Optimering af epimedii folium fåre-olie forarbejdning teknologi og test dens virkning på zebrafisk embryonale udvikling

Summary

I denne protokol blev fåreolieforarbejdningsteknologien i Epimedii folium (EF) optimeret ved at anvende en Box-Behnken eksperimentel design-respons overflademetode, og effekten af rå og optimeret vandekstraheret EF på zebrafiskens embryonale udvikling blev foreløbigt undersøgt.

Abstract

Som en traditionel kinesisk medicin (TCM) har Epimedii folium (EF) en historie inden for medicin og mad, der er > 2.000 år gammel. Klinisk anvendes EF behandlet med fårekødolie ofte som medicin. I de senere år er antallet af indberetninger om sikkerhedsrisici og bivirkninger ved produkter, der anvender miljøaftryk som råmateriale, gradvist steget. Behandling kan effektivt forbedre sikkerheden ved TCM. Ifølge TCM-teorien kan fåreolieforarbejdning reducere toksiciteten af EF og forbedre dens tonificerende virkning på nyrerne. Der mangler imidlertid systematisk forskning og evaluering af EF-fårekødsolieforarbejdningsteknologi. I denne undersøgelse brugte vi Box-Behnkens eksperimentelle design-respons-overflademetode til at optimere nøgleparametrene for behandlingsteknologien ved at vurdere indholdet af flere komponenter. Resultaterne viste, at den optimale fåreolieforarbejdningsteknologi for EF var som følger: opvarmning af fårekødolien ved 120 °C ± 10 °C, tilsætning af rå EF, omrøring til den forsigtigt til 189 °C ± 10 °C, indtil den er jævnt skinnende, og derefter fjernelse og afkøling. For hver 100 kg EF skal der anvendes 15 kg fårekødolie. Toksiciteten og teratogeniciteten af et vandigt ekstrakt af råolie og fåreolieforarbejdet EF blev sammenlignet i en udviklingsmodel for zebrafiskembryoner. Resultaterne viste, at den rå urtegruppe var mere tilbøjelig til at forårsage zebrafiskdeformiteter, og dens halvmaksimale dødelige EF-koncentration var lavere. Afslutningsvis var den optimerede fåreolieforarbejdningsteknologi stabil og pålidelig med god repeterbarhed. Ved en vis dosis var det vandige ekstrakt af EF giftigt for udviklingen af zebrafiskembryoner, og toksiciteten var stærkere for det rå lægemiddel end for det forarbejdede lægemiddel. Resultaterne viste, at fårekødsolieforarbejdning reducerede toksiciteten af rå EF. Disse resultater kan bruges til at forbedre kvaliteten, ensartetheden og den kliniske sikkerhed af fårekødsolieforarbejdet EF.

Introduction

Epimedii folium (EF) er de tørrede blade af Epimedium brevicornu Maxim., Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.) Maxim., Epimedium pubescens Maxim., eller Epimedium koreanum Nakai. EF kan anvendes til behandling af osteoporose, menopausalt syndrom, knuder i brystet, hypertension, koronar hjertesygdom og andre sygdomme¹. Som en traditionel kinesisk medicin (TCM) har EF en historie inden for medicin og mad på mere end 2.000 år. På grund af sin lave pris og bemærkelsesværdige effekt af tonificering af nyrerne anvendes den i vid udstrækning i medicin og helsekost. EF behandles ved omrøring med fåreolie, en proces, der først blev beskrevet i Lei Gong Processing Theory skrevet af Lei Xiao i Liu Song periode². Effektiviteten af rå EF og lynstegt EF er helt forskellige. Rå EF fjerner hovedsageligt gigt, mens den stegte EF opvarmer nyrerne for at forstærke yang³. På nuværende tidspunkt anvendes EF i vid udstrækning som råmateriale i lægemidler og helsekost; der er 399 listede kinesiske patentlægemidler, ni importerede helsekostprodukter og 455 indenlandske helsekost med EF som råmateriale⁴. Dette lægemiddelmateriale har gode anvendelsesmuligheder. I de senere år har der imidlertid været stigende rapporter om bivirkninger og leverskader forårsaget af helsekost og kinesiske patentlægemidler, der bruger EF som råmateriale, og relaterede toksicitetsundersøgelser ^5,6,7 har rapporteret, at EF som råmateriale har potentielle sikkerhedsrisici.

