Effektiv vaskularisering av nyreorganoider gjennom intracelomisk transplantasjon i kyllingembryoer
Summary
Her presenterer vi en detaljert protokoll for transplantasjon av nyreorganoider i det celomiske hulrommet av kyllingembryoer. Denne metoden induserer vaskularisering og forbedret modning av organoider innen 8 dager og kan brukes til å studere disse prosessene på en effektiv måte.
Abstract
Nyreorganoider avledet fra humane induserte pluripotente stamceller inneholder nefronlignende strukturer som ligner de i den voksne nyren til en viss grad. Dessverre hemmes deres kliniske anvendelighet av mangelen på en funksjonell vaskulatur og følgelig begrenset modning in vitro. Transplantasjonen av nyreorganoider i det celomiske hulrommet av kyllingembryoer induserer vaskularisering av perfuserte blodkar, inkludert dannelsen av glomerulære kapillærer, og forbedrer modningen. Denne teknikken er svært effektiv, noe som muliggjør transplantasjon og analyse av et stort antall organoider. Dette papiret beskriver en detaljert protokoll for intracelomisk transplantasjon av nyreorganoider i kyllingembryoer, etterfulgt av injeksjon av fluorescerende merket lektin for å flekke den perfuserte vaskulaturen, og samlingen av transplanterte organoider for avbildningsanalyse. Denne metoden kan brukes til å indusere og studere organoid vaskularisering og modning for å finne ledetråder for å forbedre disse prosessene in vitro og forbedre sykdomsmodellering.
Introduction
Humaninduserte pluripotente stamceller (hiPSC)-avledede nyreorganoider har vist seg å ha potensial for utviklingsstudier 1,2,3,4, toksisitetsscreening 5,6 og sykdomsmodellering 5,7,8,9,10,11,12,13 . Imidlertid er deres anvendelighet for disse og eventuelle kliniske transplantasjonsformål begrenset av mangelen på et vaskulært nettverk. Under embryonal nyreutvikling samhandler podocytter, mesangialceller og vaskulære endotelceller (EC) for å danne den intrikate strukturen til glomerulus. Uten denne interaksjonen kan den glomerulære filtreringsbarrieren, bestående av podocytter, den glomerulære kjellermembranen (GBM) og ECs, ikke utvikle seg riktig14,15,16. Selv om nyreorganoider in vitro inneholder noen EC, klarer disse ikke å danne et skikkelig vaskulært nettverk og avtar over tid17. Det er derfor ikke overraskende at organoidene forblir umodne. Transplantasjon hos mus induserer vaskularisering og modning av nyreorganoider 18,19,20,21. Dessverre er dette en arbeidsintensiv prosess som er uegnet for analyse av et stort antall organoider.
Kyllingembryoer har blitt brukt til å studere vaskularisering og utvikling i over et århundre22. De er lett tilgjengelige, krever lite vedlikehold, mangler et fullt funksjonelt immunsystem, og kan utvikle seg normalt etter åpning av eggeskallet23,24,25,26. Transplantasjon av organoider på deres chorioallantoic membran (CAM) har vist seg å føre til vaskularisering27. Imidlertid er varigheten av transplantasjonen på CAM, så vel som nivået av modning av transplantatet, begrenset av CAM-dannelse, som tar til embryonal dag 7 for å fullføre. Derfor ble det nylig utviklet en metode for effektivt å vaskularisere og modne nyreorganoider gjennom intracelomisk transplantasjon i kyllingembryoer28. Det celomiske hulrommet av kyllingembryoer har vært kjent siden 1930-tallet for å være et gunstig miljø for differensiering av embryonale vev 29,30. Det kan nås tidlig i embryonal utvikling og muliggjør relativt ubegrenset utvidelse av transplantatet i alle retninger.
