אופטימיזציה של טכנולוגיית עיבוד שמן כבש Epimedii Folium ובדיקת השפעתה על התפתחות עוברית של דגי זברה
Summary
בפרוטוקול זה, טכנולוגיית עיבוד שמן הכבש של Epimedii folium (EF) עברה אופטימיזציה על ידי יישום מתודולוגיית תכנון-תגובה ניסיונית של Box-Behnken, וההשפעה של EF גולמי וממוטב המופק במים על התפתחות עוברית של דגי זברה נחקרה באופן ראשוני.
Abstract
כרפואה סינית מסורתית (TCM), ל- Epimedii folium (EF) יש היסטוריה ברפואה ובמזון בת > 2,000 שנה. מבחינה קלינית, EF מעובד עם שמן כבש משמש לעתים קרובות כתרופה. בשנים האחרונות התרבו בהדרגה הדיווחים על סיכוני בטיחות ותגובות שליליות של מוצרים המשתמשים ב-EF כחומר גלם. עיבוד יכול לשפר ביעילות את הבטיחות של TCM. על פי תיאוריית TCM, עיבוד שמן כבש יכול להפחית את הרעילות של EF ולשפר את ההשפעה המחזקת שלו על הכליות. עם זאת, קיים מחסור במחקר שיטתי והערכה של טכנולוגיית עיבוד שמן כבש EF. במחקר זה, השתמשנו במתודולוגיית משטח התכנון-תגובה הניסיונית Box-Behnken כדי למטב את הפרמטרים העיקריים של טכנולוגיית העיבוד על ידי הערכת התוכן של רכיבים מרובים. התוצאות הראו כי הטכנולוגיה האופטימלית לעיבוד שמן כבש של EF הייתה כדלקמן: חימום שמן הכבש ב 120 ° C ± 10 ° C, הוספת EF גולמי, מוקפץ אותו בעדינות ל 189 ° C ± 10 ° C עד שהוא מבריק באופן שווה, ולאחר מכן להסיר אותו מגניב. על כל 100 ק”ג של EF, יש להשתמש ב-15 ק”ג שמן כבש. הרעילות והטרטוגניות של תמצית מימית של EF מעובד של שמן גולמי ושמן כבש הושוו במודל התפתחותי של עוברים של דגי זברה. התוצאות הראו כי קבוצת העשבים הגולמי הייתה בעלת סיכוי גבוה יותר לגרום לעיוותים בדגי זברה, וריכוז ה-EF הקטלני החצי מקסימלי שלה היה נמוך יותר. לסיכום, טכנולוגיית עיבוד שמן הכבש האופטימלית הייתה יציבה ואמינה, עם חזרתיות טובה. במינון מסוים, התמצית המימית של EF הייתה רעילה להתפתחות עוברים של דגי זברה, והרעילות הייתה חזקה יותר עבור התרופה הגולמית מאשר עבור התרופה המעובדת. התוצאות הראו כי עיבוד שמן כבש הפחית את הרעילות של EF גולמי. ממצאים אלה יכולים לשמש לשיפור האיכות, האחידות והבטיחות הקלינית של EF מעובד בשמן כבש.
Introduction
Epimedii folium (EF) הוא העלים המיובשים של Epimedium brevicornu Maxim., Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.) Maxim., Epimedium pubescens Maxim., או Epimedium koreanum Nakai. EF יכול לשמש לטיפול אוסטאופורוזיס, תסמונת גיל המעבר, גושים בשד, יתר לחץ דם, מחלת לב כלילית, ומחלות אחרות1. כרפואה סינית מסורתית (TCM), ל-EF יש היסטוריה ברפואה ובמזון של יותר מ-2,000 שנה. בשל מחירו הנמוך והשפעתו יוצאת הדופן של חיטוב הכליות, הוא נמצא בשימוש נרחב בתרופות ובמזון בריאות. EF מעובד על ידי הקפצה עם שמן כבש, תהליך שתואר לראשונה בתורת עיבוד ליי גונג שנכתבה על ידי ליי שיאו בתקופת ליו סונג2. היעילות של EF גולמי ו-EF מוקפץ שונה לגמרי. EF גולמי בעיקר מפיג שיגרון, בעוד EF מוקפץ מחמם את הכליות כדי לחזק יאנג3. כיום, EF נמצא בשימוש נרחב כחומר גלם בתרופות ומזון בריאות; ישנם 399 תרופות פטנט סיניות רשומות, תשעה מזונות בריאות מיובאים, ו 455 מזונות בריאות מקומיים עם EF כחומר גלם4. חומר מרפא זה יש לקוחות פוטנציאליים יישום גדול. עם זאת, בשנים האחרונות התרבו הדיווחים על תופעות לוואי ופגיעה בכבד האנושי שנגרמו על ידי מזון בריאות ותרופות פטנט סיניות המשתמשות ב-EF כחומר גלם, ומחקרי רעילות קשורים 5,6,7 דיווחו כי ל-EF כחומר גלם יש סיכוני בטיחות פוטנציאליים.
