Efficiënte vascularisatie van nierorganoïden door intracelomische transplantatie in kippenembryo's
Summary
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de transplantatie van nierorganoïden in de celomische holte van kippenembryo’s. Deze methode induceert vascularisatie en verbeterde rijping van de organoïden binnen 8 dagen en kan worden gebruikt om deze processen op een efficiënte manier te bestuderen.
Abstract
Nierorganoïden afgeleid van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen bevatten nefronachtige structuren die tot op zekere hoogte lijken op die in de volwassen nier. Helaas wordt hun klinische toepasbaarheid belemmerd door het ontbreken van een functionele vasculatuur en bijgevolg beperkte rijping in vitro. De transplantatie van nierorganoïden in de celomische holte van kippenembryo’s induceert vascularisatie door geperfuseerde bloedvaten, inclusief de vorming van glomerulaire haarvaten, en verbetert hun rijping. Deze techniek is zeer efficiënt, waardoor de transplantatie en analyse van grote aantallen organoïden mogelijk is. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor de intracelomische transplantatie van nierorganoïden in kippenembryo’s, gevolgd door de injectie van fluorescerend gelabeld lectine om de perfuseerde vasculatuur te kleuren en de verzameling getransplanteerde organoïden voor beeldvormingsanalyse. Deze methode kan worden gebruikt om organoïde vascularisatie en rijping te induceren en te bestuderen om aanwijzingen te vinden voor het verbeteren van deze processen in vitro en het verbeteren van ziektemodellering.
Introduction
Van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC)-afgeleide nierorganoïden is aangetoond dat ze potentieel hebben voor ontwikkelingsstudies 1,2,3,4, toxiciteitsscreening 5,6 en ziektemodellering 5,7,8,9,10,11,12,13 . Hun toepasbaarheid voor deze en eventuele klinische transplantatiedoeleinden wordt echter beperkt door het ontbreken van een vasculair netwerk. Tijdens de embryonale nierontwikkeling interageren podocyten, mesangiale cellen en vasculaire endotheelcellen (EC’s) om de ingewikkelde structuur van de glomerulus te vormen. Zonder deze interactie kan de glomerulaire filtratiebarrière, bestaande uit podocyten, het glomerulaire keldermembraan (GBM) en EC’s, zich niet goed ontwikkelen14,15,16. Hoewel nierorganoïden in vitro sommige EC’s bevatten, vormen deze geen goed vasculair netwerk en verminderen ze na verloop van tijd17. Het is dan ook niet verwonderlijk dat de organoïden onvolgroeid blijven. Transplantatie bij muizen induceert vascularisatie en rijping van de nierorganoïden 18,19,20,21. Helaas is dit een arbeidsintensief proces dat niet geschikt is voor de analyse van grote aantallen organoïden.
Kippenembryo’s worden al meer dan een eeuw gebruikt om vascularisatie en ontwikkeling te bestuderen22. Ze zijn gemakkelijk toegankelijk, vereisen weinig onderhoud, missen een volledig functioneel immuunsysteem en kunnen zich normaal ontwikkelen na het openen van de eierschaal23,24,25,26. De transplantatie van organoïden op hun chorioallantoïsche membraan (CAM) heeft aangetoond dat het leidt tot vascularisatie27. De duur van de transplantatie op de CAM, evenals het niveau van rijping van het transplantaat, worden echter beperkt door CAM-vorming, die tot embryonale dag 7 duurt om te voltooien. Daarom is onlangs een methode ontwikkeld om nierorganoïden efficiënt te vasculariseren en rijpen door intracelomische transplantatie in kippenembryo’s28. De celomische holte van kippenembryo’s is sinds de jaren 1930 bekend als een gunstige omgeving voor de differentiatie van embryonale weefsels29,30. Het is vroeg in de embryonale ontwikkeling toegankelijk en maakt een relatief onbeperkte uitbreiding van het transplantaat in alle richtingen mogelijk.
