Оптимизация технологии переработки бараньего масла Epimedii folium и тестирование ее влияния на эмбриональное развитие рыбок данио-рерио
Summary
В этом протоколе технология переработки бараньего масла Epimedii folium (EF) была оптимизирована с применением экспериментальной методологии поверхности Бокса-Бенкена, а также предварительно исследовано влияние сырого и оптимизированного EF, экстрагированного водой, на эмбриональное развитие рыбок данио.
Abstract
Как традиционная китайская медицина (ТКМ), Epimedii folium (EF) имеет историю в медицине и еде, которая насчитывает > 2000 лет. Клинически EF, обработанный бараньим маслом, часто используется в качестве лекарства. В последние годы сообщения о рисках безопасности и побочных реакциях продуктов, в которых EF используется в качестве сырья, постепенно увеличиваются. Обработка может эффективно повысить безопасность ТКМ. Согласно теории ТКМ, обработка бараньего масла может снизить токсичность ЭФ и усилить его тонизирующее действие на почки. Тем не менее, отсутствуют систематические исследования и оценка технологии переработки бараньего масла EF. В этом исследовании мы использовали экспериментальную методологию Бокса-Бенкена для оптимизации ключевых параметров технологии обработки путем оценки содержания нескольких компонентов. Результаты показали, что оптимальная технология обработки бараньего масла EF была следующей: нагревание бараньего масла при 120 °C ± 10 °C, добавление сырого EF, осторожное обжаривание до 189 °C ± 10 °C до тех пор, пока оно не станет равномерно блестящим, а затем удаление и охлаждение. На каждые 100 кг EF следует использовать 15 кг бараньего масла. Токсичность и тератогенность водного экстракта сырого и бараньего масла, обработанного EF, сравнивали в модели развития эмбриона рыбок данио. Результаты показали, что группа сырых трав с большей вероятностью вызывала уродства рыбок данио, а ее полумаксимальная смертельная концентрация EF была ниже. В заключение, оптимизированная технология переработки бараньего масла была стабильной и надежной, с хорошей повторяемостью. В определенной дозе водный экстракт EF был токсичен для развития эмбрионов рыбок данио, и токсичность была сильнее для сырого препарата, чем для обработанного препарата. Результаты показали, что переработка бараньего масла снижает токсичность сырого EF. Эти результаты могут быть использованы для улучшения качества, однородности и клинической безопасности EF, обработанных бараньим маслом.
Introduction
Epimedii folium (EF) — высушенные листья Epimedium brevicornu Maxim., Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.) Maxim., Epimedium pubescens Maxim., или Epimedium koreanum Nakai. EF можно использовать для лечения остеопороза, климактерического синдрома, опухолей молочной железы, гипертонии, ишемической болезни сердца и других заболеваний1. Как традиционная китайская медицина (ТКМ), EF имеет более чем 2000-летнюю историю в медицине и питании. Благодаря своей низкой цене и замечательному эффекту тонизирования почек, он широко используется в лекарствах и здоровом питании. EF обрабатывается путем обжаривания его с бараньим маслом, процесс, впервые описанный в «Теории обработки Лэй Гун», написанной Лэй Сяо в период2 Лю Сун. Эффективность сырого EF и жареного EF совершенно разная. Сырой EF в основном рассеивает ревматизм, тогда как жареный EF согревает почки, усиливая ян3. В настоящее время EF широко используется в качестве сырья в лекарствах и здоровой пище; В Китае зарегистрировано 399 патентованных лекарств, девять импортных продуктов здорового питания и 455 отечественных продуктов здорового питания с EF в качестве сырья4. Этот лекарственный материал имеет большие перспективы применения. Однако в последние годы появляется все больше сообщений о побочных реакциях и повреждении печени человека, вызванных здоровой пищей и китайскими патентованными лекарствами, использующими EF в качестве сырья, и соответствующие исследования токсичности 5,6,7 сообщили, что EF в качестве сырья имеет потенциальные риски для безопасности.
Китайская лекарственная обработка относится к фармацевтическим методам, которые могут эффективно снизить или устранить токсичность и повысить безопасность ТКМ. Традиционным методом обработки EF является обжаривание с бараньим маслом, что снижает токсичность EF и усиливает его эффект согревания почек и стимулирования yang8. Этот метод обработки включен в Китайскую фармакопею и различные спецификации обработки1. Процесс EF определяется только следующим образом: на каждые 100 кг EF добавляется 20 кг амниотического масла (рафинированного), и оно обжигается мягким огнем до однородной и блестящей1. В приведенных выше стандартах нет строгих параметров метода обработки EF, поэтому локальные спецификации обработки не были унифицированы для обеспечения согласованности. Поэтому было бы полезно провести систематическое исследование процесса ЭФ. В данной работе был использован экспериментальный метод поверхности дизайна и отклика Бокса-Бенкена для оптимизации технологии обработки EF.