עיבוד רפואי סיני מתייחס לטכניקות פרמצבטיות שיכולות להפחית או לחסל ביעילות את הרעילות ולשפר את הבטיחות של TCMs. שיטת העיבוד המסורתית של EF היא הקפצה עם שמן כבש, אשר מפחית את הרעילות של EF ומגביר את השפעתו של חימום הכליות וקידום יאנג8. שיטת עיבוד זו כלולה בפרמקופיאה הסינית ובמפרטי עיבוד שונים1. התהליך של EF מוגדר רק כדלקמן: על כל 100 ק”ג של EF, 20 ק”ג שמן שפיר (מזוקק) מתווסף, והוא נורה בעדינות עד אחיד ומבריק1. אין פרמטרים קפדניים של שיטת עיבוד EF בתקנים לעיל, ולכן מפרטי עיבוד מקומיים לא אוחדו כדי לספק עקביות. לכן, זה יהיה שימושי לנהל מחקר שיטתי של תהליך EF. במאמר זה, שיטת משטח התכנון-תגובה הניסיונית Box-Behnken שימשה לאופטימיזציה של טכנולוגיית העיבוד של EF.
התכנון הניסיוני של Box-Behnken הוא שיטה המשמשת בדרך כלל לאופטימיזציה של הגורמים בתהליך. ניתן למטב את פרמטרי החילוץ על ידי קביעת הקשר הפונקציונלי בין גורמים המתאימים למשוואות רגרסיה מרובות לבין ערכי אפקט. לאחרונה, שיטה זו נמצאת בשימוש נרחב לחקר מיצוי TCM 5,6,7 ועיבוד 9,10,11. מחקרים שונים דיווחו על שיטות הכנת TCM הכוללות עיבוד מלח, עיבוד יין והקפצה בעקבות עיצוב Box-Behnken, כגון Psoraleae fructus 12 מעובד במלח, Cnidii fructus13 מעובד יין, ו Cinnamomi ramulus14 קלוי. שיטה זו צמצמה את זמן הבדיקה, דיוק בדיקה גבוה, והיא מתאימה לבדיקות מרובות גורמים ורב-שכבתיים. השיטה פשוטה יותר משיטת בדיקת התכנון האורתוגונלי ומקיפה יותר משיטת התכנון האחיד15. הקשרים המתקבלים יכולים לקבוע את הערך החזוי של כל נקודת בדיקה בטווח הבדיקה, וזה יתרון גדול. מודל דג זברה יכול לשמש כדי לבדוק אם EF הוא פחות רעיל לאחר עיבוד.
