Summary
Dit protocol beschrijft een efficiënte en goedkope methode die vloeibare media gebruikt om de effecten van chemische toxische stoffen op de levensvatbaarheid van volwassen Drosophila melanogaster te beoordelen.
Abstract
Menselijke industrieën genereren honderdduizenden chemicaliën, waarvan vele niet voldoende zijn bestudeerd voor milieuveiligheid of effecten op de menselijke gezondheid. Dit tekort aan chemische veiligheidsinformatie wordt verergerd door de huidige testmethoden bij zoogdieren die duur, arbeidsintensief en tijdrovend zijn. Onlangs hebben wetenschappers en regelgevers gewerkt aan de ontwikkeling van nieuwe benaderingsmethoden (NAM's) voor chemische veiligheidstests die goedkoper en sneller zijn en dierenleed verminderen. Een van de belangrijkste NAMs die naar voren komen, is het gebruik van ongewervelde organismen als vervanging voor zoogdiermodellen om geconserveerde chemische werkingsmechanismen op te helderen voor ver verwante soorten, waaronder mensen. Om deze inspanningen te bevorderen, beschrijven we hier een methode die de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, gebruikt om de chemische veiligheid te beoordelen. Het protocol beschrijft een eenvoudige, snelle en goedkope procedure om de levensvatbaarheid en het voedingsgedrag van blootgestelde volwassen vliegen te meten. Bovendien kan het protocol eenvoudig worden aangepast om monsters te genereren voor genomische en metabolomische benaderingen. Over het algemeen betekent het protocol een belangrijke stap voorwaarts in het vaststellen van Drosophila als een standaardmodel voor gebruik in precisietoxicologie.
Introduction
Mensen worden voortdurend blootgesteld aan chemicaliën uit verschillende bronnen, waaronder lucht1, voedsel2, water3,4, medicijnen5, reinigingsmiddelen6, producten voor persoonlijke verzorging 7, industriële chemicaliën 7 en bouwmaterialen 7. Bovendien worden er elk jaar duizenden nieuwe chemicaliën geïntroduceerd8, waarvan er vele niet goed worden doorgelicht op gezondheids- en milieuveiligheid. Dit gebrek aan adequate chemische veiligheidstests komt deels voort uit een te grote afhankelijkheid van zoogdiermodellen, zoals muizen en ratten. Hoewel dergelijke knaagdiermodellen informatief zijn, zijn chemische veiligheidstests in deze systemen duur, tijdrovend en veroorzaken ze vaak onaanvaardbare niveaus van lijden voor het proefdier9.
De financiële en ethische lasten die gepaard gaan met het testen van de chemische veiligheid van zoogdieren, evenals de tijdrovende aard van zoogdierstudies, zijn belangrijke factoren die bijdragen aan het gebrek aan gegevens over nieuwe chemicaliën. Om dit probleem aan te pakken, implementeren het Amerikaanse Environmental Protection Agency (EPA), het Europees Agentschap voor chemische stoffen (ECHA), Health Canada en andere agentschappen maatregelen die nieuwe aanpakmethoden (NAM's) opnemen in regelgevingskaders10, waardoor het Noord-Amerikaanse en Europese beleid in overeenstemming wordt gebracht met internationale doelstellingen om het gebruik van dieren te vervangen, te verminderen en te verfijnen (het 3V-principe)11, 12,13,14. NAMs omvatten een verscheidenheid aan assays, voornamelijk gebaseerd op in vitro en in silico-modellen die een mechanistisch begrip van chemische toxiciteit bieden in plaats van het observeren van tegenspoed toegebracht aan zoogdiertestsoorten, waardoor de snelheid van het genereren van gegevens voor chemische risicobeoordeling wordt verhoogd terwijl nog steeds high-fidelity outputs worden geproduceerd15. Het is echter nog niet bewezen dat deze methoden bescherming bieden tegen systemische toxiciteit, met inbegrip van de verstoring van vitale biologische processen waarbij interorganische communicatie en endocriene signalering betrokken zijn. Verder kunnen ze geen rekening houden met de bioaccumulatie van chemicaliën in specifieke weefsels, het vermogen van individuele verbindingen om te worden geabsorbeerd en uitgescheiden, en de wisselwerking tussen gedrag en chemische blootstelling.
Vanwege de beperkingen van in vitro en computationele modellen, moet het succesvolle gebruik van NAMs om zoogdiermodellen te verminderen of te vervangen ook ongewervelde in vivo modellen omvatten, zoals de fruitvlieg, Drosophila melanogaster. Eerdere studies in de vlieg hebben aangetoond dat dit organisme zeer geschikt is voor het bestuderen van de geconserveerde genetische routes die dierlijke cellen beschermen tegen toxische moleculen 16,17,18,19,20,21,22. Bovendien vertoont de vlieg opmerkelijke genetische gelijkenis met mensen, waaronder functionele homologen met meer dan 65% van de menselijke ziekten 23,24,25 en een nog groter behoud van belangrijke functionele routes 26. Deze kenmerken, gecombineerd met hun relatief korte levenscyclus, lage onderhoudskosten en gemakkelijk waarneembare gedragsreacties, maken Drosophila zeer geschikt voor gebruik als een toxicologisch model27,28,29,30. Bovendien hebben vliegen een veel hogere doorvoer dan knaagdiermodellen en vangen ze effecten op het metabolisme, de fysiologie en hormoonsignalering die niet gemakkelijk kunnen worden gedetecteerd door andere niet-organismale NAMs9.
Het hier beschreven protocol vormt een kader voor het testen van de effecten van chemische blootstelling op volwassen Drosophila. De methode is ontworpen om efficiënt, goedkoop en reproduceerbaar te zijn, terwijl ook de tijd dat onderzoekers in contact moeten komen met de teststof wordt geminimaliseerd en de monsterverzameling voor metabolomica en andere omics-benaderingen wordt geminimaliseerd. Het protocol is geoptimaliseerd voor het testen van een enkele chemische stof per experiment, maar kan gemakkelijk andere experimentele parameters bevatten, zoals verschillende oplosmiddelen of combinaties van chemicaliën.
Protocol
OPMERKING: Draag nitrilhandschoenen voor alle stappen in dit protocol. Draag een laboratoriumjas, oogbescherming en/of gasmaskers, volgens de veiligheidsinformatiebladen voor elke geëvalueerde chemische stof.
1. Voorbereiding van de injectieflacon en de vochtigheidskamer
OPMERKING: Stap 1.1-1.5 kan op elk moment worden voltooid voordat met de andere experimentele secties wordt begonnen. Nitrilhandschoenen moeten te allen tijde worden gedragen tijdens het bereiden van de injectieflacon om besmetting te voorkomen.
- Stapel vier vellen cellulosechromatografiepapier van klasse 1 (zie materiaaltabel) en snijd ze in 2 in brede stroken. Pons bloemvormige filterpapierinzetstukken uit met behulp van een 1,5 in papierpons met een bloemvormige matrijs.
- Gebruik een ongelakte houten deuvel van 22 mm x 220 mm om het filtreerpapier naar de bodem van een polypropyleen injectieflacon met een diameter van 28,5 mm te duwen. Controleer of de stapel filtreerpapier zich stevig aan de onderkant van de injectieflacon bevindt.
- Bewaar de voorbereide injectieflacons in plastic of kartonnen trays en plaats de trays in grote (~ 280 mm x 240 mm) plastic zakken tot gebruik.
