Standardisierte Identifizierung der Substanzstruktur in der tibetischen Medizin mittels Ionenfallen-Massenspektrometrie und mehrstufiger Fragmentierungsanalyse
Summary
Hier beschreiben wir ein allgemeines Protokoll und Design, das angewendet werden könnte, um Spuren und Nebenbestandteile in den komplexen Naturstoffformulierungen (Matrixen) in der tibetischen Medizin zu identifizieren.
Abstract
Tibetische Arzneimittel sind komplex und enthalten zahlreiche unbekannte Verbindungen, so dass eine eingehende Erforschung ihrer molekularen Strukturen von entscheidender Bedeutung ist. Die Flüssigchromatographie-Elektrospray-Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie (LC-ESI-TOF-MS) wird häufig zur Extraktion tibetischer Medizin verwendet. Viele unvorhersehbare unbekannte Verbindungen bleiben jedoch nach der Verwendung der Spectrum-Datenbank zurück. In der vorliegenden Arbeit wurde eine universelle Methode zur Identifizierung von Komponenten in der tibetischen Medizin mittels Ionenfallen-Massenspektrometrie (IT-MS) entwickelt. Die Methode umfasst standardisierte und programmierte Protokolle für die Probenvorbereitung, die MS-Einstellung, den LC-Prerun, die Methodenetablierung, die MS-Erfassung, den mehrstufigen MS-Betrieb und die manuelle Datenanalyse. Zwei repräsentative Verbindungen in den Samen der tibetischen Medizin Abelmoschus manihot wurden mittels mehrstufiger Fragmentierung identifiziert, wobei typische Substanzstrukturen detailliert analysiert wurden. Darüber hinaus werden Aspekte wie die Auswahl des Ionenmodus, die mobile Phaseneinstellung, die Optimierung des Scanbereichs, die Kontrolle der Kollisionsenergie, die Umschaltung des Kollisionsmodus, die Fragmentierungsfaktoren und die Grenzen der Methode erörtert. Die entwickelte standardisierte Analysemethode ist universell einsetzbar und kann auf unbekannte Verbindungen in der tibetischen Medizin angewendet werden.
Introduction
Die qualitative Analyse von Spurenelementen in der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) ist zu einem entscheidenden Thema in der Forschung geworden. Aufgrund der hohen Anzahl von Verbindungen in der TCM ist es schwierig, sie für die Analyse von Kernspinresonanzspektrometern (NMR) oder Röntgendiffraktometern (XRD) zu isolieren, wodurch massenspektrometrische (MS) basierte Methoden, die nur geringe Probenvolumina erfordern, immer beliebter werden. Darüber hinaus wurde die Flüssigchromatographie (LC) gekoppelt mit MS in den letzten Jahren in der TCM-Forschung zur verbesserten Trennung komplexer Proben und zur qualitativen Analyse chemischer Verbindungen eingesetzt1. Eine gängige Methode ist die Flüssigchromatographie-Elektrospray-Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie (LC-ESI-TOF-MS), die in der qualitativen Forschung zur tibetischen Medizin weit verbreitet ist2. Bei dieser Methode werden komplexe Komponenten in einer LC-Säule angereichert und separiert, und das Masse-zu-Ladungs-Verhältnis (m/z) der Addukt-Ionen wird mit einem MS-Detektor beobachtet. Die Suche in Tandem-MS-DATENBANKEN (MS/MS oder MS2) ist derzeit der schnellste Ansatz für zuverlässige Verbindungsannotationen in der Analyse kleiner Moleküle unter Verwendung von Quadrupol-Flugzeit-MS (Q-TOF) MS und Orbitrap MS3. Die schlechte Qualität der Datenbanken und das Vorhandensein verschiedener Isomere erschweren jedoch die Identifizierung unbekannter Verbindungen. Darüber hinaus sind die von der MS/MS-Datenbank bereitgestellten Informationen begrenzt 4,5,6,7. Es ist wichtig, die chemischen Verbindungen in jeder TCM unter Verwendung eines allgemeinen Protokolls zu untersuchen, das auf andere TCM angewendet werden kann.