במחקרי רעילות TCM, למודל דגי הזברה יש את היתרונות הכפולים של התפוקה הגבוהה של ניסויים בתאים ואת הדמיון לניסויים במכרסמים16. מודל זה מאופיין בגודלו הקטן, קצב השרצה גבוה, מחזור רבייה קצר וקלות הרבייה. ניתן להשתמש במודל בניסויים סינכרוניים בקנה מידה גדול בצלחות תרבית תאים, ומינון התרופה הניסיונית קטן, מחזור הניסוי קצר, העלות נמוכה, וכל תהליך הניסוי קל לצפייה ולתפעול17. עוברי דגי זברה הם שקופים ומתפתחים במהירות. לכן, את הרעילות ואת ההשפעות הטרטוגניות של תרופות על רקמות הקרביים בשלבים התפתחותיים שונים ניתן לראות ישירות תחת מיקרוסקופ18. ההומולוגיה הגנטית בין דגי זברה לבני אדם היא גבוהה עד 85%18. מסלול העברת האותות של דגי זברה דומה לזה של בני אדם18. המבנה הביולוגי והתפקוד הפיזיולוגי של דגי הזברה דומים מאוד לאלה של יונקים18. לכן, מודל דגי זברה לבדיקות סמים יכול לספק חיות ניסוי אמינות וישימות באופן מלא לבני אדם19.
במחקר זה, השתמשנו במתודולוגיית משטח התכנון-תגובה Box-Behnken כדי למטב את הכמות והטמפרטורה של שמן כבש ואת טמפרטורת הטיגון המשמשת בטכנולוגיית עיבוד EF, עם התוכן של icariin, epimedin A, epimedin B, epimedin C ו- baohuoside I כמדדי הערכה. מודל דגי הזברה שימש לחקירה ראשונית של ההשפעה של תמצית מים EF על התפתחות עוברית של דגי זברה לפני ואחרי עיבוד כדי להעריך את השפעת ההנחתה של העיבוד על EF.
Protocol
Representative Results
Discussion
משתנים בלתי תלויים וקביעת רמתם
טכנולוגיית עיבוד EF מתוארת רק במהדורת 2020 של הפרמקופיאה הסינית ובמפרטי עיבוד הרפואה הסינית המקומיים שפורסמו על ידי 26 מחוזות, עיריות ואזורים אוטונומיים ברחבי המדינה1. התיאור כולל את השלבים הבאים: לקיחת שמן כבש וחימום להמסתו, הוספת שברי E…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי פרויקט המחקר המדעי הבסיסי של האקדמיה לרפואה סינית מסורתית של צ’ונגצ’ינג (מספר פרויקט: jbky20200013), פרויקט הנחיית תמריץ ביצועים של מוסדות המחקר המדעי של צ’ונגצ’ינג (מספר פרויקט: cstc2021jxjl 130025), ופרויקט בניית משמעת מפתח של ועדת הבריאות העירונית של צ’ונגצ’ינג של עיבוד Materia Medica הסיני.
Materials
| Acetonitrile | Fisher | 197164 | |
Baohuoside  (B ) |
Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20042402 | |
| Chromatographic column | Waters Corporation | Symmetry C18 | |
| Design Expert software | Stat- Ease Inc., Minneapolis, MN | Trial Version8.0.6.1 | |
| Detector | Waters Corporation | 2998 | |
| Disintegrator | Hefei Rongshida Small Household Appliance Co., Ltd. | S-FS553 | |
| Electronic analytical balance | Mettler-Toledo International Inc. | MS205DU | |
| Epimedin A (EA) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-21112118 | |
| Epimedin B (EB) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20080403 | |
| Epimedin C (EC) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20080310 | |
| Ethanol | Chongqing Chuandong Chemical ( Group ) Co., Ltd. | 20180801 | |
| Graphpad software | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | 6.02 | |
| High Performance Liquid Chromatography (HPLC) | Waters Corporation | 2695 | |
| Icariin | Chengdu Glip Biotechnology Co., Ltd. | 21091401 | |
| Methanol | Chongqing Chuandong Chemical (Group) Co., Ltd. | 20171101 | |
| Microporous membrane | Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd. | 0.22μm | |
| Mutton oil | Kuoshan Zhiniu Fresh Food Store | 20211106 | |
| Office Excel office software | Microsoft | Office Excel 2021 | |
| Pharmacopoeia sieve | Shaoxing Shangyu Huafeng Hardware Instrument Co., Ltd. | R40/3 | |
| Pure water machine | Chongqing Andersen Environmental Protection Equipment Co., Ltd. | AT Sro 10A | |
| Qualitative filter paper | Shanghai Leigu Instrument Co., Ltd. | 18cm | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi 2000 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonics (Shanghai) Co.,Ltd. | BUG25-12 | |
| Zebrafish | China Zebrafish Resource Center (CZRC) | The AB strain |
Referências
- Chinese Pharmacopoeia Commission. . Chinese Pharmacopoeia. Volume I. , (2020).