- Bouw een vochtigheidskamer door een gat van 120 mm x 280 mm in het plastic deksel van een plastic kuip van 606,24 mm x 225,42 mm x 403,22 mm te snijden (zie materiaaltabel). Lijm gaas over het gat om luchtstroom mogelijk te maken.
- Knip een deel van het kunststof rooster uit lamellen plafondlamppanelen (oorspronkelijk 610 mm x 1220 mm) om in de bodem van de kunststof kuip te passen die in stap 1.4 wordt gebruikt.
OPMERKING: Een verscheidenheid aan verschillende plastic kuipen en plastic / metalen roostermaterialen kan worden gebruikt om een vochtigheidskamer te bouwen.
2. Vliegveehouderij
- Start kweken van volwassen vliegen (minimaal 30 volwassenen) in glazen melkflessen met standaard Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) media31. Sluit de flessen met een rayonplug gewikkeld in een delicaat taakdoekje. Verdringen de flessen niet.
OPMERKING: Het aantal benodigde flessen is afhankelijk van het aantal chemische blootstellingen dat wordt uitgevoerd en het genotype van de teststam. Normaal gesproken kunnen enkele honderden vliegen uit een enkele fles worden verkregen bij gebruik van robuuste en vruchtbare voorraden. De standaardtest maakt gebruik van Oregon-R wild-type vliegen (BDSC stock # 2057), maar elk genotype (en) van belang kan met dit protocol worden gebruikt. Vergeet niet dat gecompromitteerde genotypen met een lage vruchtbaarheid en / of levensvatbaarheid verhoogde flesculturen vereisen. - Incubeer de trays met kweekflessen bij 25 °C met ongeveer 60% vochtigheid en een licht:donkercyclus van 12:12 uur totdat de derde larvale instar of vroege popstadia worden waargenomen. Dit stadium is te herkennen aan de aanwezigheid van larven die langs de zijkanten van de fles ronddwalen en het verschijnen van poppen op fleswanden.
OPMERKING: Behandel vliegen alleen tijdens de licht-aan-periode van de 12:12 uur licht:donker cyclus. Voor robuuste voorraden bereiken flessen dit stadium na 3-4 dagen onder de beschreven omstandigheden.- Verwijder volwassen vliegen en bepaal de liquiditeit van de media. Als het medium langs de zijkant van de fles stroomt wanneer het wordt omgekeerd, is het medium te vloeibaar. Steek een delicaat taakdoekje of een rayonbal in de bodem van de fles om het vliegvoer te stollen.
- Wanneer de vliegen beginnen te omsluiten, verwijder dan alle volwassenen uit de flessen en laat poppen 48 uur lang blijven omsluiten. Op dit punt kunnen alle volwassenen die uit de kweekflessen worden gehaald, worden overgezet naar nieuwe flessen om de voorraden te vermeerderen (zie stap 2.1) of worden weggegooid.
- Breng vliegen die in de periode van 48 uur omsluiten over op nieuwe flessen met standaard BDSC-media. Leeftijd voor 3 dagen.
OPMERKING: De volwassenen in deze flessen zijn 3-5 dagen oud en kunnen worden gebruikt in de letaliteits- en voedingsexperimenten. De flessen die worden gebruikt om volwassen vliegen te verouderen, bevatten eieren en larven. Als gevolg hiervan kunnen deze flessen worden gebruikt om de volgende generatie vliegen te verspreiden.
3. Voorbereiding van vliegen voor blootstelling aan chemische stoffen
- Verdoof 5-7 dagen oude vliegen met CO2. Sorteer de verdoofde vliegen op geslacht met behulp van hun genitaliën. Voor hulp bij het verdoven en seksen van vliegen, zie referentie28.
- Plaats groepen van 20 mannelijke of 20 vrouwelijke vliegen in injectieflacons met standaard BDSC-media. Sluit de injectieflacon met een rayonplug en bewaar de injectieflacons voor mannen en vrouwen afzonderlijk. Markeer de injectieflacons met vrouwelijke vliegen met een streep. Laat de injectieflacons met mannelijke vliegen ongemarkeerd om te voorkomen dat geslachten per ongeluk worden gemengd.
OPMERKING: Het aantal injectieflacons dat in stap 3.2 moet worden bereid, wordt bepaald door de grootte van de blootstellingsexperimenten. Zoals beschreven in stap 5.3 en 5.6, vereist een typisch bereikbepalingsexperiment voor een enkele teststof minimaal 40 injectieflacons met mannen en 40 injectieflacons met vrouwen. Een standaard dosis-responscurve-experiment, beschreven in stap 7.4 en 7.8, vereist minimaal 63 injectieflacons van mannen en 63 injectieflacons van vrouwen. - Bewaar de injectieflacons gedurende 48 uur in een incubator bij 25 °C bij ongeveer 60% luchtvochtigheid en met een licht:donkercyclus van 12:12 uur. Zet gedurende deze tijd de lade met gesorteerde injectieflacons in een hoek van 60 ° om te voorkomen dat vliegen vast komen te zitten in het voedsel terwijl ze herstellen van de anesthesie.
OPMERKING: Met deze stap kunnen vliegen herstellen van de CO 2-anesthesie. Verdoof de vliegen niet opnieuw tijdens de rest van het blootstellingsprotocol. - Voeg na de herstelperiode van 48 uur 0,75 ml steriel gezuiverd water toe aan de injectieflacons die in stap 1.3 zijn bereid. Het aantal injectieflacons dat in deze stap wordt bereid, moet identiek zijn aan het aantal injectieflacons dat in stap 3.2 is ingesteld.
- Breng gesorteerde, op geslacht afgestemde vliegen over naar de injectieflacon met uithongering door de glazen injectieflacon met de vliegen uit stap 3.2 te openen, in de mond van de voorbereide plastic injectieflacon te plaatsen en vervolgens de onderkant van de plastic injectieflacon tegen een tafelblad te tikken. Sluit de plastic injectieflacon met een celluloseacetaatplug (algemeen bekend als een flug).
- Noteer alle vliegen die bij deze overdracht verloren zijn gegaan (overdracht naar records van het startaantal vliegen voor elke injectieflacon later).
- Markeer uithongerflacons met vrouwelijke vliegen met een streep. Laat de injectieflacons met mannelijke vliegen ongemarkeerd om te voorkomen dat geslachten per ongeluk worden gemengd.
- Bereid de vochtigheidskamer voor op blootstelling 's nachts. Zie stap 1.4-1.5 voor een beschrijving van het bouwen van deze kamer.
- Plaats zes standaard papieren handdoeken in de bodem van de vochtigheidskamer. Week de papieren handdoeken met 100 ml water.
- Leg het plastic rooster (stap 1.5) over de natte handdoeken om ervoor te zorgen dat de injectieflacons niet in contact komen met de verzadigde papieren handdoeken.
- Plaats de trays met uithongeringsflacons in een horizontale positie in de vochtigheidskamers. Plaats de vochtigheidskamers een nacht in een incubator van 25 °C (bij ongeveer 60% luchtvochtigheid).
OPMERKING: Idealiter duurt de nachtelijke uithongeringsperiode ongeveer 16 uur; De timing kan echter worden aangepast voor individuele laboratoriumschema's.
4. Bereiding van voorraadoplossingen
OPMERKING: Vliegen krijgen testchemicaliën in een gist-sucrose vloeibaar medium. In dit hoofdstuk wordt beschreven hoe stamoplossingen van geconcentreerde voedingsmedia en teststoffen worden bereid.
- Bereid een 4x gist-sucrose-oplossing met 16% sucrose en 6% gistextract (m/v) (zie tabel met materialen) opgelost in steriel gezuiverd water. Autoclaaf de oplossing op een vloeistofcyclus voor de juiste sterilisatietijd (bijv. 40 minuten voor 1 l).