Dit artikel schetst een protocol voor de transplantatie van hiPSC-afgeleide nierorganoïden in de celomische holte van dag 4 kippenembryo’s. Deze methode induceert vascularisatie en verbeterde rijping van de organoïden binnen 8 dagen. Injectie van fluorescerend gelabelde lens culinaris agglutinine (LCA) voorafgaand aan het opofferen van de embryo’s maakt visualisatie van geperfuseerde bloedvaten in de organoïden mogelijk door middel van confocale microscopie.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit manuscript wordt een protocol voor intracelomische transplantatie van hiPSC-afgeleide nierorganoïden in kippenembryo’s gedemonstreerd. Bij transplantatie worden organoïden gevasculariseerd door geperfuseerde bloedvaten die bestaan uit een combinatie van van menselijke organoïden afgeleide en van kippen afgeleide EC’s. Deze zijn verspreid over de organoïde en dringen de glomerulaire structuren binnen, waardoor interactie tussen de EC’s en podocyten mogelijk wordt. Eerder werd aangetoond dat dit leidt tot een ve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken George Galaris (LUMC, Leiden) voor zijn hulp bij de injectie van kippenembryo’s. We erkennen de steun van Saskia van der Wal-Maas (Afdeling Anatomie & Embryologie, LUMC, Leiden, Nederland), Conny van Munsteren (Afdeling Anatomie & Embryologie, LUMC, Leiden, Nederland), Manon Zuurmond (LUMC, Leiden, Nederland) en Annemarie de Graaf (LUMC, Leiden, Nederland). M. Koning wordt ondersteund door ‘Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC’. Dit werk werd mede mogelijk gemaakt door het Leids Universiteits Fonds “Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fonds” GWF2019-02. Dit werk wordt ondersteund door de partners van Regenerative Medicine Crossing Borders (RegMedXB) en Health Holland, Topsector Life Sciences & Health. C.W. van den Berg en T.J. Rabelink worden ondersteund door The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine wordt ondersteund door Novo Nordisk Foundation grants (NNF21CC0073729).
Materials
| 0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | Contains silicone tubes, mouth piece and connector |
| Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope | Leica | TCS SP8 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC091-10 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC090-11 | |
| Dissecting microscope | Wild Heerbrugg | 355110 | |
| Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp | Hammacher Karl | HAMMHSB391-10 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-212-02 | dilution 1:500 |
| Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-21448 | dilution 1:500 |
| Double edged stainless steel razor blades | Electron Microsopy Sciences | 72000 | |
| DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-) | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+) | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Egg cartons or custom made egg holders | NA | NA | |
| Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus) | Drost Loosdrecht B.V. | NA | |
| Incubator | Elbanton BV | ET-3 combi | |
| Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated | Vector Laboratories | B-1325 | dilution 1:300 |
| Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm | Hammacher Karl | HAMMHSB500-09 | |
| Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament | World Precision Instruments | TW150F-3 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Model P-97 | We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200 |
| Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws. | Euronexia | L-120 | |
| Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
| Olivecrona dura dissector 18 cm | Reda | 41146-18 | |
| Parafilm | Heathrow Scientific | HS234526B | |
| Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| Perforated spoon | Euronexia | S-20-P | |
| Petri dish 60 x 15 mm | CELLSTAR | 628160 | |
| Plastic transfer pipettes | ThermoFisher Scientific | PP89SB | |
| Purified mouse anti-human CD31 antibody | BD Biosciences | 555444 | dilution 1:100 |
| Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA) | Vector Laboratories | RL-1042 | This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5) |
| Sheep anti-human NPHS1 antibody | R&D systems | AF4269 | dilution 1:100 |
| Sterile hypodermic needles, 19 G | BD microlance | 301500 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | ThermoFisher Scientific | S32351 | dilution 1:200 |
| Syringe 5 mL | BD Emerald | 307731 | |
| Transparent tape | Tesa | 4124 | Available at most hardware stores |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tungsten wire, 0.25 mm dia | ThermoFisher Scientific | 010404.H2 |
References
- Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Kim, Y. K., et al. Gene-edited human kidney organoids reveal mechanisms of disease in podocyte development. Stem Cells. 35 (12), 2366-2378 (2017).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Hale, L. J., et al. 3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening. Nature Communications. 9 (1), 5167 (2018).