Denne artikkelen skisserer en protokoll for transplantasjon av hiPSC-avledede nyreorganoider i det celomiske hulrommet på dag 4 kyllingembryoer. Denne metoden induserer vaskularisering og forbedret modning av organoider innen 8 dager. Injeksjon av fluorescerende merket linse culinaris agglutinin (LCA) før ofring av embryoene muliggjør visualisering av perfuserte blodkar i organoider gjennom konfokal mikroskopi.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette manuskriptet er det vist en protokoll for intracelomisk transplantasjon av hiPSC-deriverte nyreorganoider i kyllingembryoer. Ved transplantasjon vaskulariseres organoider av perfuserte blodkar som består av en kombinasjon av humane organoidavledede og kyllingavledede ECer. Disse er spredt over hele organoid og invaderer glomerulære strukturer, noe som muliggjør interaksjon mellom ECs og podocytter. Det er tidligere vist at dette fører til økt modning av organoide, glomerulære og rørformede strukturer<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker George Galaris (LUMC, Leiden, Nederland) for hans hjelp med kyllingembryoinjeksjon. Vi takker støtten fra Saskia van der Wal-Maas (Institutt for anatomi og embryologi, LUMC, Leiden, Nederland), Conny van Munsteren (Institutt for anatomi og embryologi, LUMC, Leiden, Nederland), Manon Zuurmond (LUMC, Leiden, Nederland) og Annemarie de Graaf (LUMC, Leiden, Nederland). M. Koning støttes av ‘Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC’. Dette arbeidet ble delvis støttet av Leiden University Fund “Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fund” GWF2019-02. Dette arbeidet støttes av partnerne til Regenerative Medicine Crossing Borders (RegMedXB) og Health Holland, Top Sector Life Sciences &; Health. C.W. van den Berg og T.J. Rabelink støttes av The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine støttes av tilskudd fra Novo Nordisk Foundation (NNF21CC0073729).
Materials
| 0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | Contains silicone tubes, mouth piece and connector |
| Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope | Leica | TCS SP8 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC091-10 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC090-11 | |
| Dissecting microscope | Wild Heerbrugg | 355110 | |
| Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp | Hammacher Karl | HAMMHSB391-10 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-212-02 | dilution 1:500 |
| Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-21448 | dilution 1:500 |
| Double edged stainless steel razor blades | Electron Microsopy Sciences | 72000 | |
| DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-) | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+) | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Egg cartons or custom made egg holders | NA | NA | |
| Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus) | Drost Loosdrecht B.V. | NA | |
| Incubator | Elbanton BV | ET-3 combi | |
| Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated | Vector Laboratories | B-1325 | dilution 1:300 |
| Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm | Hammacher Karl | HAMMHSB500-09 | |
| Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament | World Precision Instruments | TW150F-3 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Model P-97 | We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200 |
| Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws. | Euronexia | L-120 | |
| Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
| Olivecrona dura dissector 18 cm | Reda | 41146-18 | |
| Parafilm | Heathrow Scientific | HS234526B | |
| Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| Perforated spoon | Euronexia | S-20-P | |
| Petri dish 60 x 15 mm | CELLSTAR | 628160 | |
| Plastic transfer pipettes | ThermoFisher Scientific | PP89SB | |
| Purified mouse anti-human CD31 antibody | BD Biosciences | 555444 | dilution 1:100 |
| Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA) | Vector Laboratories | RL-1042 | This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5) |
| Sheep anti-human NPHS1 antibody | R&D systems | AF4269 | dilution 1:100 |
| Sterile hypodermic needles, 19 G | BD microlance | 301500 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | ThermoFisher Scientific | S32351 | dilution 1:200 |
| Syringe 5 mL | BD Emerald | 307731 | |
| Transparent tape | Tesa | 4124 | Available at most hardware stores |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tungsten wire, 0.25 mm dia | ThermoFisher Scientific | 010404.H2 |
References
- Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Kim, Y. K., et al. Gene-edited human kidney organoids reveal mechanisms of disease in podocyte development. Stem Cells. 35 (12), 2366-2378 (2017).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Hale, L. J., et al. 3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening. Nature Communications. 9 (1), 5167 (2018).