OPMERKING: De oplossing kan in bulk worden gemaakt en in aliquots bij -20 °C worden opgeslagen. Ontdooi individuele aliquots 1 dag voor gebruik door ze in een koelkast van 4 °C te plaatsen. - Maak een voorraad van de teststof klaar. Voor het eerste experiment moet de stamoplossing in de hoogste concentratie worden gemaakt, zodat de chemische stof volledig in water kan worden opgelost.
OPMERKING: Andere oplosmiddelen dan water kunnen worden gebruikt om de teststof op te lossen. Zie de discussie over kanttekeningen bij het gebruik van alternatieve oplosmiddelen. - Bereid een 100x blauwe kleurstofoplossing door 1 g FD&C Blue No. 1 (zie materiaaltabel) op te lossen in 10 ml steriel gezuiverd water.
OPMERKING: De blauwe kleurstofstockoplossing kan in bulk worden gemaakt en in aliquots bij 4 °C worden opgeslagen.
5. Bereiding van blootstellingsflacons: experiment met bereikbepaling
OPMERKING: Stap 5 en 6 van het protocol zijn ontworpen om de laagste dosis teststof te identificeren die 100% letaliteit induceert en de hoogste dosis die geen dodelijk fenotype induceert. Als deze concentraties al zijn bepaald door eerdere experimenten, zie stap 7 en 8 voor het berekenen van een dosis-responscurve. Blootstellingsmedia moeten onmiddellijk worden bereid voordat vliegen aan de injectieflacons worden toegevoegd.
- Label acht centrifugebuizen van 15 ml als volgt: (i) geen chemische stof, (ii) hoogste concentratie, (iii) 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 en 1:1.000.
- Bereid de blootstellingsmedia in de gelabelde centrifugebuizen vanaf stap 5.1 voor door eerst 2,5 ml 4x gist/sucrose-stockoplossing toe te voegen aan alle acht gelabelde buizen.
- Voeg 7,5 ml steriel gezuiverd water toe aan de buis met het label "geen chemische stof". Deze verdunning is de negatieve controle.
- Voeg 7,4 ml van de stamoplossing van de teststof toe aan de buis met het label "hoogste concentratie". Voeg 100 μL steriel gezuiverd water toe aan deze buis, zodat het uiteindelijke volume 10 ml is. Bereken en noteer de molariteit van de teststof in deze oplossing.
OPMERKING: De toevoeging van 100 μL steriel gezuiverd water aan de buis zorgt ervoor dat de chemische concentratie in deze stap identiek is aan die in stap 5.5, waarbij een blauwe kleurstofstamoplossing aan de blootstellingsmedia wordt toegevoegd als methode voor het beoordelen van het voedingsgedrag. - Voeg de juiste hoeveelheid teststofoplossing en steriel gezuiverd water toe aan de resterende buizen. Het uiteindelijke volume van elke buis moet 10 ml zijn. De uiteindelijke concentratie van teststoffen in deze buizen ten opzichte van de buis met de "hoogste concentratie" moet 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 en 1:1.000 zijn.
- Bereid acht injectieflacons voor en etiketteer deze voor elke afzonderlijke concentratie blootstellingsmedia die in stap 5.1 wordt gegenereerd. Er moeten acht sets injectieflacons zijn (in totaal 64 injectieflacons) met de volgende etiketten: geen chemische stof, hoogste concentratie, 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 en 1:1.000.
- Pipetteer 0,75 ml blootstellingsmedia bereid in stap 5.2.3 in de overeenkomstige set injectieflacons.
- Label acht afzonderlijke buisjes van 5 ml als volgt: (i) geen chemische stof, (ii) hoogste concentratie, (iii) 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 en 1:1.000.
- Bereid blootstellingsmedia voor blauwe kleurstof door eerst 500 μL 4x gist/sucrose-stockoplossing en 20 μL blauwe kleurstof-stockoplossing te mengen in acht gelabelde buisjes van 5 ml.
- Voeg 1,48 ml steriel gezuiverd water toe aan de buis met het label "geen chemische stof". Deze verdunning is de negatieve controle.
- Voeg 1,48 ml van de stamoplossing van de teststof toe aan de buis met het label "hoogste concentratie". Aan deze buis wordt geen water toegevoegd. Bereken en noteer de molariteit van de teststof in deze oplossing.
- Voeg de juiste hoeveelheid teststofoplossing en steriel gezuiverd water toe aan de resterende buizen. Het uiteindelijke volume van elke buis moet 2 ml zijn. De uiteindelijke concentratie van de teststof in deze buizen ten opzichte van de buis met de "hoogste concentratie" moet 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 en 1:1.000 zijn.
- Bereid en label twee blootstellingsflacons met elke afzonderlijke concentratie blauwe blootstellingsmedia. Er moeten acht sets injectieflacons zijn (16 injectieflacons in totaal) met de volgende etiketten: geen chemische stof, hoogste concentratie, 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 en 1:1.000. Het woord "blauw" moet ook op deze injectieflacons worden geschreven.
- Pipetteer 0,75 ml blauwe blootstellingsmedia in de overeenkomstige set blauwe blootstellingsflacons.
6. Blootstelling aan vliegchemicaliën: experiment voor het vinden van bereik
- Bereid injectieflacons met chemische blootstelling als volgt voor met behulp van de injectieflacons met 's nachts uitgehongerde vliegen uit stap 3.7:
- Breng vier injectieflacons met uitgehongerde vrouwelijke vliegen (20 vliegen per injectieflacon) over in vier blootstellingsflacons van elke chemische concentratie. Label deze injectieflacons als "vrouwelijk". Gebruik dezelfde overdrachtsmethode als beschreven in stap 3.5.
- Breng vier injectieflacons met uitgehongerde mannelijke vliegen (20 vliegen per injectieflacon) over in vier blootstellingsflacons van elke chemische concentratie. Label deze injectieflacons als "mannelijk". Gebruik dezelfde overdrachtsmethode als beschreven in stap 3.5.
- Bereid injectieflacons met blauwe kleurstof voor chemische blootstelling met behulp van de injectieflacons met 's nachts uitgehongerde vliegen uit stap 3.7 als volgt:
- Breng één injectieflacon met uitgehongerde vrouwelijke vliegen (20 vliegen per injectieflacon) over in één blauwe blootstellingsflacon voor elke chemische concentratie. Label deze injectieflacon als "vrouwelijk". Gebruik dezelfde overdrachtsmethode als beschreven in stap 3.5.
- Breng één injectieflacon met uitgehongerde mannelijke vliegen (20 vliegen per injectieflacon) over in één blauwe blootstellingsflacon voor elke chemische concentratie. Label deze injectieflacon als "mannelijk". Gebruik dezelfde overdrachtsmethode als beschreven in stap 3.5.
- Noteer het aantal vliegen dat na de overdracht in elke injectieflacon aanwezig is en noteer het aantal dat is gestorven of ontsnapt. Normaal gesproken zouden alle 20 vliegen 's nachts de honger en overdracht moeten overleven.
- Plaats de injectieflacons horizontaal in vers bereide vochtigheidskamers (zie stap 3.6 voor de bereiding van de vochtigheidskamer). Plaats de kamers in een incubator van 25 °C met ongeveer 60% luchtvochtigheid en een licht-donkercyclus van 12:12 uur.
- Onderzoek de injectieflacons na 24 en 48 uur na het begin van de chemische blootstelling. Tel en noteer het aantal dode vliegen in elke injectieflacon op elk tijdstip.