Kinesisk medicinsk behandling refererer til farmaceutiske teknikker, der effektivt kan reducere eller eliminere toksiciteten og forbedre sikkerheden af TCM’er. Den traditionelle behandlingsmetode for EF er omrøring med fåreolie, hvilket reducerer toksiciteten af EF og forbedrer dens virkning af opvarmning af nyrerne og fremme yang⁸. Denne behandlingsmetode er inkluderet i den kinesiske farmakopé og forskellige behandlingsspecifikationer¹. Processen med EF er kun specificeret som følger: For hver 100 kg EF tilsættes 20 kg fosterolie (raffineret), og den er mildfyret, indtil den er ensartet og skinnende¹. Der er ingen strenge parametre for EF-behandlingsmetoder i ovenstående standarder, så lokale behandlingsspecifikationer er ikke blevet samlet for at give konsistens. Det ville derfor være nyttigt at gennemføre en systematisk undersøgelse af El-processen. I dette papir blev Box-Behnken-eksperimentel design-respons-overflademetode brugt til at optimere EF’s behandlingsteknologi.

Box-Behnkens eksperimentelle design er en metode, der typisk bruges til at optimere faktorerne i en proces. Udtrækningsparametrene kan optimeres ved at etablere det funktionelle forhold mellem multiple regressionsligningstilpasningsfaktorer og effektværdier. For nylig er denne metode blevet brugt i vid udstrækning til at studere TCM-ekstraktion ^5,6,7 og behandling 9,10,11. Forskellige undersøgelser har rapporteret TCM-tilberedningsmetoder, der involverer saltforarbejdning, vinforarbejdning og omrøring efter et Box-Behnken-design, såsom til saltforarbejdet Psoraleae fructus ¹², vinforarbejdet Cnidii fructus¹³ og ristet Cinnamomi ramulus¹⁴. Denne metode har reduceret testtid, høj testnøjagtighed og er velegnet til multifaktor- og multiniveautest. Metoden er enklere end testmetoden for ortogonalt design og mere omfattende end den ensartede designmetode¹⁵. De opnåede relationer kan bestemme den forudsagte værdi af ethvert testpunkt inden for testområdet, hvilket er en stor fordel. En zebrafiskmodel kan bruges til at teste, om EF er mindre giftigt efter forarbejdning.

I TCM-toksicitetsundersøgelser har zebrafiskmodellen de dobbelte fordele ved den høje gennemstrømning af celleeksperimenter og lighederne med gnaverforsøg¹⁶. Denne model er kendetegnet ved sin lille størrelse, høje gydehastighed, korte reproduktionscyklus og lette avl. Modellen kan bruges i store synkrone eksperimenter i cellekulturplader, og den eksperimentelle lægemiddeldosering er lille, den eksperimentelle cyklus er kort, omkostningerne er lave, og hele eksperimentprocessen er let at observere og betjene¹⁷. Zebrafiskembryoner er gennemsigtige og udvikler sig hurtigt. Derfor kan toksiciteten og teratogene virkninger af lægemidler på viscerale væv i forskellige udviklingsstadier observeres direkte under et mikroskop¹⁸. Genhomologien mellem zebrafisk og mennesker er så høj som 85%¹⁸. Zebrafiskens signaltransduktionsvej svarer til menneskers¹⁸. Zebrafiskens biologiske struktur og fysiologiske funktion minder meget om pattedyrs¹⁸. Derfor kan en zebrafiskmodel til lægemiddeltest give forsøgsdyr, der er pålidelige og fuldt anvendelige på mennesker¹⁹.

