Epimedii Folyum koyun eti yağı işleme teknolojisinin optimizasyonu ve zebra balığı embriyonik gelişimi üzerindeki etkisinin test edilmesi
Summary
Bu protokolde, Epimedii folium’un (EF) koyun eti yağı işleme teknolojisi, bir Box-Behnken deneysel tasarım-tepki yüzey metodolojisi uygulanarak optimize edildi ve ham ve optimize edilmiş su ekstrakte edilen EF’nin zebra balığı embriyonik gelişimi üzerindeki etkisi önceden araştırıldı.
Abstract
Geleneksel bir Çin tıbbı (TCM) olan Epimedii folium’un (EF), tıp ve gıdada > 2.000 yıllık bir geçmişi vardır. Klinik olarak, koyun eti yağı ile işlenmiş EF genellikle bir ilaç olarak kullanılır. Son yıllarda, EF’yi hammadde olarak kullanan ürünlerin güvenlik riskleri ve advers reaksiyonlarına ilişkin raporlar giderek artmıştır. İşleme, TCM’nin güvenliğini etkili bir şekilde artırabilir. TCM teorisine göre, koyun eti yağı işleme, EF’nin toksisitesini azaltabilir ve böbrekler üzerindeki tonlama etkisini artırabilir. Bununla birlikte, EF koyun eti yağı işleme teknolojisinin sistematik araştırma ve değerlendirme eksikliği vardır. Bu çalışmada, birden fazla bileşenin içeriğini değerlendirerek işleme teknolojisinin temel parametrelerini optimize etmek için Box-Behnken deneysel tasarım-tepki yüzey metodolojisini kullandık. Sonuçlar, EF’nin optimum koyun eti yağı işleme teknolojisinin şu şekilde olduğunu göstermiştir: koyun eti yağını 120 ° C’de 10 ° C’± ısıtmak, ham EF’yi eklemek, eşit derecede parlak olana kadar hafifçe 189 ° C’ye ± 10 ° C’ye kızartmak ve sonra çıkarmak ve soğutmak. Her 100 kg EF için 15 kg koyun eti yağı kullanılmalıdır. Sulu bir ham ve koyun eti yağı işlenmiş EF ekstraktının toksisiteleri ve teratojeniteleri, zebra balığı embriyo gelişim modelinde karşılaştırılmıştır. Sonuçlar, ham bitki grubunun zebra balığı deformitelerine neden olma olasılığının daha yüksek olduğunu ve yarı maksimal ölümcül EF konsantrasyonunun daha düşük olduğunu gösterdi. Sonuç olarak, optimize edilmiş koyun eti yağı işleme teknolojisi, iyi tekrarlanabilirlik ile istikrarlı ve güvenilirdi. Belirli bir dozda, EF’nin sulu ekstraktı zebra balığı embriyolarının gelişimi için toksikti ve toksisite, ham ilaç için işlenmiş ilaçtan daha güçlüydü. Sonuçlar, koyun eti yağı işlemenin ham EF’nin toksisitesini azalttığını göstermiştir. Bu bulgular, koyun eti yağı ile işlenmiş EF’nin kalitesini, homojenliğini ve klinik güvenliğini artırmak için kullanılabilir.