Экспериментальный дизайн Бокса-Бенкена — это метод, обычно используемый для оптимизации факторов процесса. Параметры извлечения могут быть оптимизированы путем установления функциональной зависимости между несколькими факторами соответствия уравнений регрессии и значениями эффектов. В последнее время этот метод широко используется для изучения экстракцииТКМ 5,6,7 и обработки 9,10,11. В различных исследованиях сообщалось о методах приготовления ТКМ, включающих обработку соли, обработку вина и жарку в соответствии с дизайном Box-Behnken, например, для обработанного солью Psoraleae fructus 12, обработанного вином Cnidii fructus13 и жареного Cinnamomi ramulus14. Этот метод имеет сокращенное время тестирования, высокую точность тестирования и подходит для многофакторных и многоуровневых тестов. Этот метод является более простым, чем метод испытания ортогонального дизайна, и более всеобъемлющим, чем метод15 однородного проектирования. Полученные соотношения позволяют определить прогнозируемое значение любой контрольной точки в пределах тестового диапазона, что является большим преимуществом. Модель рыбок данио-рерио может быть использована для проверки того, является ли EF менее токсичным после обработки.
В исследованиях токсичности ТКМ модель рыбок данио-рерио имеет двойные преимущества: высокую пропускную способность клеточных экспериментов и сходство с экспериментами на грызунах16. Эта модель отличается небольшими размерами, высокой скоростью нереста, коротким циклом размножения, простотой разведения. Модель может быть использована в крупномасштабных синхронных экспериментах на планшетах для клеточных культур, а экспериментальная дозировка препарата невелика, экспериментальный цикл короткий, стоимость низкая, а весь экспериментальный процесс легко наблюдать и эксплуатировать17. Эмбрионы рыбок данио-рерио прозрачны и быстро развиваются. Таким образом, токсичность и тератогенное действие лекарственных средств на висцеральные ткани на разных стадиях развития можно непосредственно наблюдать под микроскопом18. Гомология генов между рыбками данио-рерио и человеком достигает 85%18. Путь передачи сигнала рыбок данио-рерио аналогичен пути человека18. Биологическая структура и физиологические функции рыбок данио-рерио очень похожи на таковые у млекопитающих18. Таким образом, модель рыбок данио-рерио для тестирования лекарств может предоставить экспериментальных животных, которые являются надежными и полностью применимыми к людям19.
В этом исследовании мы использовали методологию поверхности «дизайн-отклик» Бокса-Бенкена для оптимизации количества и температуры бараньего масла и температуры жарки, используемой в технологии обработки EF, с содержанием икариина, эпимедина А, эпимедина В, эпимедина С и баохуозида I в качестве индексов оценки. Модель рыбок данио-рерио была использована для предварительного изучения влияния водного экстракта EF на эмбриональное развитие рыбок данио-рерио до и после обработки, чтобы оценить эффект ослабления обработки на EF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Независимые переменные и определение их уровней
Технология обработки EF описана только в издании Китайской фармакопеи 2020 года и местных спецификациях обработки китайских лекарств, опубликованных 26 провинциями, муниципалитетами и автономными районами по всей стране<sup class="xr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается Бизнес-проектом фундаментальных научных исследований Чунцинской академии традиционной китайской медицины (номер проекта: jbky20200013), Проектом руководства по стимулированию производительности научно-исследовательских институтов Чунцина (номер проекта: cstc2021jxjl 130025) и Проектом строительства ключевой дисциплины Комиссии по здравоохранению Чунцина по переработке китайской Materia Medica.