- Vanslambrouck, J. M., et al. Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids. Nature Communications. 13 (1), 5943 (2022).
- Tanigawa, S., et al. Organoids from nephrotic disease-derived iPSCs identify impaired NEPHRIN localization and slit diaphragm formation in kidney podocytes. Stem Cell Reports. 11 (3), 727-740 (2018).
- Forbes, T. A., et al. Patient-iPSC-derived kidney organoids show functional validation of a ciliopathic renal phenotype and reveal underlying pathogenetic mechanisms. American Journal of Human Genetics. 102 (5), 816-831 (2018).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715 (2015).
- Cruz, N. M., et al. Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease. Nature Materials. 16 (11), 1112-1119 (2017).
- Gupta, N., et al. Modeling injury and repair in kidney organoids reveals that homologous recombination governs tubular intrinsic repair. Science Translational Medicine. 14 (634), eabj4772 (2022).
- Hiratsuka, K., et al. Organoid-on-a-chip model of human ARPKD reveals mechanosensing pathomechanisms for drug discovery. Scencei Advances. 8 (38), eabq0866 (2022).
- Dorison, A., et al. Kidney organoids generated using an allelic series of NPHS2 point variants reveal distinct intracellular podocin mistrafficking. Journal of the American Society of Nephrology. , (2022).
- Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. The Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
- Kitamoto, Y., Tokunaga, H., Tomita, K. Vascular endothelial growth factor is an essential molecule for mouse kidney development: glomerulogenesis and nephrogenesis. The Journal of Clinical Investigation. 99 (10), 2351-2357 (1997).
- Sison, K., et al. Glomerular structure and function require paracrine, not autocrine, VEGF-VEGFR-2 signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (10), 1691-1701 (2010).
- Ryan, A. R., et al. Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis. Developmental Biology. 477, 98-116 (2021).
- vanden Berg, C. W., et al. Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
- Sharmin, S., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived podocytes mature into vascularized glomeruli upon experimental transplantation. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1778-1791 (2016).
- Bantounas, I., et al. Generation of functioning nephrons by implanting human pluripotent stem cell-derived kidney progenitors. Stem Cell Reports. 10 (3), 766-779 (2018).
- vanden Berg, C. W., Koudijs, A., Ritsma, L., Rabelink, T. J. In vivo assessment of size-selective glomerular sieving in transplanted human induced pluripotent stem cell-derived kidney organoids. Journal of the American Society of Nephrology. 31 (5), 921-929 (2020).
- Asai, R., Bressan, M., Mikawa, T. Avians as a model system of vascular development. Methods in Molecular Biology. 2206, 103-127 (2021).
- Jankovic, B. D., et al. Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo. Immunology. 29 (3), 497-508 (1975).
- Alkie, T. N., et al. Development of innate immunity in chicken embryos and newly hatched chicks: a disease control perspective. Avian Pathology. 48 (4), 288-310 (2019).
- Rawles, M. E. Transplantation of normal embryonic tissues. Annalls of the New York Academy of Sciences. 55 (2), 302-312 (1952).
- Rawles, M. E. The development of melanophores from embryonic mouse tissues grown in the coelom of chick embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences. 26 (12), 673-680 (1940).
- Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Materials. 18 (4), 397-405 (2019).
- Koning, M., et al. Vasculogenesis in kidney organoids upon transplantation. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 40 (2022).
- Hamburger, V. Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb primordia of 2-day chick embryos. Journal of Experimental Zoology. 77 (3), 379-399 (1938).
- Dossel, W. E. New method of intracelomic grafting. Science. 120 (3111), 262-263 (1954).
- Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Aleksandrowicz, E., Herr, I. Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo. ALTEX. 32 (2), 143-147 (2015).
- . ACUC. Guideline: The Use and Euthanasia Procedures of Chicken/Avian Embryos. , (2012).