Introduction
Epimedii folium (EF), Epimedium brevicornu Maxim., Epimedium sagittatum’un (Sieb. et Zucc.) kurutulmuş yapraklarıdır. Maxim., Epimedium pubescens Maxim. veya Epimedium koreanum Nakai. EF, osteoporoz, menopoz sendromu, meme topakları, hipertansiyon, koroner kalp hastalığı ve diğer hastalıkların tedavisinde kullanılabilir1. Geleneksel bir Çin tıbbı (TCM) olarak EF, tıp ve gıda alanında 2.000 yıldan fazla bir geçmişe sahiptir. Düşük fiyatı ve böbrekleri tonlamanın dikkat çekici etkisi nedeniyle, ilaçlarda ve sağlık gıdalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. EF, koyun eti yağı ile karıştırılarak kızartılarak işlenir, ilk olarak Liu Songdönemi 2’de Lei Xiao tarafından yazılan Lei Gong İşleme Teorisi’nde açıklanan bir işlemdir. Ham EF ve kızartılmış EF’nin etkinlikleri oldukça farklıdır. Ham EF esas olarak romatizmayı ortadan kaldırırken, kızartılmış EF, yang3’ü güçlendirmek için böbrekleri ısıtır. Şu anda, EF yaygın olarak ilaç ve sağlık gıdalarında hammadde olarak kullanılmaktadır; listelenen 399 Çin patentli ilaç, dokuz ithal sağlık gıdası ve EF’yi hammadde olarak kullanan 455 yerli sağlık gıdası bulunmaktadır4. Bu tıbbi malzeme büyük uygulama beklentilerine sahiptir. Bununla birlikte, son yıllarda, EF’yi hammadde olarak kullanan sağlık gıdaları ve Çin patentli ilaçların neden olduğu advers reaksiyonlar ve insan karaciğer hasarı raporları artmıştır ve ilgili toksisite çalışmaları 5,6,7, EF’nin bir hammadde olarak potansiyel güvenlik risklerine sahip olduğunu bildirmiştir.
Çin tıbbi işleme, toksisiteyi etkili bir şekilde azaltabilen veya ortadan kaldırabilen ve TCM’lerin güvenliğini artırabilen farmasötik teknikleri ifade eder. EF’nin geleneksel işleme yöntemi, EF’nin toksisitesini azaltan ve böbrekleri ısıtma ve yang8’i teşvik etme etkisini artıran koyun eti yağı ile kızartmadır. Bu işleme yöntemi, Çin Farmakopesine ve çeşitli işleme spesifikasyonlarına dahil edilmiştir1. EF işlemi sadece şu şekilde belirtilir: her 100 kg EF için, 20 kg amniyotik yağ (rafine edilmiş) eklenir ve düzgün ve parlak olana kadar hafif ateşlenir1. Yukarıdaki standartlarda katı EF işleme yöntemi parametreleri yoktur, bu nedenle yerel işleme spesifikasyonları tutarlılık sağlamak için birleştirilmemiştir. Bu nedenle, EF sürecinin sistematik bir çalışmasının yapılması yararlı olacaktır. Bu yazıda, EF’nin işleme teknolojisini optimize etmek için Box-Behnken deneysel tasarım-tepki yüzey yöntemi kullanılmıştır.
Box-Behnken deneysel tasarımı, tipik olarak bir süreçteki faktörleri optimize etmek için kullanılan bir yöntemdir. Ekstraksiyon parametreleri, çoklu regresyon denklemi uydurma faktörleri ile etki değerleri arasındaki fonksiyonel ilişki kurularak optimize edilebilir. Son zamanlarda, bu yöntem TCM ekstraksiyonu 5,6,7 ve işleme 9,10,11’i incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Çeşitli çalışmalar, tuzla işlenmiş Psoraleae fructus12, şarapla işlenmiş Cnidii fructus13 ve kavrulmuş Cinnamomi ramulus14 gibi bir Box-Behnken tasarımını takiben tuz işleme, şarap işleme ve kızartma içeren TCM hazırlama yöntemlerini bildirmiştir. Bu yöntem test süresini kısaltmış, yüksek test doğruluğuna sahiptir ve çok faktörlü ve çok seviyeli testler için uygundur. Yöntem, ortogonal tasarım test yönteminden daha basittir ve tek tip tasarım yönteminden daha kapsamlıdır15. Elde edilen ilişkiler, test aralığındaki herhangi bir test noktasının tahmin edilen değerini belirleyebilir, bu da büyük bir avantajdır. EF’nin işlemden sonra daha az toksik olup olmadığını test etmek için bir zebra balığı modeli kullanılabilir.