Materials
| Acetonitrile | Fisher | 197164 | |
Baohuoside  (B ) |
Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20042402 | |
| Chromatographic column | Waters Corporation | Symmetry C18 | |
| Design Expert software | Stat- Ease Inc., Minneapolis, MN | Trial Version8.0.6.1 | |
| Detector | Waters Corporation | 2998 | |
| Disintegrator | Hefei Rongshida Small Household Appliance Co., Ltd. | S-FS553 | |
| Electronic analytical balance | Mettler-Toledo International Inc. | MS205DU | |
| Epimedin A (EA) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-21112118 | |
| Epimedin B (EB) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20080403 | |
| Epimedin C (EC) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20080310 | |
| Ethanol | Chongqing Chuandong Chemical ( Group ) Co., Ltd. | 20180801 | |
| Graphpad software | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | 6.02 | |
| High Performance Liquid Chromatography (HPLC) | Waters Corporation | 2695 | |
| Icariin | Chengdu Glip Biotechnology Co., Ltd. | 21091401 | |
| Methanol | Chongqing Chuandong Chemical (Group) Co., Ltd. | 20171101 | |
| Microporous membrane | Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd. | 0.22μm | |
| Mutton oil | Kuoshan Zhiniu Fresh Food Store | 20211106 | |
| Office Excel office software | Microsoft | Office Excel 2021 | |
| Pharmacopoeia sieve | Shaoxing Shangyu Huafeng Hardware Instrument Co., Ltd. | R40/3 | |
| Pure water machine | Chongqing Andersen Environmental Protection Equipment Co., Ltd. | AT Sro 10A | |
| Qualitative filter paper | Shanghai Leigu Instrument Co., Ltd. | 18cm | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi 2000 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonics (Shanghai) Co.,Ltd. | BUG25-12 | |
| Zebrafish | China Zebrafish Resource Center (CZRC) | The AB strain |
Referências
- Chinese Pharmacopoeia Commission. . Chinese Pharmacopoeia. Volume I. , (2020).
- Wang, X. T. . Collection of Traditional Chinese Medicine Processing Methods. , (1998).
- Chen, L. L., Jia, X. B., Jia, D. S. Advances in studies on processing mechanism of Epimedii Folium. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 12 (12), 2108-2111 (2010).
- Zhao, W., et al. Optimized extraction of polysaccharides from corn silk by pulsed electric field and response surface quadratic design. Journal of The Science of Food and Agriculture. 91 (12), 2201-2209 (2011).
- Zhao, L. C., et al. The use of response surface methodology to optimize the ultrasound-assisted extraction of five anthraquinones from Rheum palmatum L. Molecules. 16 (7), 5928-5937 (2011).
- Mao, W. H., Han, L. J., Shi, B. Optimization of microwave assisted extraction of flavonoid from Radix Astragali using response surface methodology. Separation Science and Technology. 43 (12), 671-681 (2008).
- Liu, W., et al. Optimization of total flavonoid compound extraction from Gynura medica leaf using response surface methodology and chemical composition analysis. International Journal of Molecular Sciences. 11 (11), 4750-4763 (2010).
- Guo, G. L., et al. Research progress on processing mechanism of Epimedium fried with sheep fat oil based on warming kidney and promoting yang. Journal of Liaoning University of TCM. 22 (07), 1-5 (2020).
- Shen, X. J., Zhou, Q., Sun, L. -. L., Dai, Y. -. P., Yan, X. -. S. Optimization for cutting procedure of astragali radix with Box-Behnken design and response surface method. China Journal of Chinese Materia Medica. 39 (13), 2498-2503 (2014).
- Wang, L. H., et al. Optimization of processing technology of honey wheat bran based on Box-Behnken response surface methodology. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 52 (12), 3538-3543 (2021).
- Zhang, J. B., et al. Study on integrated process of producing area and processing production for Paeoniae Radix Alba based on Box-Behnken response surface methodology. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (18), 5657-5662 (2022).
- Li, N., Zhang, X. M., Yao, Y. Y., Chen, Y. L., Fan, Q. Optimization of processing technology for Psoraleae Fructus by D-optimal response surface methodology with UHPLC. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 39 (05), 42-44 (2022).
- Jia, Y. Q., et al. Optimization of processing technology with wine of Cnidii Fructus by AHP-entropy weight method combined with response surface method. Journal of Chinese Medicinal Materials. 10, 2338-2343 (2022).
- Chen, F. G., et al. Optimization of the baked drying technology of Cinnamomi Ramulus based on CRITIC combined with Box-Behnken response surface method. Journal of Chinese Medicinal Materials. 2022 (08), 1838-1842 (2022).
- Wang, W. D., et al. Optimization extraction of effective constituents from Epimedii Herba based on central composite design-response surface methodology and orthogonal experimental design. Lishizhen Medicine and Materia Medica. 21 (11), 2766-2768 (2010).
- Yang, L., et al. Zebrafish embryos as models for embryotoxic and teratological effects of chemicals. Reproductive Toxicology. 28 (2), 245-253 (2009).
- Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. Zebrafish model in drug safety assessment. Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).
- Jayasinghe, C. D., Jayawardena, U. A. Toxicity assessment of herbal medicine using zebrafish embryos: A systematic review. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2019, 7272808 (2019).
- Scholz, S. Zebrafish embryos as an alternative model for screening of drug induced organ toxicity. Archives of Toxicology. 87 (5), 767-769 (2013).
