。これに関して、上記で概説したプロトコルは、野生のハエの毒物学的分析を可能にするPetersonおよびLongによる前述のJoVEプロトコルを補完するように容易に変更することができる18。
ショウジョウバエ32,33,34,35,36における亜ヒ酸ナトリウムの毒性に関するさまざまな先行研究のため、オレゴンRハエはこの化合物で処理され、システムの有効性が実証されました。オスのハエは0.65 mMのLD50を示し、メスは0.90 mMのLD50を示しました。これは、亜ヒ酸ナトリウムで処理された成体ショウジョウバエの以前の研究と一致しています。例えば、GoldsteinとBabich37は、ハエ(男女混合)の50%が0.5mM NaAsO2に7日間曝露した後に死亡したことを発見した。これは現在観察されているよりもわずかに低い線量ですが、それらの方法とこの方法の違い(固体曝露媒体の使用、より長い時間スケール、および男女混合を含む)がこの違いを説明している可能性があります。重要なことに、両方の方法が全体的に類似したLD50値をもたらした。
このプロトコルを使用した実験からの観察は、その後の行動的または機構的研究のための遺伝的および分子的標的を見つけるために使用することができる。曝露法は、メタボロミクスおよびプロテオミクスのサンプリングのために ショウジョウバエ を治療するためにも使用でき、このプロトコルは、精密毒物学の成長分野(精密医療分野46からモデル化)に適しています。これに関して、曝露されたハエは、その後のゲノムおよびメタボロミクス分析のためにステップ8の後に収集され得る。ステップ8で収集されたサンプルは、ステップ3から始めて、LiおよびTennessen47によって説明されるように、次いで処理され得る。
最終的に、上記の実験から得られたデータ、ならびにその後のメタボロミクスおよびプロテオミクスデータは、理想的には種間の比較に使用されるでしょう。前述のように26、そのような種間研究は強力であり、個々の化学物質が保存された生物学的経路をどのように妨害するかを決定することができます。したがって、上記のプロトコルは、門全体の個々の毒物に応答する進化的共通点を見つけ、化学的安全規制に情報を提供するために使用できます。
Disclosures
開示する利益相反はありません。
Acknowledgments
このプロトコルのテストと最適化に協力してくれたスタッフに感謝します:アメヤ・ベラムカー、マリリン・クラーク、アレクサンダー・フィット、エマ・ローズ・ギャラント、イーサン・ゴールディッチ、マシュー・ロウ、モーガン・マーシュ、カイル・マクラン、アンディ・プーガ、ダーシー・ローズ、キャメロン・ストックブリッジ、ノエル・ゾルマン。また、精密毒性グループの同僚、特に曝露グループのカウンターパートがプロトコルの目標の特定を支援してくれたことに感謝します。
このプロジェクトは、欧州連合のHorizon 2020研究およびイノベーションプログラムから、助成金契約第965406号に基づいて資金提供を受けました。このマニュアルで紹介する作業は、ASPIS クラスタの一部として実行されました。この出力は著者の見解のみを反映しており、欧州連合はそこに含まれる情報の使用について責任を負いません。この出版物は、国立衛生研究所、国立トランスレーショナルサイエンス推進センター、臨床およびトランスレーショナルサイエンス賞からの賞番号UL1TR002529によって部分的に資金提供されているインディアナ臨床およびトランスレーショナルサイエンス研究所の支援によっても可能になりました。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。このプロジェクトの一部は、JRSとPhyloToxコンソーシアムに授与されたインディアナ大学からの資金によって支援されました。JMHとEMPは、ブルーミントンショウジョウバエストックセンターへのNIH賞P40OD018537によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 inch flower lever action craft punch | Bira Craft | HCP-115-024 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | VWR | 89039-666 | High-Performance Centrifuge Tubes with Flat or Plug Caps, Polypropylene, 15 mL |
| 2 ml Tubes | VWR | 16466-044 | Micro Centrifuge Tube with Flat Screw-Cap, conical bottom |
| 5 ml Tubes | VWR | 60818-576 | Culture Tubes, Plastic, with Dual-Position Caps |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430290 | 50 mL polypropylene centrifuge tubes, conical bottom with plug seal cap |
| Benchmark Dose Software version 3.2 | U.S. Environmental Protection Agency | ||
| Cardboard trays | Genesee Scientific flystuff | 32-122 | trays and dividers for narrow vials |
| CO2 gas pads | Genesee Scientific flystuff | 59-114 | FlyStuff flypad, CO2 anesthetizing apparatus |
| Combitips advanced, 50 mL | Eppendorf | 0030089693 | Combitips advanced, Biopur, 50 mL, light gray, colorless tips |
| Cotton balls | Genesee Scientific flystuff | 51-101 | Cotton balls, large, fits narrow vials |
| Delicate task wipes | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes, 1 Ply / 8.2" x 4.39" |
| Drosophila Vial Plugs, Cellulose Acetate (aka, Flugs) | VWR | 89168-888 | Wide |
| FD&C Blue No. 1 | Spectrum Chemical | FD110 | CAS number 3844-45-9 |
| Flies | BDSC | Stock #2057 | OregonR wildtype |
| Gloves (nitrile) | Kimtech | 55082/55081/55083 | Kimtech purple nitrile exam gloves, 5.9 mil, ambidextrous 9.5" |
| Grade 1 CHR cellulose chromatography paper | Cytvia | 3001-917 | Sheet, 46 x 57 cm |
| Mesh for humidity chamber | |||
| Multipette / Repeater (X) stream | Eppendorf | 022460811 | Repeater Xstream |
| Plastic grate | Plaskolite | 18469 (from lowes) | Plaskolite 24 in x 48 in 7.85 sq ft louvered ceiling light panels, cut down to fit in rubbermaid tubs |
| Plastic trays for glass vials | Genesee Scientific flystuff | 59-207 | Narrow fly vial reload tray |
| Polypropylene Drosophila Vial | VWR | 75813-156 | Wide (28.5 mm) |
| Rubbermaid tubs | Rubbermaid | 3769017 (from Lowes) | Rubbermaid Roughneck Tote 10 gallon 18" L x 12" W x 8 1/2" H |
| Sucrose ultra pure | MP Biomedicals, Inc. | 821721 | |
| Tube racks for wide-mouthed tubes | Thermo scientific | 5970-0230 | Nalgene Unwire Test tube racks, for 30 mm tubes |
| Water Purification System | Millipore Milli-Q | ZMQ560F01 | Millipore Milli-Q Biocel Water Purifier |
| Yeast extract | Acros Organics | 451120050 | CAS number 84604-16-0 |
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