TCM toksisite çalışmalarında, zebra balığı modeli, hücre deneylerinin yüksek veriminin ve kemirgen deneyleriyle benzerliklerin ikili avantajlarına sahiptir16. Bu model küçük boyutu, yüksek yumurtlama oranı, kısa üreme döngüsü ve üreme kolaylığı ile karakterizedir. Model, hücre kültürü plakalarındaki büyük ölçekli senkron deneylerde kullanılabilir ve deneysel ilaç dozu küçüktür, deneysel döngü kısadır, maliyet düşüktür ve tüm deneysel sürecin gözlemlenmesi ve çalıştırılması kolaydır17. Zebra balığı embriyoları şeffaftır ve hızla gelişir. Bu nedenle, ilaçların farklı gelişim evrelerinde viseral dokular üzerindeki toksisitesi ve teratojenik etkileri mikroskop altında doğrudan gözlemlenebilir18. Zebra balığı ve insanlar arasındaki gen homolojisi %85 kadar yüksektir18. Zebra balıklarının sinyal iletim yolu, insanlarınkine benzer18. Zebra balıklarının biyolojik yapısı ve fizyolojik işlevi, memelilerinkine oldukça benzerdir18. Bu nedenle, uyuşturucu testi için bir zebra balığı modeli, insanlar için güvenilir ve tamamen uygulanabilir deney hayvanları sağlayabilir19.
Bu çalışmada, koyun eti yağı miktarını ve sıcaklığını ve EF işleme teknolojisinde kullanılan kızartma sıcaklığını optimize etmek için Box-Behnken tasarım-tepki yüzey metodolojisini kullandık ve değerlendirme indeksleri olarak icariin, epimedin A, epimedin B, epimedin C ve baohuoside I içerikleri kullanıldı. Zebra balığı modeli, bir EF su ekstraktının, işlemin EF üzerindeki zayıflama etkisini değerlendirmek için işlemden önce ve sonra zebra balığı embriyonik gelişimi üzerindeki etkisini önceden araştırmak için kullanılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bağımsız değişkenler ve seviyelerinin belirlenmesi
EF işleme teknolojisi yalnızca Çin Farmakopesinin 2020 baskısında ve ülke genelinde 26 il, belediye ve özerk bölge tarafından yayınlanan yerel Çin tıbbı işleme spesifikasyonlarında açıklanmıştır1. Açıklama aşağıdaki adımları içerir: koyun eti yağı almak ve eritmek için ısıtmak, EF parçaları eklemek, düzgün ve parlak olana kadar yavaş bir ateşle kızartmak, çıkarmak ve soğumaya bır…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Chongqing Geleneksel Çin Tıbbı Akademisi’nin Temel Bilimsel Araştırma İş Projesi (Proje Numarası: jbky20200013), Chongqing Bilimsel Araştırma Kurumlarının Performans Teşvik Rehberlik Projesi (Proje Numarası: cstc2021jxjl 130025) ve Çin Materia Medica İşleme Chongqing Belediye Sağlık Komisyonu Anahtar Disiplin İnşaat Projesi tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Acetonitrile | Fisher | 197164 | |
Baohuoside  (B ) |
Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20042402 | |
| Chromatographic column | Waters Corporation | Symmetry C18 | |
| Design Expert software | Stat- Ease Inc., Minneapolis, MN | Trial Version8.0.6.1 | |
| Detector | Waters Corporation | 2998 | |
| Disintegrator | Hefei Rongshida Small Household Appliance Co., Ltd. | S-FS553 | |
| Electronic analytical balance | Mettler-Toledo International Inc. | MS205DU | |
| Epimedin A (EA) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-21112118 | |
| Epimedin B (EB) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20080403 | |
| Epimedin C (EC) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20080310 | |
| Ethanol | Chongqing Chuandong Chemical ( Group ) Co., Ltd. | 20180801 | |
| Graphpad software | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | 6.02 | |
| High Performance Liquid Chromatography (HPLC) | Waters Corporation | 2695 | |
| Icariin | Chengdu Glip Biotechnology Co., Ltd. | 21091401 | |
| Methanol | Chongqing Chuandong Chemical (Group) Co., Ltd. | 20171101 | |
| Microporous membrane | Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd. | 0.22μm | |
| Mutton oil | Kuoshan Zhiniu Fresh Food Store | 20211106 | |
| Office Excel office software | Microsoft | Office Excel 2021 | |
| Pharmacopoeia sieve | Shaoxing Shangyu Huafeng Hardware Instrument Co., Ltd. | R40/3 | |
| Pure water machine | Chongqing Andersen Environmental Protection Equipment Co., Ltd. | AT Sro 10A | |
| Qualitative filter paper | Shanghai Leigu Instrument Co., Ltd. | 18cm | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi 2000 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonics (Shanghai) Co.,Ltd. | BUG25-12 | |
| Zebrafish | China Zebrafish Resource Center (CZRC) | The AB strain |
Referências
- Chinese Pharmacopoeia Commission. . Chinese Pharmacopoeia. Volume I. , (2020).