- Wang, X. T. . Collection of Traditional Chinese Medicine Processing Methods. , (1998).
- Chen, L. L., Jia, X. B., Jia, D. S. Advances in studies on processing mechanism of Epimedii Folium. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 12 (12), 2108-2111 (2010).
- Zhao, W., et al. Optimized extraction of polysaccharides from corn silk by pulsed electric field and response surface quadratic design. Journal of The Science of Food and Agriculture. 91 (12), 2201-2209 (2011).
- Zhao, L. C., et al. The use of response surface methodology to optimize the ultrasound-assisted extraction of five anthraquinones from Rheum palmatum L. Molecules. 16 (7), 5928-5937 (2011).
- Mao, W. H., Han, L. J., Shi, B. Optimization of microwave assisted extraction of flavonoid from Radix Astragali using response surface methodology. Separation Science and Technology. 43 (12), 671-681 (2008).
- Liu, W., et al. Optimization of total flavonoid compound extraction from Gynura medica leaf using response surface methodology and chemical composition analysis. International Journal of Molecular Sciences. 11 (11), 4750-4763 (2010).
- Guo, G. L., et al. Research progress on processing mechanism of Epimedium fried with sheep fat oil based on warming kidney and promoting yang. Journal of Liaoning University of TCM. 22 (07), 1-5 (2020).
- Shen, X. J., Zhou, Q., Sun, L. -. L., Dai, Y. -. P., Yan, X. -. S. Optimization for cutting procedure of astragali radix with Box-Behnken design and response surface method. China Journal of Chinese Materia Medica. 39 (13), 2498-2503 (2014).
- Wang, L. H., et al. Optimization of processing technology of honey wheat bran based on Box-Behnken response surface methodology. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 52 (12), 3538-3543 (2021).
- Zhang, J. B., et al. Study on integrated process of producing area and processing production for Paeoniae Radix Alba based on Box-Behnken response surface methodology. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (18), 5657-5662 (2022).
- Li, N., Zhang, X. M., Yao, Y. Y., Chen, Y. L., Fan, Q. Optimization of processing technology for Psoraleae Fructus by D-optimal response surface methodology with UHPLC. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 39 (05), 42-44 (2022).
- Jia, Y. Q., et al. Optimization of processing technology with wine of Cnidii Fructus by AHP-entropy weight method combined with response surface method. Journal of Chinese Medicinal Materials. 10, 2338-2343 (2022).
- Chen, F. G., et al. Optimization of the baked drying technology of Cinnamomi Ramulus based on CRITIC combined with Box-Behnken response surface method. Journal of Chinese Medicinal Materials. 2022 (08), 1838-1842 (2022).
- Wang, W. D., et al. Optimization extraction of effective constituents from Epimedii Herba based on central composite design-response surface methodology and orthogonal experimental design. Lishizhen Medicine and Materia Medica. 21 (11), 2766-2768 (2010).
- Yang, L., et al. Zebrafish embryos as models for embryotoxic and teratological effects of chemicals. Reproductive Toxicology. 28 (2), 245-253 (2009).
- Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. Zebrafish model in drug safety assessment. Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).
- Jayasinghe, C. D., Jayawardena, U. A. Toxicity assessment of herbal medicine using zebrafish embryos: A systematic review. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2019, 7272808 (2019).
- Scholz, S. Zebrafish embryos as an alternative model for screening of drug induced organ toxicity. Archives of Toxicology. 87 (5), 767-769 (2013).
- Ling, J., et al. Analysis of Folium Epimedium toxicity in combination with Radix Morindae Officinalis based on zebrafish toxicity/metabolism synchronization. Acta Pharmaceutica Sinica. 53 (1), 74 (2018).
- Wang, Y., et al. Tri-n-butyl phosphate delays tissue repair by dysregulating neutrophil function in zebrafish. Toxicology and Applied Pharmacology. 449, 116114 (2022).