OPMERKING: De dood wordt gebruikt als de uitlezing voor deze test, maar het protocol kan worden aangepast om andere fenotypen te onderzoeken. Blootgestelde vliegen worden vaak verzameld op deze tijdstippen voor transcriptomische en metabolomische studies. - Onderzoek de blauwe blootstellingsflacons 24 uur na het begin van de chemische blootstelling. Gebruik de volgende technieken om te bepalen of blootgestelde vliegen de blauwe blootstellingsmedia hebben verbruikt:
- Onderzoek de wanden van de injectieflacon op aanwijzingen voor blauwe uitwerpselen, die verschijnen als kleine stippen aan de zijkant van de blootstellingsflacon en op de flug.
- Verdoof de vliegen met CO2 en onderzoek de buik op de aanwezigheid van blauwe kleurstof.
OPMERKING: Normaal gesproken worden blauwe blootstellingsflacons na 24 uur geanalyseerd. Deze stap kan echter in plaats daarvan op 48 uur worden uitgevoerd. Vliegen die normaal hebben gegeten, hebben een blauwe streep door de buik, wat aangeeft dat de blootstellingsmedia de darm zijn binnengedrongen. - Onderzoek de vliegen op abnormaal voedingsgedrag, zoals regurgitatie, opgezette gewassen en afbraak van de darmbarrièrefunctie (aangegeven door het verschijnen van blauwe kleurstof in het hele organisme in plaats van alleen beperkt tot het maagdarmkanaal, gewoonlijk smurfinggenoemd 32,33).
- Gooi alle verontreinigde injectieflacons, filtreerpapier, flugs en vliegen weg in geschikte containers voor chemisch afval. Als er levende vliegen in de injectieflacons achterblijven, vries dan de injectieflacons in om de vliegen te doden voordat u ze in de juiste afvalcontainer gooit.
OPMERKING: De verwijdering van blootstellingsflacons en vliegen wordt bepaald door de chemische stof(fen) die in het experiment worden geanalyseerd. Volg altijd de chemische veiligheidsprocedures die op het chemischeveiligheidsinformatieblad worden beschreven. Als concentraties die worden gebruikt in het bereikbepalingsexperiment vliegen doden bij de laagste dosis, herhaal dan rubriek 6 met behulp van een verdunningsreeks, te beginnen met de laagste concentratie die 100% van de dieren doodde.
7. Bereiding van blootstellingsflacons: het genereren van een dosis-responscurve
OPMERKING: Het protocol dat in stap 5 en 6 wordt beschreven, is ontworpen om in grote lijnen de chemische concentratie te bepalen die nodig is om een fenotype uit te lokken. Stap 7 en 8 van het protocol worden gebruikt om een nauwkeurige dosis-responscurve te berekenen.
- Bereken de concentraties van de teststof die moeten worden geanalyseerd om een dosis-responscurve te genereren met behulp van de volgende methode:
- Bepaal de laagste concentratie van de teststof die 100% van de blootgestelde vliegen na 48 uur doodt.
- Bepaal de hoogste concentratie van de teststof die geen effect heeft op de levensvatbaarheid na 48 uur.
- Bereken nog eens vier concentraties die gelijkelijk zijn verdeeld over de concentraties die zijn bepaald in stap 7.1.1 en 7.1.2.
- Etiketteer negen afzonderlijke centrifugebuizen van 15 ml met de molariteit van de volgende concentraties: i) geen chemische stof, ii) concentratie bepaald in stap 7.1.1, iii) concentratie bepaald in stap 7.1.2, iv) concentraties bepaald in 7.1.3, v) tweemaal de concentratie bepaald in stap 7.1.1, vi) een verdunning van de concentratie van 1:2 bepaald in stap 7.1.2.
OPMERKING: Het opnemen van de concentraties die tweemaal de in punt 7.1.1 bepaalde concentratie zijn en een verdunning van 1:2 van die bepaald in stap 7.1.2 is belangrijk voor het nauwkeurig berekenen van de dosis-responscurve. - Bereid de blootstellingsmedia voor door eerst 2,5 ml 4x gist/sucrose-stamoplossing toe te voegen aan negen gelabelde individuele centrifugebuizen van 15 ml die in stap 7.2 zijn bereid.
- Voeg 7,5 ml steriel gezuiverd water toe aan de buis met het label "geen chemische stof". Deze verdunning is de negatieve controle.
- Voeg de juiste hoeveelheid teststofoplossing en steriel gezuiverd water toe aan de resterende buizen. Het uiteindelijke volume van elke buis moet 10 ml zijn. De uiteindelijke concentratie van de chemische stof in een afzonderlijke buis moet gelijk zijn aan die op de buitenkant van de buis.
- Bereid en etiketteer 12 injectieflacons voor elke concentratie blootstellingsmedia die in stap 7.2 wordt gegenereerd. Er moeten negen sets injectieflacons zijn (108 injectieflacons in totaal).
- Pipetteer 0,75 ml blootstellingsmedia in de overeenkomstige set blootstellingsflacons.
OPMERKING: Stap 7.6 tot en met 7.8 zijn optioneel. Als bekend is dat de in stap 7.2 bereide concentraties van de teststof geen invloed hebben op het voedingsgedrag, kunnen deze stappen worden overgeslagen. - Bereid en label negen verschillende buisjes van 5 ml voor blauwe blootstellingsmedia met dezelfde reeks concentraties die in stap 7.2 worden gebruikt.
- Bereid blootstellingsmedia voor blauwe kleurstof door eerst 500 μL 4x gist/sucrose-stockoplossing en 20 μL blauwe kleurstofstockoplossing te mengen.
- Voeg 1,48 ml gezuiverd steriel water toe aan de buis met het label "geen chemische stof". Deze verdunning is de negatieve controle.
- Voeg de juiste hoeveelheid teststofoplossing en gezuiverd steriel water toe aan de resterende buizen. Het uiteindelijke volume van elke buis moet 2 ml zijn. De uiteindelijke concentratie van de chemische stof in een afzonderlijke buis moet gelijk zijn aan die op de buitenkant van de buis.
- Bereid en label twee injectieflacons voor elke afzonderlijke concentratie blauwe blootstellingsmedia. Er moeten negen sets injectieflacons zijn (18 injectieflacons in totaal), waarbij elke set injectieflacons is geëtiketteerd met de concentraties vermeld in stap 7.2. Het woord "blauw" moet ook op deze injectieflacons worden geschreven.
- Pipetteer 0,75 ml blauwe blootstellingsmedia in de overeenkomstige set blauwe blootstellingsflacons.
8. Blootstelling aan vliegchemicaliën: het genereren van een dosis-responscurve
- Bereid injectieflacons met chemische blootstelling als volgt voor met behulp van de injectieflacons met 's nachts uitgehongerde vliegen uit stap 3.7:
- Breng zes injectieflacons met uitgehongerde vrouwelijke vliegen (20 vliegen per injectieflacon) over in zes blootstellingsflacons van elke chemische concentratie. Label deze injectieflacons als "vrouwelijk". Gebruik dezelfde overdrachtsmethode als beschreven in stap 3.5.
- Breng zes injectieflacons met uitgehongerde mannelijke vliegen (20 vliegen per injectieflacon) over in zes blootstellingsflacons van elke chemische concentratie. Label deze injectieflacons als "mannelijk". Gebruik dezelfde overdrachtsmethode als beschreven in stap 3.5.