- Wang, X. T. . Collection of Traditional Chinese Medicine Processing Methods. , (1998).
- Chen, L. L., Jia, X. B., Jia, D. S. Advances in studies on processing mechanism of Epimedii Folium. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 12 (12), 2108-2111 (2010).
- Zhao, W., et al. Optimized extraction of polysaccharides from corn silk by pulsed electric field and response surface quadratic design. Journal of The Science of Food and Agriculture. 91 (12), 2201-2209 (2011).
- Zhao, L. C., et al. The use of response surface methodology to optimize the ultrasound-assisted extraction of five anthraquinones from Rheum palmatum L. Molecules. 16 (7), 5928-5937 (2011).
- Mao, W. H., Han, L. J., Shi, B. Optimization of microwave assisted extraction of flavonoid from Radix Astragali using response surface methodology. Separation Science and Technology. 43 (12), 671-681 (2008).
- Liu, W., et al. Optimization of total flavonoid compound extraction from Gynura medica leaf using response surface methodology and chemical composition analysis. International Journal of Molecular Sciences. 11 (11), 4750-4763 (2010).
- Guo, G. L., et al. Research progress on processing mechanism of Epimedium fried with sheep fat oil based on warming kidney and promoting yang. Journal of Liaoning University of TCM. 22 (07), 1-5 (2020).
- Shen, X. J., Zhou, Q., Sun, L. -. L., Dai, Y. -. P., Yan, X. -. S. Optimization for cutting procedure of astragali radix with Box-Behnken design and response surface method. China Journal of Chinese Materia Medica. 39 (13), 2498-2503 (2014).
- Wang, L. H., et al. Optimization of processing technology of honey wheat bran based on Box-Behnken response surface methodology. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 52 (12), 3538-3543 (2021).
- Zhang, J. B., et al. Study on integrated process of producing area and processing production for Paeoniae Radix Alba based on Box-Behnken response surface methodology. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (18), 5657-5662 (2022).
- Li, N., Zhang, X. M., Yao, Y. Y., Chen, Y. L., Fan, Q. Optimization of processing technology for Psoraleae Fructus by D-optimal response surface methodology with UHPLC. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 39 (05), 42-44 (2022).
- Jia, Y. Q., et al. Optimization of processing technology with wine of Cnidii Fructus by AHP-entropy weight method combined with response surface method. Journal of Chinese Medicinal Materials. 10, 2338-2343 (2022).
- Chen, F. G., et al. Optimization of the baked drying technology of Cinnamomi Ramulus based on CRITIC combined with Box-Behnken response surface method. Journal of Chinese Medicinal Materials. 2022 (08), 1838-1842 (2022).
- Wang, W. D., et al. Optimization extraction of effective constituents from Epimedii Herba based on central composite design-response surface methodology and orthogonal experimental design. Lishizhen Medicine and Materia Medica. 21 (11), 2766-2768 (2010).
- Yang, L., et al. Zebrafish embryos as models for embryotoxic and teratological effects of chemicals. Reproductive Toxicology. 28 (2), 245-253 (2009).
- Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. Zebrafish model in drug safety assessment. Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).
- Jayasinghe, C. D., Jayawardena, U. A. Toxicity assessment of herbal medicine using zebrafish embryos: A systematic review. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2019, 7272808 (2019).
- Scholz, S. Zebrafish embryos as an alternative model for screening of drug induced organ toxicity. Archives of Toxicology. 87 (5), 767-769 (2013).
- Ling, J., et al. Analysis of Folium Epimedium toxicity in combination with Radix Morindae Officinalis based on zebrafish toxicity/metabolism synchronization. Acta Pharmaceutica Sinica. 53 (1), 74 (2018).
- Wang, Y., et al. Tri-n-butyl phosphate delays tissue repair by dysregulating neutrophil function in zebrafish. Toxicology and Applied Pharmacology. 449, 116114 (2022).