- Ling, J., et al. Analysis of Folium Epimedium toxicity in combination with Radix Morindae Officinalis based on zebrafish toxicity/metabolism synchronization. Acta Pharmaceutica Sinica. 53 (1), 74 (2018).
- Wang, Y., et al. Tri-n-butyl phosphate delays tissue repair by dysregulating neutrophil function in zebrafish. Toxicology and Applied Pharmacology. 449, 116114 (2022).
- Sheng, Z. L., Li, J. C., Li, Y. H. Optimization of forsythoside extraction from Forsythia suspensa by Box-Behnken design. African Journal of Biotechnology. 10 (55), 11728-11737 (2011).
- Pang, X., et al. Prenylated flavonoids and dihydrophenanthrenes from the leaves of Epimedium brevicornu and their cytotoxicity against HepG2 cells. Natural Product Research. 32 (19), 2253-2259 (2018).
- Zhong, R., et al. The toxicity and metabolism properties of Herba Epimedii flavonoids on laval and adult zebrafish. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2019, 3745051 (2019).
- Zhang, L., et al. Effect of 2" -O-rhamnosyl icariside II, baohuoside I and baohuoside II in Herba Epimedii on cytotoxicity indices in HL-7702 and HepG2 cells. Molecules. 24 (7), 1263 (2019).
- Chen, Y., Yang, R. J., Yu, M., Ding, S. L., Chen, R. Q. Application of response surface methodology in modern production process optimization. Science & Technology Vision. 2016 (19), 36-39 (2016).
- Zhang, Y., et al. Progress in using zebrafish as a toxicological model for traditional Chinese medicine. Journal of Ethnopharmacology. 282, 114638 (2022).
- Oliveira, R., Domingues, I., Grisolia, C. K., Soares, A. M. V. M. Effects of triclosan on zebrafish early-life stages and adults. Environmental Science and Pollution Research. 16 (6), 679-688 (2009).
- Ton, C., Lin, Y., Willett, C. Zebrafish as a model for developmental neurotoxicity testing. Birth Defects Research. Part A, Clinical and Molecular Teratology. 76 (7), 553-567 (2006).
- He, Q., et al. Toxicity induced by emodin on zebrafish embryos. Drug and Chemical Toxicology. 35 (2), 149-154 (2012).
- Chen, Y., et al. Developmental toxicity of muscone on zebrafish embryos. Chinese Journal of Pharmacology and Toxicology. (6), 267-273 (2014).
- He, Y. L., et al. Effects of shikonin on zebrafish’s embryo and angiogenesis. Chinese Traditional Patent Medicine. 38 (2), 241-245 (2016).
- Zhou, Y. . The transformation research on the chemical compositions in the processing of Epimedium. , (2016).
- Xiao, Y. P., Zeng, J., Jiao, L. -. N., Xu, X. -. Y. Review for treatment effect and signaling pathway regulation of kidney-tonifying traditional Chinese medicine on osteoporosis. China Journal of Chinese Materia Medica. 43 (1), 21-30 (2018).
- Wang, R. H. Study on modern pharmacological effects of traditional Chinese medicine for tonifying kidney yang. Journal of Hubei University of Chinese Medicine. 13 (04), 63-66 (2011).
- Luo, L., et al. Advances in the chemical constituents and pharmacological studies of Epimedium. Asia-Pacific Traditional Medicine. 15 (6), 190-194 (2019).
- Liu, S., et al. Effects of icariin on ERβ gene expression and serum estradiol level in ovariectomized rats. Hunan Journal of Traditional Chinese Medicine. 32 (1), 150-152 (2016).
- Liu, Y., et al. Effects of epimedin A on osteoclasts and osteoporotic male mice. Chinese Journal of Veterinary Science. 41 (07), 1359-1364 (2021).
- Liu, Y. L., et al. Effects of icariin and epimedium C on microstructure of bone tissue in glucocorticoid osteoporosis model mice based on Micro-CT technique. Drug Evaluation Research. 43 (09), 1733-1739 (2020).
- Zhan, Y. Evaluation of antiosteoporotic activity for micro amount icariin and epimedin B based on the osteoporosis model using zebrafish. Chinese Pharmaceutical Journal. (24), 30-35 (2014).
- Zhan, Y., Wei, Y. -. J., Sun, E., Xu, F. -. J., Jia, X. -. B. Two-dimensional zebrafish model combined with hyphenated chromatographic techniques for evaluation anti-osteoporosis activity of epimendin A and its metabolite baohuoside I. Acta Pharmaceutica Sinica. 49 (06), 932-937 (2014).