I denne undersøgelse brugte vi Box-Behnkens design-responsoverflademetode til at optimere mængden og temperaturen af fårekødolie og stegetemperaturen, der anvendes i EF-behandlingsteknologien, med indholdet af icariin, epimedin A, epimedin B, epimedin C og baohuosid I som evalueringsindekser. Zebrafiskmodellen blev brugt til foreløbigt at undersøge effekten af et vandekstrakt fra EF på zebrafiskens embryonale udvikling før og efter forarbejdning for at evaluere behandlingens dæmpningseffekt på EF.

Protocol

Alle dyrerelaterede forsøg blev udført med godkendelse fra Experiment Ethics Committee of the Chongqing Institute of TCM (laboratoriedyretisk gennemgang certifikatnummer: ZJS2022-03). 1. Bestemmelse af de bioaktive bestanddele BEMÆRK: De arter, der blev brugt i denne forskning, var Epimedium sagittatum, og prøverne blev indsamlet i Fengdu County, Chongqing. Prøven blev identificeret som en tør overjordisk del af E. sagittatum (…

Representative Results

Metodologiske undersøgelsesresultaterDer blev observeret et lineært forhold mellem koncentrationen af icariin, EA, EB, EC, BI og kromatografiske topområder (se tabel 3). RSD%-værdierne (n = 6) for de kromatografiske topområder af icariin, EA, EB, EC og BI var henholdsvis 0,28%, 1,22%, 0,65%, 1,67% og 1,06%, hvilket indikerer, at præcisionen af HPLC-målingerne var god. RSD%-værdierne (n = 6) for indholdet af icariin, EA, EB, EC og BI var henholdsvis 1,59%, 1,46%, 1,86%, 2,29% …

Discussion

Uafhængige variabler og bestemmelse af deres niveauer
EF-behandlingsteknologien er kun beskrevet i 2020-udgaven af den kinesiske farmakopé og de lokale kinesiske lægemiddelbehandlingsspecifikationer, der er offentliggjort af 26 provinser, kommuner og autonome regioner over hele landet¹. Beskrivelsen involverer følgende trin: at tage fåreolie og opvarme den til at smelte, tilføje EF-strimler, omrøre med langsom ild, indtil den er ensartet og skinnende, tage den ud og lade…

Materials

Acetonitrile	Fisher	197164
Baohuoside (B )	Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.	MUST-20042402
Chromatographic column	Waters Corporation	Symmetry C18
Design Expert software	Stat- Ease Inc., Minneapolis, MN	Trial Version8.0.6.1
Detector	Waters Corporation	2998
Disintegrator	Hefei Rongshida Small Household Appliance Co., Ltd.	S-FS553
Electronic analytical balance	Mettler-Toledo International Inc.	MS205DU
Epimedin A (EA)	Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.	MUST-21112118
Epimedin B (EB)	Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.	MUST-20080403
Epimedin C (EC)	Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.	MUST-20080310
Ethanol	Chongqing Chuandong Chemical ( Group ) Co., Ltd.	20180801
Graphpad software	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA	6.02
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)	Waters Corporation	2695
Icariin	Chengdu Glip Biotechnology Co., Ltd.	21091401
Methanol	Chongqing Chuandong Chemical (Group) Co., Ltd.	20171101
Microporous membrane	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd.	0.22μm
Mutton oil	Kuoshan Zhiniu Fresh Food Store	20211106
Office Excel office software	Microsoft	Office Excel 2021
Pharmacopoeia sieve	Shaoxing Shangyu Huafeng Hardware Instrument Co., Ltd.	R40/3
Pure water machine	Chongqing Andersen Environmental Protection Equipment Co., Ltd.	AT Sro 10A
Qualitative filter paper	Shanghai Leigu Instrument Co., Ltd.	18cm
Stereomicroscope	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Stemi 2000
Ultrasonic cleaner	Branson Ultrasonics (Shanghai) Co.,Ltd.	BUG25-12
Zebrafish	China Zebrafish Resource Center (CZRC)	The AB strain