IT-MS fängt eine breite Palette von Ionen ein, indem unterschiedliche Hochfrequenzspannungen (HF) an die Ringelektroden8 angelegt werden. IT-MS kann mehrstufige MS-Scans in verschiedenen zeitlichen Reihenfolgen in Zeitreihen durchführen und eine mehrstufige MS (MS n)-Fragmentierung der Inhaltsstoffe ermöglichen, wobein die Anzahl der Produktionenstufen9 ist. Die lineare IT-MS gilt als die beste für die Strukturidentifikation, da sie für sequentielleMS-n-Experimente verwendet werden kann10. Gezielte Ionen können isoliert und in linearer IT-MS1 akkumuliert werden. Das MS n (n ≥ 3) in IT-MS liefert mehr Fragmentinformationen als MS/MS in Q-TOF-MS. Da IT-MS das Zielion und seine Fragmentionen nicht binden kann, ist es ein leistungsfähiges Werkzeug zur Strukturaufklärung unbekannter Verbindungen, einschließlich Isomeren1. DieMSN-Technologie wird in großem Umfang zur Strukturanalyse unbekannter Proteine, Peptide und Polysaccharide eingesetzt11,12. Die Häufigkeit von Fragmentionen in MSn liefert mehr molekulare Fragmentinformationen über Zielverbindungen in komplexen Proben als MS/MS in Q-TOF-MS. Daher ist die Anwendung derMSN-Technologie auf die Strukturidentifikation in der TCM unerlässlich.
Die tibetische Medizin ist ein bedeutender Bestandteil der TCM13, und diese Arzneimittel werden hauptsächlich aus Tieren, Pflanzen und Mineralien gewonnen, die im Plateaugebiet14 vorkommen. Die tibetische Medizin Abelmoschus manihot Samen (AMS) ist der Samen von Abelmoschus manihot (linn.) medicus. AMS ist ein traditionelles pflanzliches Arzneimittel, das zur Behandlung von Erkrankungen wie Neurodermitis, Rheuma und Lepra eingesetzt wird. Es enthält Chalkon, das antibakterielle, antimykotische, krebshemmende, antioxidative und entzündungshemmende Wirkungen besitzt15. In der vorliegenden Arbeit wurden dieMS-n-Verfahren verbessert und eine detaillierte Methode zur Identifizierung von Substanzstrukturen in der tibetischen Medizin AMS mittels IT-MS und MSn entwickelt. Bestimmte MS-Parameter, einschließlich des Ionenmodus, der Scanreichweite und des Kollisionsmodus, wurden optimiert, um Probleme bei der Identifizierung von Spurenverbindungen zu überwinden. Ziel dieser Studie ist es, die standardisierte Strukturidentifikation von Spurenstoffen in der TCM zu fördern.
Protocol
Representative Results
Discussion
IT-MS und seineMS-n-Technologie bieten einen neuen Ansatz zur Identifizierung der Struktur von TCM-Spurenverbindungen. Im Gegensatz zu Q-TOF-MS, das die Fragmentionen nicht tief identifizieren konnte, zeichnet sich die IT-MS mit MSn-Technologie durch ihre Fähigkeit aus, Ionen zu isolieren und zu akkumulieren. Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Identifizierung von Spurenstoffen in der tibetischen Medizin mit Hilfe der IT-MS- undMS-n-Technik . Die Methode verwendet den n-Wert in MS…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das Xinglin Talent Program der Chengdu University of TCM (Nr. 030058191), die Nature Science Foundation of Sichuan (2022NSFSC1470) und die National Natural Science Foundation of China (82204765) finanziert.
Materials
| Acetonitrile | Thermo Scientific | CAS 75-05-8 | LC-MS grade |
| Formic Acid | Knowles | CAS 64-18-6 | HPLC grade |
| Linear ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL | |
| liquid chromatograph | Thermo Scientific | U3000 | |
| LTQ Tune | Thermo Scientific | version 2.8.0 | MS control software |
| Methanol | Thermo Scientific | CAS 67-56-1 | LC-MS grade |
| Pure water | Thermo Scientific | CAS 7732-18-5 | LC-MS grade |
| Xcalibur | Thermo Scientific | version 2.0 | LC-IT-MS operational software |
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