- Bereid injectieflacons met blauwe kleurstof voor chemische blootstelling met behulp van de injectieflacons met 's nachts uitgehongerde vliegen uit stap 3.7 als volgt:
- Breng één injectieflacon met uitgehongerde vrouwelijke vliegen (20 vliegen per injectieflacon) over in één blauwe blootstellingsflacon voor elke chemische concentratie. Label deze injectieflacon als "vrouwelijk". Gebruik dezelfde overdrachtsmethode als beschreven in stap 3.5.
- Breng één injectieflacon met uitgehongerde mannelijke vliegen (twintig vliegen per injectieflacon) over in één blauwe blootstellingsflacon voor elke chemische concentratie. Label deze injectieflacon als "mannelijk". Gebruik dezelfde overdrachtsmethode als beschreven in stap 3.5.
- Noteer het aantal vliegen dat na de overdracht in elke injectieflacon aanwezig is. Normaal gesproken zouden alle 20 vliegen de nachtelijke uithongering en overdracht moeten overleven, maar zorg ervoor dat alle vliegen die tijdens de overdracht zijn gestorven of ontsnapt, van het totaal worden afgetrokken.
- Plaats de injectieflacons horizontaal in vers bereide vochtigheidskamers (zie stap 3.6 voor de bereiding van de vochtigheidskamer). Plaats de kamers in een incubator van 25 °C met ongeveer 60% luchtvochtigheid en een licht-donkercyclus van 12:12 uur.
- Onderzoek de injectieflacons na 24 en 48 uur na het begin van de chemische blootstelling. Tel en noteer het aantal dode vliegen in elke injectieflacon op elk tijdstip.
- Onderzoek de blauwe blootstellingsflacons 24 uur na het begin van de chemische blootstelling. Gebruik de methode die wordt beschreven in stap 6.6 om veranderingen in voedingsgedrag te beoordelen.
- Gooi alle verontreinigde injectieflacons, filtreerpapier, flugs en vliegen weg in geschikte containers voor chemisch afval. Als er levende vliegen in de injectieflacons achterblijven, vries dan de injectieflacons in om de vliegen te doden voordat ze in de juiste afvalcontainer worden weggegooid.
OPMERKING: De verwijdering van blootstellingsflacons en vliegen wordt bepaald door de chemische stof(fen) die in het experiment worden geanalyseerd. Volg altijd de chemische veiligheidsprocedures die op het chemischeveiligheidsinformatieblad worden beschreven.
9. Berekening van een dosis-responscurve
- Gebruik de Benchmark Dose Software (BMDS, versie 3.2; zie Tabel met materialen) of andere soortgelijke software om de gegevens te analyseren34. Hieronder wordt de workflow met behulp van de BMDS-software beschreven.
- Klik op het tabblad Gegevens van BMDS en klik op nieuwe gegevensset invoegen. Voer het aantal voorbeelden in de gegevensset in, klik op dichotoom en klik vervolgens op gegevensset maken. Voer elke replicatie in als een afzonderlijke rij in de gegevensset.
- Voer de dosis in de eerste kolom van de gegenereerde tabel in, het beginaantal vliegen met uitzondering van vliegen die zijn gestorven of verloren zijn gegaan vóór stap 8.3) in de tweede kolom, en het aantal vliegen dat is gestorven door blootstelling aan chemische stoffen in de derde kolom.
- Klik op het tabblad Hoofd van BMDS.
- Klik op de vervolgkeuzepijl voor het menu Modeltype selecteren en klik op Dichotomous.
- Klik op inschakelen voor de gegevensset uit stap 9.2 in de tabel Gegevenssets.
- Klik op de vakjes voor de gewenste modellen voor analyse in de MLE en Alternatieven tabel.
OPMERKING: Het Frequentist Restricted Dichotomous Hill-model werd voornamelijk gebruikt. - Klik op Analyse uitvoeren. Het programma genereert een uitvoerbestand met de letaliteitscurve(n) en aanvullende details over het (de) model(len).
Representative Results
De vlieg heeft lang gediend als een model in studies voor het bepalen van natriumarseniet (NaAsO2) toxiciteit35,36,37,38. Om de werkzaamheid van het protocol aan te tonen, werden mannelijke en vrouwelijke vliegen blootgesteld aan NaAsO2, met als doel deze resultaten te vergelijken met eerdere studies. Met behulp van de hierboven beschreven methodologie werden volwassen Oregon-R (BDSC stock #2057) mannen en vrouwen blootgesteld aan een reeks NaAsO 2-concentraties (0, 0,01, 0,02, 0,1, 0,2, 1 en2 mM) en scoorden voor letaliteit 48 h na het begin van de blootstelling (figuur 1A, B).
Het doel van deze eerste analyse was om het geschatte bereik van concentraties te identificeren dat een nauwkeurigere karakterisering van NaAsO2-toxiciteit mogelijk zou maken. In latere experimenten werden concentraties geselecteerd (0, 0,2, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 en 5 mM) die de NaAsO2 dosis-responscurve nauwkeuriger definieerden (figuur 1C,D). Merk op dat de resulterende analyse verschillende concentraties onderzocht die 100% letaliteit veroorzaakten. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van de openbaar beschikbare Benchmark Dose Software versie 3.2.0.125 van het Environmental Protection Agency. De gegevens werden gemodelleerd als "dichotoom" en het Dichotomous Hill-model werd gebruikt voor latere analyses. Op basis van dit model waren de uiteindelijke LD10, LD25 en LD 50 van mannelijke vliegen die NaAsO2 kregen respectievelijk 0,30 mM,0,50 mM en 0,65 mM. Voor vrouwelijke vliegen waren deze waarden iets hoger, met een LD10 van 0,30 mM, een LD25 van 0,65 mM en een LD50 van 0,90 mM. Over het geheel genomen zijn de waarden die met deze methode worden verkregen vergelijkbaar met die welke eerder zijn gerapporteerd voor arseentoxiciteit in de Drosophila melanogaster35,36,37,38, waardoor de methodologie wordt gevalideerd.
Naast de zes replicaties die werden gebruikt om de dosis-responscurve te berekenen, kregen mannelijke en vrouwelijke vliegen ook NaAsO 2-blootstellingsoplossingen die 1% FD &C-blauw bevatten, wat gemakkelijk zichtbaar is in het spijsverteringskanaal met behulp van lichtmicroscopie. Op basis van de aanwezigheid van blauwe kleurstof in de darm van NaAsO 2-gevoede vliegen, bleven zowel mannelijke als vrouwelijke vliegen 24 uur na het begin van de chemische blootstelling voeden, ongeacht de NaAsO 2-concentratie die aanwezig was in de vloeibare media (figuur 2). Er werd echter waargenomen dat het ingenomen voedsel af en toe werd geregenereerd in doses van meer dan 0,2 mM voor vrouwen en 0,5 mM voor mannen (figuur 2). Deze bevindingen suggereren dat regurgitatie een sleutelrol zou kunnen spelen in de Drosophila-reactie op arseenvergiftiging.