- Vanslambrouck, J. M., et al. Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids. Nature Communications. 13 (1), 5943 (2022).
- Tanigawa, S., et al. Organoids from nephrotic disease-derived iPSCs identify impaired NEPHRIN localization and slit diaphragm formation in kidney podocytes. Stem Cell Reports. 11 (3), 727-740 (2018).
- Forbes, T. A., et al. Patient-iPSC-derived kidney organoids show functional validation of a ciliopathic renal phenotype and reveal underlying pathogenetic mechanisms. American Journal of Human Genetics. 102 (5), 816-831 (2018).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715 (2015).
- Cruz, N. M., et al. Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease. Nature Materials. 16 (11), 1112-1119 (2017).
- Gupta, N., et al. Modeling injury and repair in kidney organoids reveals that homologous recombination governs tubular intrinsic repair. Science Translational Medicine. 14 (634), eabj4772 (2022).
- Hiratsuka, K., et al. Organoid-on-a-chip model of human ARPKD reveals mechanosensing pathomechanisms for drug discovery. Scencei Advances. 8 (38), eabq0866 (2022).
- Dorison, A., et al. Kidney organoids generated using an allelic series of NPHS2 point variants reveal distinct intracellular podocin mistrafficking. Journal of the American Society of Nephrology. , (2022).
- Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. The Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
- Kitamoto, Y., Tokunaga, H., Tomita, K. Vascular endothelial growth factor is an essential molecule for mouse kidney development: glomerulogenesis and nephrogenesis. The Journal of Clinical Investigation. 99 (10), 2351-2357 (1997).
- Sison, K., et al. Glomerular structure and function require paracrine, not autocrine, VEGF-VEGFR-2 signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (10), 1691-1701 (2010).
- Ryan, A. R., et al. Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis. Developmental Biology. 477, 98-116 (2021).
- vanden Berg, C. W., et al. Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
- Sharmin, S., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived podocytes mature into vascularized glomeruli upon experimental transplantation. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1778-1791 (2016).
- Bantounas, I., et al. Generation of functioning nephrons by implanting human pluripotent stem cell-derived kidney progenitors. Stem Cell Reports. 10 (3), 766-779 (2018).
- vanden Berg, C. W., Koudijs, A., Ritsma, L., Rabelink, T. J. In vivo assessment of size-selective glomerular sieving in transplanted human induced pluripotent stem cell-derived kidney organoids. Journal of the American Society of Nephrology. 31 (5), 921-929 (2020).
- Asai, R., Bressan, M., Mikawa, T. Avians as a model system of vascular development. Methods in Molecular Biology. 2206, 103-127 (2021).
- Jankovic, B. D., et al. Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo. Immunology. 29 (3), 497-508 (1975).
- Alkie, T. N., et al. Development of innate immunity in chicken embryos and newly hatched chicks: a disease control perspective. Avian Pathology. 48 (4), 288-310 (2019).
- Rawles, M. E. Transplantation of normal embryonic tissues. Annalls of the New York Academy of Sciences. 55 (2), 302-312 (1952).
- Rawles, M. E. The development of melanophores from embryonic mouse tissues grown in the coelom of chick embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences. 26 (12), 673-680 (1940).
- Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Materials. 18 (4), 397-405 (2019).
- Koning, M., et al. Vasculogenesis in kidney organoids upon transplantation. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 40 (2022).
- Hamburger, V. Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb primordia of 2-day chick embryos. Journal of Experimental Zoology. 77 (3), 379-399 (1938).
- Dossel, W. E. New method of intracelomic grafting. Science. 120 (3111), 262-263 (1954).
- Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Aleksandrowicz, E., Herr, I. Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo. ALTEX. 32 (2), 143-147 (2015).
- . ACUC. Guideline: The Use and Euthanasia Procedures of Chicken/Avian Embryos. , (2012).
