Стандартизированная идентификация структуры соединений в тибетской медицине с использованием масс-спектрометрии ионных ловушек и многоступенчатого фрагментационного анализа
Summary
Здесь мы описываем общий протокол и дизайн, которые могут быть применены для идентификации следовых количеств и второстепенных компонентов в сложных составах натуральных продуктов (матрицах) в тибетской медицине.
Abstract
Тибетские лекарства сложны и содержат множество неизвестных соединений, что делает углубленное исследование их молекулярных структур критически важным. Жидкостная хроматография-электрораспылительная ионизационная времяпролетная масс-спектрометрия (LC-ESI-TOF-MS) обычно используется для извлечения тибетской медицины; Тем не менее, многие непредсказуемые неизвестные соединения остаются после использования базы данных спектра. В настоящей статье разработан универсальный метод идентификации компонентов в тибетской медицине с использованием масс-спектрометрии ионных ловушек (ИТ-МС). Метод включает в себя стандартизированные и запрограммированные протоколы для пробоподготовки, настройки МС, предварительного запуска LC, установления метода, сбора МС, многоступенчатой работы МС и ручного анализа данных. Два репрезентативных соединения в тибетской медицине Abelmoschus manihot seeds были идентифицированы с использованием многоступенчатой фрагментации с подробным анализом типичных структур соединений. Кроме того, в статье рассматриваются такие аспекты, как выбор ионной моды, регулировка подвижной фазы, оптимизация диапазона сканирования, управление энергией столкновения, переключение режима столкновения, коэффициенты фрагментации и ограничения метода. Разработанный стандартизированный метод анализа является универсальным и может быть применен к неизвестным соединениям в тибетской медицине.
Introduction
Качественный анализ микрокомпонентов в традиционной китайской медицине (ТКМ) стал важной темой в исследованиях. Из-за большого количества соединений в ТКМ их трудно выделить для анализа спектрометра ядерного магнитного резонанса (ЯМР) или рентгеновского дифрактометра (XRD), что делает методы на основе масс-спектрометрии (МС), требующие только небольших объемов образцов, все более популярными. Кроме того, жидкостная хроматография (ЖК) в сочетании с МС широко используется в исследованиях ТКМ в последние годы для улучшения разделения сложных образцов и качественного анализа химических соединений1. Одним из распространенных методов является времяпролетная масс-спектрометрия жидкостной хроматографии и ионизации электрораспылением (LC-ESI-TOF-MS), которая широко используется в качественных исследованиях тибетской медицины2. С помощью этого метода сложные компоненты обогащаются и разделяются в колонке LC, а отношение массы к заряду (m/z) ионов аддукта наблюдается с помощью детектора MS. Поиск в тандемных базах данных MS (MS/MS или MS2) в настоящее время является самым быстрым подходом к уверенным аннотациям соединений в низкомолекулярном анализе с использованием квадрупольного времяпролетного (Q-TOF) MS и Orbitrap MS3. Однако низкое качество баз данных и наличие различных изомеров препятствуют идентификации неизвестных соединений. Кроме того, информация, предоставляемая базой данных MS/MS, ограничена 4,5,6,7. Важно исследовать химические соединения в каждой ТКМ с использованием общего протокола, который может быть широко применен к другим ТКМ.
IT-MS улавливает широкий спектр ионов, подавая различные радиочастотные (РЧ) напряжения на кольцевые электроды8. IT-MS может выполнять многоступенчатое сканирование MS временных рядов в различных хронологических порядках, обеспечивая фрагментацию многоступенчатого MS ингредиентов (MS n), гдеn – количество стадий9 ионов продукта. Линейный IT-MS считается лучшим для идентификации структуры, так как его можно использовать для последовательных экспериментовMS n 10. Целевые ионы могут быть выделены и накоплены в линейном IT-MS1. MSn (n ≥ 3) в IT-MS предоставляет больше информации о фрагментах, чем MS/MS в Q-TOF-MS. Поскольку IT-MS не может блокировать ион-мишень и его фрагментированные ионы, он является мощным инструментом для выяснения структуры неизвестных соединений, включая изомеры1. Технология MSn широко применяется для структурного анализа неизвестных белков, пептидов и полисахаридов11,12. Уровень содержания фрагментных ионов в MSn обеспечивает больше информации о молекулярных фрагментах целевых соединений в сложных образцах, чем MS / MS в Q-TOF-MS. Следовательно, применение технологии MSn для структурной идентификации в ТКМ имеет важное значение.
Тибетская медицина является важным компонентом TCM13, и эти лекарства в основном получены из животных, растений и минералов, найденных в районе плато14. Тибетская медицина Abelmoschus manihot seeds (AMS) – это семя Abelmoschus manihot (linn.) medicus. AMS — это традиционная фитотерапия, используемая для лечения таких состояний, как атопический дерматит, ревматизм и проказа. Он содержит халкон, который обладает антибактериальным, противогрибковым, противоопухолевым, антиоксидантным и противовоспалительным действием15. В настоящемисследовании были усовершенствованы процедуры MSN, и был разработан подробный метод идентификации сложных структур в AMS тибетской медицины с использованием IT-MS и MSn. Некоторые параметры MS, включая ионный режим, дальность сканирования и режим столкновения, были оптимизированы для преодоления проблем с идентификацией следовых соединений. Это исследование направлено на содействие стандартизированной идентификации структуры следовых соединений в ТКМ.