Figuur 1: Dosis-responscurven voor mannelijke en vrouwelijke Drosophila behandeld met NaAsO2 gedurende 48 uur. Alle grafieken tonen de geschatte verhoudingen van dode vliegen bij elke NaAsO2-concentratie getest op basis van het Dichotomous Hill-model. (A,B) Een breed scala aan NaAsO2-concentraties werd getest om de dosis te benaderen waarbij elk geslacht van de vlieg begint te sterven. (A) toont de mannelijke gegevens en (B) toont de vrouwelijke gegevens. N = 4 injectieflacons, met 20 vliegen per injectieflacon. (C,D) Een smaller bereik van NaAsO2-concentraties werd getest om precieze doses te bepalen waarbij 10%, 25% en 50% van elk geslacht van vliegen stierf. Deze doses worden rechts van elke grafiek aangegeven. (C) toont de mannelijke gegevens en (D) toont de vrouwelijke gegevens. N = 6 injectieflacons, met 20 vliegen per injectieflacon. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve resultaten van de blauwe kleurstoftest van mannelijke en vrouwelijke Drosophila behandeld met NaAsO2 gedurende 24 uur. Microfoto's tonen vliegen die toenemende concentraties NaAsO2 kregen. Rij (A) toont mannelijke vliegen en rij (B) toont vrouwelijke vliegen, waarbij de concentratie van NaAsO2 van links naar rechts toeneemt. De buik vertoont een kleine hoeveelheid blauw in de buurt van de thorax bij lage concentraties, wat aangeeft dat blootstellingsmedia de darm zijn binnengekomen. Bij hogere concentraties begint blauwe kleurstof zich op te hopen rond de mond, wat suggereert dat blootstellingsmedia worden gereurgiteerd. De schaalbalk is 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
De fruitvlieg Drosophila melanogaster is in opkomst als een krachtig systeem voor NAMs16,18,19,21. Door gebruik te maken van de ongeëvenaarde genetische bronnen die beschikbaar zijn voor de vlieggemeenschap, gecombineerd met recente vooruitgang in genomica en metabolomica, zijn chemische veiligheidsstudies met behulp van Drosophila in staat om snel de moleculaire mechanismen te identificeren waarmee individuele verbindingen interfereren met metabolisme, fysiologie en celsignalering (zie bijvoorbeeld39). Dit goedkope protocol is ontworpen om snel dosis-responscurven te definiëren en vervolgens monsters te genereren voor RNA-seq- en metabolomics-analyse. Bovendien kan dit flexibele protocol worden aangepast voor gebruik met elk genotype en is het geschikt voor vele klassen chemicaliën.
Een opmerkelijk aspect van dit protocol is de keuze van vloeibaar voedsel dat wordt gebruikt bij de chemische blootstelling, die is gebaseerd op een eerdere studie, maar verschilt van de vaste media die worden gebruikt door de meeste toxicologische studies van Drosophila18,22. Deze specifieke vloeibare media werden geselecteerd om de voedingswaarde weer te geven van de standaard, vaste BDSC-media die de vliegen ook in dit protocol krijgen, om ervoor te zorgen dat de vliegen consistente voeding krijgen. De eenvoud van vloeibare voedingsmedia heeft veel voordelen. Vloeibare media zijn gemakkelijker te hanteren dan vast voedsel, dat moet worden gesmolten en gereconsolideerd of gereconstitueerd uit poeder. Vloeibare media verhogen ook de doorvoer van het systeem, zorgen voor een gelijkmatige chemische verdeling over de voedingsmedia en verminderen de tijd die wordt besteed aan het werken met gevaarlijke verbindingen. Bovendien hoeven de media geen oplossingen te verwarmen, wat het testen van vluchtige teststoffen vergemakkelijkt. Ten slotte worden, vanwege de relatief weinige componenten in de voedseloplossing, ongewenste nevenreacties tussen de teststof en andere voedingscomponenten geminimaliseerd. De gist die in het voedsel wordt gebruikt, is ook inactief, waardoor de reactiviteit van het voedingsmedium verder wordt beperkt. Houd er echter rekening mee dat de methode niet geschikt is voor het testen van ontwikkelings- of larvale toxiciteit.
Sommige van de materialen die in het protocol worden gebruikt, kunnen worden vervangen, zoals het gebruik van glazen vliegenflacons in plaats van polypropyleen. De gebruikte materialen werden echter geselecteerd om zowel inert als wegwerpbaar te zijn om ongewenste chemische reacties tussen reagentia en chemische blootstellingen als gevolg van het reinigen van glaswerk te voorkomen.
Het gebruik van vloeibaar voedsel vereist een voertuig voor voedselbezorging. Celluloseacetaatfilterpapier werd voor dit doel gekozen vanwege zijn flexibiliteit en inerte aard28. Andere onderzoekers gebruikten vergelijkbare protocollen, maar met andere voertuigen, zoals delicate taakdoekjes of glasvezelfilter29,30. Het celluloseacetaatfilterpapier voldeed aan deze behoeften omdat het een inert medium is dat in de ideale vorm kan worden gesneden om het in de bodem van de vliegenflacons te passen zonder grote openingen tussen het papier en de wand van de injectieflacon, waardoor de dood als gevolg van vliegen die vast komen te zitten in media of het voertuig zelf, wordt voorkomen.
Een belangrijke beperking van dit systeem is dat de maximale testbare concentratie van een chemische stof gekoppeld is aan de oplosbaarheid van de chemische stof. Niet-wateroplosbare verbindingen vereisen een extra oplosmiddel, wat kan leiden tot extra of synergetische effecten met de chemische stof van belang. Dit kan ook situaties creëren waarin het niet mogelijk is om stamoplossingen te bereiden die voldoende geconcentreerd zijn om het gewenste eindpunt in alle organismen te bereiken, waardoor de analyse van de resulterende gegevens wordt beperkt31. Om dit aan te pakken, kunnen chemicaliën met een lage oplosbaarheid in water worden getest door tot 0,5% dimethylsulfoxide aan de voedseloplossing toe te voegen. Andere oplosmiddelen kunnen ook worden gebruikt, maar aanvullend onderzoek is nodig voor elk oplosmiddel van belang om de maximaal aanvaardbare oplosmiddelconcentratie in de oplossing te bepalen om de oplosbaarheid te maximaliseren en de effecten van oplosmiddelen op het organisme te minimaliseren.
Uitgebreide karakterisering van de reukrespons in Drosophila heeft beschreven hoe vliegen het consumeren van toxische verbindingen vermijden40,41, wat leidt tot verminderde voeding op behandelde media. De blauwe kleurstoftest pakt dit fenomeen aan door onderzoekers in staat te stellen het voedingsgedrag van de vliegen die elke concentratie experimentele chemische stof 42,43,44 voeden, efficiënt te screenen. De aan- of afwezigheid van blauw in het maagdarmkanaal van de vlieg geeft aan of de vlieg het giftige medium heeft gegeten. Hoewel er meer geavanceerde methoden bestaan om vliegvoergedrag te beoordelen, zoals de Fly Liquid-Food Interaction Counter45, is deze kwalitatieve methode beter geschikt voor screening met een hogere doorvoer.
Een opmerkelijk aspect van dit protocol is dat het is geoptimaliseerd voor een blootstellingsperiode van 48 uur zonder de noodzaak om vliegen over te brengen of extra vloeistof aan de blootstellingsflacon toe te voegen. Het gebruik van een vochtigheidskamer en het plaatsen van de kamers in een incubator met een hoge luchtvochtigheid voorkwam dat het filterpapier met de voedingsmedia gedurende dit tijdsbestek uitdroogde. Het protocol kan worden aangepast voor langere blootstellingsduur, maar de methode moet worden aangepast om ervoor te zorgen dat het filtreerpapier niet droog wordt en significante veranderingen in de concentratie of letaliteit van de oplossing veroorzaakt als gevolg van uitdroging.
