이온 트랩 질량분석법 및 다단계 단편화 분석을 사용한 티베트 의학의 화합물 구조 표준화
Summary
여기에서 우리는 티베트 의학의 복잡한 천연물 제형(매트릭스)에서 미량과 미량 성분을 식별하는 데 적용할 수 있는 일반적인 프로토콜과 디자인을 설명합니다.
Abstract
티베트 의약품은 복잡하고 알려지지 않은 수많은 화합물을 포함하고 있어 분자 구조에 대한 심층 연구가 중요합니다. 액체 크로마토그래피-전기분무 이온화 비행 시간 질량 분석법(LC-ESI-TOF-MS)은 일반적으로 티베트 의약품을 추출하는 데 사용됩니다. 그러나 스펙트럼 데이터베이스를 사용한 후에도 예측할 수 없는 많은 알려지지 않은 화합물이 남아 있습니다. 본 논문은 이온 트랩 질량 분석법(IT-MS)을 사용하여 티베트 의학의 성분을 식별하는 보편적인 방법을 개발했습니다. 이 분석법에는 시료 전처리, MS 세팅, LC 프리런, 분석법 확립, MS 획득, 다단계 MS 작동 및 수동 데이터 분석을 위한 표준화되고 프로그래밍된 프로토콜이 포함됩니다. 티베트 의약 Abelmoschus manihot 종자의 두 가지 대표적인 화합물은 전형적인 화합물 구조에 대한 상세한 분석과 함께 다단계 단편화를 사용하여 확인되었습니다. 또한 이 기사에서는 이온 모드 선택, 이동상 조정, 스캔 범위 최적화, 충돌 에너지 제어, 충돌 모드 전환, 단편화 요인 및 방법의 한계와 같은 측면에 대해 설명합니다. 개발 된 표준화 된 분석 방법은 보편적이며 티베트 의학에서 알려지지 않은 화합물에 적용 할 수 있습니다.
Introduction
중국 전통 의학(TCM)에서 미량 성분의 정성 분석은 연구에서 중요한 주제가 되었습니다. TCM에는 화합물의 수가 많기 때문에 핵자기 공명 분광계(NMR) 또는 X선 회절계(XRD) 분석을 위해 이들을 분리하기가 어렵기 때문에 적은 양의 시료만 필요한 질량 분석법(MS) 기반 방법이 점점 인기를 얻고 있습니다. 또한, MS와 결합된 액체 크로마토그래피(LC)는 복잡한 시료의 분리 및 화합물의 정성 분석을 개선하기 위해 최근 몇 년 동안 TCM 연구에서 널리 사용되었습니다1. 한 가지 일반적인 방법은 액체 크로마토그래피-전기분무 이온화 비행 시간 질량분석법(LC-ESI-TOF-MS)으로, 티베트 의학에 대한 질적 연구에 널리 사용된다2. 이 방법을 사용하면 복잡한 성분이 LC 컬럼에서 농축 및 분리되고 MS 검출기를 사용하여 부가물 이온의 질량 대 전하 비율(m/z)을 관찰할 수 있습니다. 탠덤 MS(MS/MS 또는 MS2) 데이터베이스 검색은 현재 Quadrupole Time-of-Flight(Q-TOF) MS 및 Orbitrap MS3을 사용한 소분자 분석에서 신뢰할 수 있는 화합물 주석을 위한 가장 빠른 접근 방식입니다. 그러나 데이터베이스의 품질이 좋지 않고 다양한 이성질체가 존재하기 때문에 알려지지 않은 화합물의 식별이 방해를 받습니다. 또한, MS/MS 데이터베이스에 의해 제공되는 정보는제한된다(4,5,6,7). 다른 TCM에 널리 적용될 수 있는 일반적인 프로토콜을 사용하여 각 TCM의 화합물을 조사하는 것이 중요합니다.
IT-MS는 링 전극(8)에 상이한 무선 주파수(RF) 전압을 인가함으로써 광범위한 이온을 포획한다. IT-MS는 다양한 연대순으로 시계열 다단계 MS 스캔을 수행하여 성분 다단계 MS(MS n) 단편화를 제공할 수 있으며, 여기서n은 생성 이온 단계9의 수입니다. 선형 IT-MS는 순차적 MSn 실험에 사용될 수 있기 때문에 구조 식별에 가장 적합한 것으로 간주됩니다10. 표적 이온은 선형 IT-MS1에서 분리 및 축적될 수 있습니다. IT-MS의 MS n(n ≥ 3)은 Q-TOF-MS의 MS/MS보다 더 많은 단편 정보를 제공한다. IT-MS는 표적 이온과 그 단편 이온을 잠글 수 없기 때문에 이성질체1을 포함한 미지의 화합물의 구조 규명을 위한 강력한 도구입니다. MSn 기술은 미지의 단백질, 펩타이드 및 다당류의 구조 분석에 널리 적용되어 왔다11,12. MSn의 단편 이온의 풍부도 수준은 Q-TOF-MS의 MS/MS보다 복잡한 샘플의 표적 화합물에 대한 더 많은 분자 단편 정보를 제공합니다. 따라서 TCM의 구조 식별에 MSn 기술을 적용하는 것이 필수적입니다.
티베트 의학은 TCM13의 중요한 구성 요소이며, 이러한 의약품은 주로 고원 지역14에서 발견되는 동물, 식물 및 광물에서 파생됩니다. 티베트 약인 Abelmoschus manihot seeds (AMS)는 Abelmoschus manihot (linn.) medicus의 씨앗입니다. AMS는 아토피 피부염, 류머티즘 및 나병과 같은 상태를 치료하는 데 사용되는 전통 약초입니다. 항균, 항진균, 항암, 항산화, 항염 효과가 있는 칼콘이 함유되어 있다15. 본 연구에서는 MS n 절차를 개선하고, IT-MS 및 MSn을 이용하여 티베트 의약 AMS의 화합물 구조를 규명하기 위한 상세한 방법을 개발하였다. 이온 모드, 스캐닝 범위 및 충돌 모드를 포함한 특정 MS 파라미터는 미량 화합물 식별 문제를 극복하기 위해 최적화되었습니다. 이 연구는 TCM에서 미량 화합물의 표준화된 구조 식별을 촉진하는 것을 목표로 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
IT-MS와 MSn 기술은 미량 TCM 화합물의 구조를 식별하는 새로운 접근 방식을 제공합니다. 단편 이온을 깊이 식별할 수 없는 Q-TOF-MS와 달리 MSn 기술이 적용된 IT-MS는 이온을 분리하고 축적하는 능력으로 인해 탁월합니다. 이 기사에서는 IT-MS 및 MSn 기술을 사용하여 티베트 의학에서 미량 화합물을 식별하는 방법을 간략하게 설명합니다. 상기 방법은 제공된 단편 이온 정보의 양?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 청두 중의학대학교의 Xinglin Talent Program(No. 030058191), 쓰촨성 자연과학재단(2022NSFSC1470) 및 중국 국립자연과학재단(82204765)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Acetonitrile | Thermo Scientific | CAS 75-05-8 | LC-MS grade |
| Formic Acid | Knowles | CAS 64-18-6 | HPLC grade |
| Linear ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL | |
| liquid chromatograph | Thermo Scientific | U3000 | |
| LTQ Tune | Thermo Scientific | version 2.8.0 | MS control software |
| Methanol | Thermo Scientific | CAS 67-56-1 | LC-MS grade |
| Pure water | Thermo Scientific | CAS 7732-18-5 | LC-MS grade |
| Xcalibur | Thermo Scientific | version 2.0 | LC-IT-MS operational software |
Referências
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