- Sheng, Z. L., Li, J. C., Li, Y. H. Optimization of forsythoside extraction from Forsythia suspensa by Box-Behnken design. African Journal of Biotechnology. 10 (55), 11728-11737 (2011).
- Pang, X., et al. Prenylated flavonoids and dihydrophenanthrenes from the leaves of Epimedium brevicornu and their cytotoxicity against HepG2 cells. Natural Product Research. 32 (19), 2253-2259 (2018).
- Zhong, R., et al. The toxicity and metabolism properties of Herba Epimedii flavonoids on laval and adult zebrafish. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2019, 3745051 (2019).
- Zhang, L., et al. Effect of 2" -O-rhamnosyl icariside II, baohuoside I and baohuoside II in Herba Epimedii on cytotoxicity indices in HL-7702 and HepG2 cells. Molecules. 24 (7), 1263 (2019).
- Chen, Y., Yang, R. J., Yu, M., Ding, S. L., Chen, R. Q. Application of response surface methodology in modern production process optimization. Science & Technology Vision. 2016 (19), 36-39 (2016).
- Zhang, Y., et al. Progress in using zebrafish as a toxicological model for traditional Chinese medicine. Journal of Ethnopharmacology. 282, 114638 (2022).
- Oliveira, R., Domingues, I., Grisolia, C. K., Soares, A. M. V. M. Effects of triclosan on zebrafish early-life stages and adults. Environmental Science and Pollution Research. 16 (6), 679-688 (2009).
- Ton, C., Lin, Y., Willett, C. Zebrafish as a model for developmental neurotoxicity testing. Birth Defects Research. Part A, Clinical and Molecular Teratology. 76 (7), 553-567 (2006).
- He, Q., et al. Toxicity induced by emodin on zebrafish embryos. Drug and Chemical Toxicology. 35 (2), 149-154 (2012).
- Chen, Y., et al. Developmental toxicity of muscone on zebrafish embryos. Chinese Journal of Pharmacology and Toxicology. (6), 267-273 (2014).
- He, Y. L., et al. Effects of shikonin on zebrafish’s embryo and angiogenesis. Chinese Traditional Patent Medicine. 38 (2), 241-245 (2016).
- Zhou, Y. . The transformation research on the chemical compositions in the processing of Epimedium. , (2016).
- Xiao, Y. P., Zeng, J., Jiao, L. -. N., Xu, X. -. Y. Review for treatment effect and signaling pathway regulation of kidney-tonifying traditional Chinese medicine on osteoporosis. China Journal of Chinese Materia Medica. 43 (1), 21-30 (2018).
- Wang, R. H. Study on modern pharmacological effects of traditional Chinese medicine for tonifying kidney yang. Journal of Hubei University of Chinese Medicine. 13 (04), 63-66 (2011).
- Luo, L., et al. Advances in the chemical constituents and pharmacological studies of Epimedium. Asia-Pacific Traditional Medicine. 15 (6), 190-194 (2019).
- Liu, S., et al. Effects of icariin on ERβ gene expression and serum estradiol level in ovariectomized rats. Hunan Journal of Traditional Chinese Medicine. 32 (1), 150-152 (2016).
- Liu, Y., et al. Effects of epimedin A on osteoclasts and osteoporotic male mice. Chinese Journal of Veterinary Science. 41 (07), 1359-1364 (2021).
- Liu, Y. L., et al. Effects of icariin and epimedium C on microstructure of bone tissue in glucocorticoid osteoporosis model mice based on Micro-CT technique. Drug Evaluation Research. 43 (09), 1733-1739 (2020).
- Zhan, Y. Evaluation of antiosteoporotic activity for micro amount icariin and epimedin B based on the osteoporosis model using zebrafish. Chinese Pharmaceutical Journal. (24), 30-35 (2014).
- Zhan, Y., Wei, Y. -. J., Sun, E., Xu, F. -. J., Jia, X. -. B. Two-dimensional zebrafish model combined with hyphenated chromatographic techniques for evaluation anti-osteoporosis activity of epimendin A and its metabolite baohuoside I. Acta Pharmaceutica Sinica. 49 (06), 932-937 (2014).