Ten slotte is een belangrijk kenmerk van dit protocol dat het gemakkelijk genetische varianten kan accommoderen, waardoor onderzoekers het enorme scala aan genetische hulpmiddelen voor Drosophila kunnen gebruiken om deze voorstudies over wild-type organismen uit te breiden om mechanismen van chemische actie in vivo beter te begrijpen. In dit opzicht kan het hierboven beschreven protocol gemakkelijk worden gewijzigd als aanvulling op een eerder beschreven JoVE-protocol van Peterson en Long dat toxicologische analyse van in het wild gevangen vliegen mogelijk maakt18.
Vanwege de grote verscheidenheid aan eerdere studies over de toxiciteit van natriumarseniet in Drosophila 32,33,34,35,36, werden Oregon-R-vliegen behandeld met deze verbinding om de werkzaamheid van ons systeem aan te tonen. Mannelijke vliegen vertoonden een LD 50 van 0,65 mM en vrouwtjes vertoonden een LD50 van 0,90 mM. Dit komt overeen met eerdere studies van met natriumarseniet behandelde volwassen Drosophila. Goldstein en Babich37 ontdekten bijvoorbeeld dat 50% van de vliegen (gemengde geslachten) stierf na 7 dagen blootstelling aan 0,5 mM NaAsO2. Hoewel dit een iets lagere dosis is dan momenteel werd waargenomen, zijn de verschillen tussen hun methoden en deze methode (inclusief het gebruik van vaste blootstellingsmedia, een langere tijdschaal en gemengde geslachten) waarschijnlijk verantwoordelijk voor dit verschil. Belangrijk is dat beide methoden resulteerden in over het algemeen vergelijkbare LD50-waarden.
Observaties van experimenten met behulp van dit protocol kunnen worden gebruikt om genetische en moleculaire doelen te vinden voor latere gedrags- of mechanistische studies. De blootstellingsmethode kan ook worden gebruikt om Drosophila te behandelen voor bemonstering voor metabolomica en proteomica, waardoor dit protocol zeer geschikt is voor het groeiende veld van precisietoxicologie (gemodelleerd vanuit het precisiegeneeskundeveld46). In dit opzicht kunnen blootgestelde vliegen na stap 8 worden verzameld voor daaropvolgende genomische en metabolomische analyse. Monsters die in stap 8 zijn verzameld, kunnen vervolgens worden verwerkt, zoals beschreven door Li en Tennessen47, te beginnen met stap 3.
Uiteindelijk zouden de gegevens verkregen uit de hierboven beschreven experimenten, evenals eventuele daaropvolgende metabolomics- en proteomics-gegevens, idealiter worden gebruikt in vergelijkingen tussen soorten. Zoals eerder opgemerkt26, zijn dergelijke cross-species studies krachtig en in staat om te bepalen hoe individuele chemicaliën interfereren met geconserveerde biologische routes. Het hierboven beschreven protocol kan dus worden gebruikt om evolutionaire overeenkomsten te vinden in reactie op individuele toxische stoffen in phyla en om de chemische veiligheidsregulering te helpen informeren.
Disclosures
Geen belangenconflicten om bekend te maken.
Acknowledgments
We bedanken onze medewerkers voor hulp bij het testen en optimaliseren van dit protocol: Ameya Belamkar, Marilyn Clark, Alexander Fitt, Emma Rose Gallant, Ethan Golditch, Matthew Lowe, Morgan Marsh, Kyle McClung, Andy Puga, Darcy Rose, Cameron Stockbridge en Noelle Zolman. We bedanken ook onze collega's van de Precision Toxicology Group, met name onze tegenhangers van de Exposure Group, voor het helpen identificeren van de doelen van het protocol.
Dit project ontving financiering van het Horizon 2020 Research and Innovation-programma van de Europese Unie onder Grant Agreement No. 965406. Het werk dat in deze publicatie wordt gepresenteerd, is uitgevoerd als onderdeel van het ASPES-cluster. Deze output weerspiegelt alleen de standpunten van de auteurs en de Europese Unie kan niet verantwoordelijk worden gehouden voor enig gebruik dat kan worden gemaakt van de informatie die erin is opgenomen. Deze publicatie werd ook mogelijk gemaakt met steun van het Indiana Clinical and Translational Sciences Institute, dat gedeeltelijk wordt gefinancierd door Award Number UL1TR002529 van de National Institutes of Health, National Center for Advancing Translational Sciences, Clinical and Translational Sciences Award. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. Delen van dit project werden ondersteund door fondsen van Indiana University toegekend aan JRS en het PhyloTox-consortium. JMH en EMP werden ondersteund door NIH award P40OD018537 aan Bloomington Drosophila Stock Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 inch flower lever action craft punch | Bira Craft | HCP-115-024 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | VWR | 89039-666 | High-Performance Centrifuge Tubes with Flat or Plug Caps, Polypropylene, 15 mL |
| 2 ml Tubes | VWR | 16466-044 | Micro Centrifuge Tube with Flat Screw-Cap, conical bottom |
| 5 ml Tubes | VWR | 60818-576 | Culture Tubes, Plastic, with Dual-Position Caps |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430290 | 50 mL polypropylene centrifuge tubes, conical bottom with plug seal cap |
| Benchmark Dose Software version 3.2 | U.S. Environmental Protection Agency | ||
| Cardboard trays | Genesee Scientific flystuff | 32-122 | trays and dividers for narrow vials |
| CO2 gas pads | Genesee Scientific flystuff | 59-114 | FlyStuff flypad, CO2 anesthetizing apparatus |
| Combitips advanced, 50 mL | Eppendorf | 0030089693 | Combitips advanced, Biopur, 50 mL, light gray, colorless tips |
| Cotton balls | Genesee Scientific flystuff | 51-101 | Cotton balls, large, fits narrow vials |
| Delicate task wipes | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes, 1 Ply / 8.2" x 4.39" |
| Drosophila Vial Plugs, Cellulose Acetate (aka, Flugs) | VWR | 89168-888 | Wide |
| FD&C Blue No. 1 | Spectrum Chemical | FD110 | CAS number 3844-45-9 |
| Flies | BDSC | Stock #2057 | OregonR wildtype |
| Gloves (nitrile) | Kimtech | 55082/55081/55083 | Kimtech purple nitrile exam gloves, 5.9 mil, ambidextrous 9.5" |
| Grade 1 CHR cellulose chromatography paper | Cytvia | 3001-917 | Sheet, 46 x 57 cm |
| Mesh for humidity chamber | |||
| Multipette / Repeater (X) stream | Eppendorf | 022460811 | Repeater Xstream |
| Plastic grate | Plaskolite | 18469 (from lowes) | Plaskolite 24 in x 48 in 7.85 sq ft louvered ceiling light panels, cut down to fit in rubbermaid tubs |
| Plastic trays for glass vials | Genesee Scientific flystuff | 59-207 | Narrow fly vial reload tray |
| Polypropylene Drosophila Vial | VWR | 75813-156 | Wide (28.5 mm) |
| Rubbermaid tubs | Rubbermaid | 3769017 (from Lowes) | Rubbermaid Roughneck Tote 10 gallon 18" L x 12" W x 8 1/2" H |
| Sucrose ultra pure | MP Biomedicals, Inc. | 821721 | |
| Tube racks for wide-mouthed tubes | Thermo scientific | 5970-0230 | Nalgene Unwire Test tube racks, for 30 mm tubes |
| Water Purification System | Millipore Milli-Q | ZMQ560F01 | Millipore Milli-Q Biocel Water Purifier |
| Yeast extract | Acros Organics | 451120050 | CAS number 84604-16-0 |
References
- United States Occupational Safety and Health Administration. Construction industry: OSHA safety and health standards (29 CFR 1926/1910). United States Occupational Safety and Health Administration. , (2022).