Protocol
Representative Results
Discussion
IT-MS и его технология MSn предлагают новый подход к идентификации структуры следовых соединений ТКМ. В отличие от Q-TOF-MS, который не мог глубоко идентифицировать фрагменты ионов, IT-MS с технологией MSn выделяется своей способностью изолировать и накапливать ионы. В этой статье опи?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась Программой талантов Синлинь Чэндуского университета ТКМ (No 030058191), Фондом естественных наук провинции Сычуань (2022NSFSC1470) и Национальным фондом естественных наук Китая (82204765).
Materials
| Acetonitrile | Thermo Scientific | CAS 75-05-8 | LC-MS grade |
| Formic Acid | Knowles | CAS 64-18-6 | HPLC grade |
| Linear ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL | |
| liquid chromatograph | Thermo Scientific | U3000 | |
| LTQ Tune | Thermo Scientific | version 2.8.0 | MS control software |
| Methanol | Thermo Scientific | CAS 67-56-1 | LC-MS grade |
| Pure water | Thermo Scientific | CAS 7732-18-5 | LC-MS grade |
| Xcalibur | Thermo Scientific | version 2.0 | LC-IT-MS operational software |
Referências
- Chen, X. -. F., Wu, H. -. T., Tan, G. -. G., Zhu, Z. -. Y., Chai, Y. -. F. Liquid chromatography coupled with time-of-flight and ion trap mass spectrometry for qualitative analysis of herbal medicines. Journal of Pharmaceutical Analysis. 1 (4), 235-245 (2011).
- Ou, C., et al. Systematically investigating the pharmacological mechanism of Dazhu Hongjingtian in the prevention and treatment of acute mountain sickness by integrating UPLC/Q-TOF-MS/MS analysis and network pharmacology. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 179, 113028 (2020).
- Kind, T., et al. Identification of small molecules using accurate mass MS/MS search. Mass Spectrometry Reviews. 37 (4), 513-532 (2018).
- Phetsanthad, A., Vu, N. Q., Li, L. Multi-faceted mass spectrometric investigation of neuropeptides in Callinectes sapidus. Journal of Visualized Experiments. (183), e63322 (2022).
- Seetaloo, N., Phillips, J. J. Millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions. Journal of Visualized Experiments. (184), e64050 (2022).
- Karas, B. F., et al. Dose uptake of platinum-and ruthenium-based compound exposure in zebrafish by inductively coupled plasma mass spectrometry with broader applications. Journal of Visualized Experiments. (182), e6358 (2022).
- Chang, H. -. L., et al. Uracil-DNA glycosylase assay by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments. (182), e63089 (2022).
- Wang, S., et al. Structural characterization and identification of major constituents in Jitai tablets by high-performance liquid chromatography/diode-array detection coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry. Molecules. 17 (9), 10470-10493 (2012).
- Pang, B., Zhu, Y., Lu, L., Gu, F., Chen, H. The applications and features of liquid chromatography-mass spectrometry in the analysis of traditional Chinese medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2016, 3837270 (2016).
- Ichou, F., et al. Comparison of the activation time effects and the internal energy distributions for the CID, PQD and HCD excitation modes. Journal of Mass Spectrometry. 49 (6), 498-508 (2014).
- Fu, X., et al. Suppression of oligomer formation in glucose dehydration by CO2 and tetrahydrofuran. Green Chemistry. 19 (14), 3334-3343 (2017).
- Fu, X., et al. Solvent effects on degradative condensation side reactions of fructose in its initial conversion to 5-Hydroxymethylfurfural. ChemSusChem. 13 (3), 501-512 (2020).
- Yang, S., Wang, Z., Zhao, H., Ren, X. Modern research of Tibetan medicine. World Journal of Traditional Chinese Medicine. 5 (2), 131-138 (2019).
- Shang, X., et al. Ethno-veterinary survey of medicinal plants in Ruoergai region, Sichuan province, China. Journal of Ethnopharmacology. 142 (2), 390-400 (2012).
- Su, J., et al. Chalcone derivatives from Abelmoschus manihot seeds restrain NLRP3 inflammasome assembly by inhibiting ASC oligomerization. Frontiers in Pharmacology. 13, 932198 (2022).
- Fu, X., et al. Mapping out the reaction network of humin formation at the initial stage of fructose dehydration in water. Green Energy & Environment. , (2022).
- Hua, Y., Jenke, D. Increasing the sensitivity of an LC-MS method for screening material extracts for organic extractables via mobile phase optimization. Journal of Chromatographic Science. 50 (3), 213-227 (2012).
- Kumar, S., Singh, A., Bajpai, V., Kumar, B. Identification characterization and distribution of monoterpene indole alkaloids in Rauwolfia species by Orbitrap Velos Pro mass spectrometer. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 118, 183-194 (2016).
- Bayat, P., Lesage, D., Cole, R. B. Tutorial: Ion activation in tandem mass spectrometry using ultra-high resolution instrumentation. Mass Spectrometry Reviews. 39 (5-6), 680-702 (2020).
- Wu, S. -. L., et al. Mass spectrometric determination of disulfide linkages in recombinant therapeutic proteins using online LC−MS with electron-transfer dissociation. Analytical Chemistry. 81 (1), 112-122 (2009).
- Echterbille, J., Quinton, L., Gilles, N., De Pauw, E. Ion mobility mass spectrometry as a potential tool to assign disulfide bonds arrangements in peptides with multiple disulfide bridges. Analytical Chemistry. 85 (9), 4405-4413 (2013).
