ニワトリ胚の脳内移植による腎オルガノイドの効率的な血管新生
Summary
ここでは、ニワトリ胚のセロミック腔への腎臓オルガノイドの移植のための詳細なプロトコルを提示します。この方法は、8日以内にオルガノイドの血管新生と成熟の促進を誘発し、これらのプロセスを効率的に研究するために使用できます。
Abstract
ヒト人工多能性幹細胞由来の腎臓オルガノイドは、成人腎臓のネフロン様構造にある程度類似した構造を持っています。残念ながら、それらの臨床的適用性は、機能的な血管系の欠如、およびその結果としてのin vitroでの成熟の制限によって妨げられています。ニワトリ胚のセロミック腔への腎臓オルガノイドの移植は、糸球体毛細血管の形成を含む灌流血管による血管新生を誘発し、それらの成熟を促進する。この技術は非常に効率的であり、多数のオルガノイドの移植と分析を可能にします。この論文では、ニワトリ胚における腎臓オルガノイドの細胞内移植、それに続く灌流血管系を染色するための蛍光標識レクチンの注入、およびイメージング分析のための移植オルガノイドの収集のための詳細なプロトコルについて説明します。この方法は、オルガノイドの血管新生と成熟を誘導および研究するために使用でき、 in vitro でこれらのプロセスを強化し、疾患モデリングを改善するための手がかりを見つけることができます。
Introduction
ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)由来の腎臓オルガノイドは、発生研究1,2,3,4、毒性スクリーニング5,6、および疾患モデリング5,7,8,9,10,11,12,13の可能性があることを示しています。.しかしながら、これらおよび最終的な臨床移植目的へのそれらの適用性は、血管網の欠如によって制限される。胚性腎臓の発生中、足細胞、メサンギウム細胞、および血管内皮細胞(EC)が相互作用して糸球体の複雑な構造を形成します。この相互作用がなければ、足細胞、糸球体基底膜(GBM)、およびECからなる糸球体濾過バリアは、適切に発達することができません14,15,16。in vitroの腎臓オルガノイドにはいくつかのECが含まれていますが、これらは適切な血管網を形成できず、時間の経過とともに減少します17。したがって、オルガノイドが未熟なままであることは驚くべきことではありません。マウスにおける移植は、腎臓オルガノイドの血管新生および成熟を誘導する18、19、20、21。残念ながら、これは労働集約的なプロセスであり、多数のオルガノイドの分析には適していません。
ニワトリ胚は、1世紀以上にわたって血管新生と発生の研究に使用されてきました22。それらは容易にアクセスでき、低メンテナンスを必要とし、完全に機能する免疫システムを欠いており、卵殻23,24,25,26を開いた後に正常に発達する可能性があります。絨毛尿膜(CAM)へのオルガノイドの移植は、血管新生につながることが示されています27。しかしながら、CAM上の移植期間、ならびに移植片の成熟レベルは、CAM形成によって制限され、それは胚の7日目まで完了する。そこで、最近、ニワトリ胚のセロム内移植により、腎臓オルガノイドを効率的に血管新生・成熟させる方法が開発されました28。ニワトリ胚のセロミック腔は、1930年代から胚組織の分化に好ましい環境であることが知られている29,30。それは胚発生の早い段階でアクセスすることができ、移植片の全方向への比較的無制限の拡大を可能にする。
この論文は、4日目のニワトリ胚のセロミック腔へのhiPSc由来腎臓オルガノイドの移植のためのプロトコルを概説します。この方法は、8日以内に血管新生を誘導し、オルガノイドの成熟を促進します。胚を犠牲にする前に蛍光標識された水晶体凝集素(LCA)を注入することで、共焦点顕微鏡によるオルガノイド内の灌流血管の可視化が可能になります。
Protocol
Representative Results
Discussion
この原稿では、ニワトリ胚におけるhiPS細胞由来腎臓オルガノイドの細胞内移植のためのプロトコルが実証されています。移植時に、オルガノイドは、ヒトオルガノイド由来ECとニワトリ由来ECの組み合わせからなる灌流血管によって血管新生されます。これらはオルガノイド全体に広がり、糸球体構造に侵入し、ECと足細胞間の相互作用を可能にします。これがオルガノイド糸球体および管状…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ジョージ・ガラリス(LUMC、ライデン、オランダ)の鶏胚注入に協力してくれたことに感謝します。Saskia van der Wal-Maas(LUMC、ライデン、オランダ、解剖学および発生学部門)、Conny van Munsteren(LUMC、ライデン、オランダ)、Manon Zuurmond(LUMC、ライデン、オランダ)、およびAnnemarie de Graaf(LUMC、ライデン、オランダ)の支援に感謝します。M. Koning is supported by ‘Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC’.この研究の一部は、ライデン大学基金「Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fund」GWF2019-02の支援を受けました。この研究は、Regenerative Medicine Crossing Borders(RegMedXB)とHealth Holland、Top Sector Life Sciences & Healthのパートナーによってサポートされています。C.W. van den BergとT.J. Rabelinkは、ノボ ノルディスク財団幹細胞医学センター(reNEW)の支援を受けており、ノボ ノルディスク財団幹細胞医学センターは、ノボ ノルディスク財団の助成金(NNF21CC0073729)の支援を受けています。
Materials
| 0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | Contains silicone tubes, mouth piece and connector |
| Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope | Leica | TCS SP8 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC091-10 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC090-11 | |
| Dissecting microscope | Wild Heerbrugg | 355110 | |
| Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp | Hammacher Karl | HAMMHSB391-10 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-212-02 | dilution 1:500 |
| Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-21448 | dilution 1:500 |
| Double edged stainless steel razor blades | Electron Microsopy Sciences | 72000 | |
| DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-) | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+) | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Egg cartons or custom made egg holders | NA | NA | |
| Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus) | Drost Loosdrecht B.V. | NA | |
| Incubator | Elbanton BV | ET-3 combi | |
| Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated | Vector Laboratories | B-1325 | dilution 1:300 |
| Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm | Hammacher Karl | HAMMHSB500-09 | |
| Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament | World Precision Instruments | TW150F-3 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Model P-97 | We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200 |
| Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws. | Euronexia | L-120 | |
| Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
| Olivecrona dura dissector 18 cm | Reda | 41146-18 | |
| Parafilm | Heathrow Scientific | HS234526B | |
| Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| Perforated spoon | Euronexia | S-20-P | |
| Petri dish 60 x 15 mm | CELLSTAR | 628160 | |
| Plastic transfer pipettes | ThermoFisher Scientific | PP89SB | |
| Purified mouse anti-human CD31 antibody | BD Biosciences | 555444 | dilution 1:100 |
| Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA) | Vector Laboratories | RL-1042 | This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5) |
| Sheep anti-human NPHS1 antibody | R&D systems | AF4269 | dilution 1:100 |
| Sterile hypodermic needles, 19 G | BD microlance | 301500 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | ThermoFisher Scientific | S32351 | dilution 1:200 |
| Syringe 5 mL | BD Emerald | 307731 | |
| Transparent tape | Tesa | 4124 | Available at most hardware stores |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tungsten wire, 0.25 mm dia | ThermoFisher Scientific | 010404.H2 |
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