- Chemical, Metals, Natural Toxins & Pesticides Guidance Documents & Regulations. United States Food & Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/food/guidance-documents-regulatory-information-topic-food-and-dietary-supplements/chemical-metals-natural-toxins-pesticides-guidance-documents-regulations (2022).
- Drinking Water Contaminant Candidate List (CCL) and Regulatory Determination. United States Food & Drug Administration. , Available from: https://www.epa.gov/cci (2022).
- Administration Bottled Water/Carbonated Soft Drinks Guidance Documents & Regulatory Information. United States Food & Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/food/guidance-documents-regulatory-information-topic-food-and-dietary-supplements/bottled-watercarbonated-soft-drinks-guidance-documents-regulatory-information (2022).
- United States Congress. Federal Food, Drug, and Cosmetic Act. United States Congress. 21, 301-392 (1934).
- Determining if a Cleaning Product is a Pesticide Under FIFRA. Environmental Protection Agency. , Available from: https://www.epa.gov/pesticide-registration/determining-if-cleaning-produt-pesticide-under-fifra (2022).
- United States Congress. Toxic Substances Control Act of 1976. H.R. 12440. Library of Congress, United States. , 1640-1707 (1976).
- Wang, Z., Walker, G. W., Muir, D. C. G., Nagatani-Yoshida, K. Toward a global understanding of chemical pollution: a first comprehensive analysis of national and regional chemical inventories. Environmental Science Technology. 54 (5), 2575-2584 (2020).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacological Reviews. 63 (2), 411-436 (2011).
- New Approach Methods Work Plan. United States Environmental Protection Agency. , Available from: https://www.epa.gov/system/files/documents/2021-11/nams-work-plan_11_15_21_508-tagged.pdf (2021).
- Hartung, T. From alternative methods to a new toxicology. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (3), 338-349 (2011).
- Mahony, C. Building confidence in non-animal methods: Practical examples of collaboration between regulators, researchers and industry. Computational Toxicology. 10, 78-80 (2019).
- Kavlock, R. J., et al. Accelerating the pace of chemical risk assessment. Chemical Research in Toxicology. 31 (5), 287-290 (2018).
- European Chemicals Agency. New Approach Methodologies in Regulatory Science, Proceedings of the Scientific Workshop. European Chemicals Agency. , Helsinki, Finland, 19-20 April 2016 (2016).
- Wambaugh, J. F., et al. New approach methodologies for exposure science. Current Opinion in Toxicology. 15, 76-92 (2019).
- Rand, M. D. Drosophotoxicology: The growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicology and Teratology. 32 (1), 74-83 (2010).
- Ong, C., Yung, L. Y. L., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity. Nanotoxicology. 9 (3), 396-403 (2015).
- Peterson, E. K., Long, H. E. Experimental protocol for using Drosophila as an invertebrate model system for toxicity testing in the laboratory. Journal of Visualized Experiments. (137), e57450 (2018).
- Rand, M. D., Montgomery, S. L., Prince, L., Vorojeikina, D. Developmental toxicity assays using the Drosophila model. Current Protocols in Toxicology. 59, 11-20 (2014).
- Misra, J. R., Horner, M. A., Lam, G., Thummel, C. S. Transcriptional regulation of xenobiotic detoxification in Drosophila. Genes & Development. 25 (17), 1796-1806 (2011).
- Rocha, J. B. T. Drosophila melanogaster as a promising model organism in toxicological studies. Archives of Basic and Applied Medicine. 1 (1), 33-38 (2013).
- Affleck, J. G., Walker, V. K. Drosophila as a model for developmental toxicology: using and extending the drosophotoxicology model. Methods in Molecular Biology. 1965, 139-153 (2019).
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
- Chien, S., Reiter, L. T., Bier, E., Gribskov, M. Homophila: human disease gene cognates in Drosophila. Nucleic Acids Research. 30 (1), 149-151 (2002).
- Wangler, M. F., et al. Model organisms facilitate rare disease diagnosis and therapeutic research. Genetics. 207 (1), 9-27 (2017).
- Colbourne, J. K., et al. Toxicity by descent: A comparative approach for chemical hazard assessment. Environmental Advances. 9, 100287 (2022).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
- Markstein, M. Drosophila Workers Unite! A Laboratory Manual for Working with Drosophila. , Available from: http://marksteinlab.org/wp-content/uploads/2019/01/MicheleMarkstein-DrosophiliaWorkersUnite-PREPRINT-JAN2019.pdf (2018).
- Vang, L. L., Medvedev, A. V., Adler, J. Simple ways to measure behavioral responses of Drosophila to stimuli and use of these methods to characterize a novel mutant. PLoS One. 7 (5), 37495 (2012).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B., Byfield, F. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), e3795 (2012).
- Bloomington Drosophilia Stock Center. BDSC Cornmeal Food. , Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2022).
- Martins, R. R., McCracken, A. W., Simons, M. J. P., Henriques, C. M., Rera, M. How to catch a Smurf? - ageing and beyond… in vivo assessment of intestinal permeability in multiple model organisms. Bio-Protocol. 8 (3), 2722 (2018).
- Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).
- Benchmark Dose Software (BMDS) (Build 3.3; Model Library Version 2022.10) [Computer Software]. United States Environmental Protection Agency. , Available from: https://www.epa.gov/bmds/download-bmds (2022).
- Ortiz, J. G., Opoka, R., Kane, D., Cartwright, I. L. Investigating arsenic susceptibility from a genetic perspective in Drosophila reveals a key role for glutathione synthetase. Toxicological Sciences. 107 (2), 416-426 (2009).
- Pickett, A. D., Patterson, N. A. Arsenates: effect on fecundity in some Diptera. Science. 140 (3566), 493-494 (1963).
- Goldstein, S. H., Babich, H. Differential effects of arsenite and arsenate to Drosophila melanogaster in a combined adult/developmental toxicity assay. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 42 (2), 276-282 (1989).
- Polak, M., Opoka, R., Cartwright, I. L. Response of fluctuating asymmetry to arsenic toxicity: support for the developmental selection hypothesis. Environmental Pollution. 118 (1), 1928 (1928).
- Zhou, S., et al. A Drosophila model for toxicogenomics: Genetic variation in susceptibility to heavy metal exposure. PLoS Genetics. 13 (7), 1006907 (2017).
- Anholt, R. R. H. Chemosensation and evolution of Drosophila host plant selection. iScience. 23 (1), 100799 (2020).
- Depetris-Chauvin, A., Galagovsky, D., Grosjean, Y. Chemicals and chemoreceptors: ecologically relevant signals driving behavior in Drosophila. Frontiers in Ecology and Evolution. 3, 41 (2015).
- Aryal, B., et al. Protocol for binary food choice assays using Drosophila melanogaster. STAR Protocols. 3 (2), 101410 (2022).
- Shimada, I., Nakao, M., Kawazoe, Y. Acute differential sensitivity and role of the central nervous system in the feeding behavior of Drosophila melanogaster. Chemical Senses. 12 (3), 481-490 (1987).
- Tanimura, T., Isono, K., Takamura, T., Shimada, I. Genetic dimorphism in the taste sensitivity to trehalose in Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology. 147 (4), 433-437 (1982).
- Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), 101107 (2014).
- National Research Council. Toward Precision Medicine: Building a Knowledge Network for Biomedical Research and a New Taxonomy of Disease. National Academy of Sciences. , National Academies Press. US. (2011).
- Li, H., Tennessen, J. M. Preparation of Drosophila larval samples for gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)-based metabolomics. Journal of Visualized Experiments. (136), e57847 (2018).