- Sheng, Z. L., Li, J. C., Li, Y. H. Optimization of forsythoside extraction from Forsythia suspensa by Box-Behnken design. African Journal of Biotechnology. 10 (55), 11728-11737 (2011).
- Pang, X., et al. Prenylated flavonoids and dihydrophenanthrenes from the leaves of Epimedium brevicornu and their cytotoxicity against HepG2 cells. Natural Product Research. 32 (19), 2253-2259 (2018).
- Zhong, R., et al. The toxicity and metabolism properties of Herba Epimedii flavonoids on laval and adult zebrafish. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2019, 3745051 (2019).
- Zhang, L., et al. Effect of 2" -O-rhamnosyl icariside II, baohuoside I and baohuoside II in Herba Epimedii on cytotoxicity indices in HL-7702 and HepG2 cells. Molecules. 24 (7), 1263 (2019).
- Chen, Y., Yang, R. J., Yu, M., Ding, S. L., Chen, R. Q. Application of response surface methodology in modern production process optimization. Science & Technology Vision. 2016 (19), 36-39 (2016).
- Zhang, Y., et al. Progress in using zebrafish as a toxicological model for traditional Chinese medicine. Journal of Ethnopharmacology. 282, 114638 (2022).
- Oliveira, R., Domingues, I., Grisolia, C. K., Soares, A. M. V. M. Effects of triclosan on zebrafish early-life stages and adults. Environmental Science and Pollution Research. 16 (6), 679-688 (2009).
- Ton, C., Lin, Y., Willett, C. Zebrafish as a model for developmental neurotoxicity testing. Birth Defects Research. Part A, Clinical and Molecular Teratology. 76 (7), 553-567 (2006).
- He, Q., et al. Toxicity induced by emodin on zebrafish embryos. Drug and Chemical Toxicology. 35 (2), 149-154 (2012).
- Chen, Y., et al. Developmental toxicity of muscone on zebrafish embryos. Chinese Journal of Pharmacology and Toxicology. (6), 267-273 (2014).
- He, Y. L., et al. Effects of shikonin on zebrafish’s embryo and angiogenesis. Chinese Traditional Patent Medicine. 38 (2), 241-245 (2016).
- Zhou, Y. . The transformation research on the chemical compositions in the processing of Epimedium. , (2016).
- Xiao, Y. P., Zeng, J., Jiao, L. -. N., Xu, X. -. Y. Review for treatment effect and signaling pathway regulation of kidney-tonifying traditional Chinese medicine on osteoporosis. China Journal of Chinese Materia Medica. 43 (1), 21-30 (2018).
- Wang, R. H. Study on modern pharmacological effects of traditional Chinese medicine for tonifying kidney yang. Journal of Hubei University of Chinese Medicine. 13 (04), 63-66 (2011).
- Luo, L., et al. Advances in the chemical constituents and pharmacological studies of Epimedium. Asia-Pacific Traditional Medicine. 15 (6), 190-194 (2019).
- Liu, S., et al. Effects of icariin on ERβ gene expression and serum estradiol level in ovariectomized rats. Hunan Journal of Traditional Chinese Medicine. 32 (1), 150-152 (2016).
- Liu, Y., et al. Effects of epimedin A on osteoclasts and osteoporotic male mice. Chinese Journal of Veterinary Science. 41 (07), 1359-1364 (2021).
- Liu, Y. L., et al. Effects of icariin and epimedium C on microstructure of bone tissue in glucocorticoid osteoporosis model mice based on Micro-CT technique. Drug Evaluation Research. 43 (09), 1733-1739 (2020).
- Zhan, Y. Evaluation of antiosteoporotic activity for micro amount icariin and epimedin B based on the osteoporosis model using zebrafish. Chinese Pharmaceutical Journal. (24), 30-35 (2014).
- Zhan, Y., Wei, Y. -. J., Sun, E., Xu, F. -. J., Jia, X. -. B. Two-dimensional zebrafish model combined with hyphenated chromatographic techniques for evaluation anti-osteoporosis activity of epimendin A and its metabolite baohuoside I. Acta Pharmaceutica Sinica. 49 (06), 932-937 (2014).
