Generatie van 3D-tumorsferoïden voor geneesmiddelenevaluatiestudies
Summary
Dit artikel demonstreert een gestandaardiseerde methode voor het construeren van driedimensionale tumorsferoïden. Een strategie voor sferoïde observatie en beeldgebaseerde deep-learning analyse met behulp van een geautomatiseerd beeldvormingssysteem wordt ook beschreven.
Abstract
In de afgelopen decennia zijn, naast monolaag-gekweekte cellen, driedimensionale tumorsferoïden ontwikkeld als een potentieel krachtig hulpmiddel voor de evaluatie van geneesmiddelen tegen kanker. De conventionele kweekmethoden missen echter het vermogen om de tumorsferoïden op een homogene manier op driedimensionaal niveau te manipuleren. Om deze beperking aan te pakken, presenteren we in dit artikel een handige en effectieve methode voor het construeren van tumorsferoïden van gemiddelde grootte. Daarnaast beschrijven we een methode van beeldgebaseerde analyse met behulp van op kunstmatige intelligentie gebaseerde analysesoftware die de hele plaat kan scannen en gegevens over driedimensionale sferoïden kan verkrijgen. Verschillende parameters werden bestudeerd. Door gebruik te maken van een standaardmethode van tumorsferoïde constructie en een high-throughput beeldvormings- en analysesysteem, kunnen de effectiviteit en nauwkeurigheid van medicijntests die worden uitgevoerd op driedimensionale sferoïden drastisch worden verhoogd.
Introduction
Kanker is een van de ziekten die het meest gevreesd wordt door de mens, niet in de laatste plaats vanwege het hoge sterftecijfer1. In de afgelopen jaren is de mogelijkheid om kanker te behandelen toegenomen omdat nieuwe therapieën zijn geïntroduceerd 2,3,4,5. Tweedimensionale (2D) en driedimensionale (3D) in vitro modellen worden gebruikt om kanker in een laboratoriumomgeving te bestuderen. 2D-modellen kunnen echter niet onmiddellijk en nauwkeurig alle belangrijke parameters beoordelen die wijzen op antitumorgevoeligheid; daarom slagen ze er niet in om in vivo interacties volledig weer te geven bij het testen van medicamenteuze therapie6.
Sinds 2020 is de wereldwijde driedimensionale (3D) cultuurmarkt sterk gestimuleerd. Volgens een rapport van NASDAQ OMX zal de wereldwijde waarde van de 3D-celkweekmarkt tegen het einde van 2025 meer dan USD 2,7 miljard bedragen. In vergelijking met 2D-kweekmethoden vertoont 3D-celkweek voordelige eigenschappen, die niet alleen kunnen worden geoptimaliseerd voor proliferatie en differentiatie, maar ook voor overleving op lange termijn 7,8. Op dergelijke manieren kunnen in vivo cellulaire micro-omgevingen worden gesimuleerd om nauwkeurigere tumorkarakterisering te verkrijgen, evenals metabole profilering, zodat genomische en eiwitveranderingen beter kunnen worden begrepen. Daarom moeten 3D-testsystemen nu worden opgenomen in reguliere geneesmiddelenontwikkelingsoperaties, vooral die met een focus op het screenen en evalueren van nieuwe antitumorgeneesmiddelen. Driedimensionale gezwellen van vereeuwigde gevestigde cellijnen of primaire celculturen in sferoïde structuren bezitten in vivo kenmerken van tumoren zoals hypoxie en geneesmiddelpenetratie, evenals celinteractie, respons en resistentie, en kunnen worden beschouwd als een strikt en representatief model voor het uitvoeren van in vitro geneesmiddelenscreening 9,10,11.
Deze 3D-cultuurmodellen hebben echter ook last van verschillende problemen die enige tijd kunnen duren om op te lossen. Celsferoïden kunnen worden gevormd met behulp van deze protocollen, maar ze verschillen in bepaalde details, zoals kweektijd of inbeddingsgels12, dus deze geconstrueerde celsferoïden kunnen niet goed worden gecontroleerd onder een beperkt groottebereik. De grootte van de sferoïden kan de consistentie van de levensvatbaarheidstest en beeldvormingsanalyse beïnvloeden. De groeimicro-omgevingen en groeifactoren variëren ook, wat kan leiden tot verschillende morfologieën als gevolg van verschillen in de differentiatie tussen cellen13. Er is nu een duidelijke behoefte aan een standaard, eenvoudige en kosteneffectieve methode voor het construeren van alle soorten tumoren met gecontroleerde groottes.
Vanuit een ander perspectief, hoewel homogene assays en high-content imaging benaderingen zijn ontwikkeld om morfologie, levensvatbaarheid en groeisnelheid te evalueren, blijft de high-throughput screening van 3D-modellen een uitdaging om verschillende redenen die in de literatuur worden gerapporteerd, zoals het gebrek aan uniformiteit in de positie, grootte en morfologie van tumorsferoïden14,15,16.
In het hier gepresenteerde protocol vermelden we elke stap in de constructie van 3D-tumorsferoïden en beschrijven we een methode voor sferoïde observatie en analyse met behulp van een high-throughput, high-content beeldvormingssysteem dat autofocus, auto-imaging en analyse omvat, naast andere voordelige kenmerken. We laten zien hoe deze methode 3D-tumorsferoïden van uniforme grootte kan produceren die geschikt zijn voor high-throughput beeldvorming. Deze sferoïden vertonen ook een hoge gevoeligheid voor de behandeling van kankergeneesmiddelen en morfologische veranderingen in de sferoïden kunnen worden gevolgd met behulp van beeldvorming met een hoog gehalte. Samenvattend tonen we de robuustheid van deze methodologie aan als een middel om 3D-tumorconstructies te genereren voor geneesmiddelenevaluatiedoeleinden.
Protocol
Representative Results
Discussion
De micro-omgeving speelt een belangrijke rol bij tumorgroei. Het kan de levering van extracellulaire matrices, zuurstofgradiënten, voeding en mechanische interactie beïnvloeden en dus de genexpressie, signaalroutes en vele functies van tumorcellen beïnvloeden 19,20,21. In veel gevallen produceren 2D-cellen dergelijke effecten niet of zelfs tegengestelde effecten, waardoor de evaluatie van medicamenteuze behandelingen wordt be…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken alle leden van onze laboratoria voor hun kritische inbreng en suggesties. Dit onderzoek werd ondersteund door het Key Project van Jiangsu Commission of Health (K2019030). Conceptualisatie werd uitgevoerd door C.W. en Z.C., de methodologie werd uitgevoerd door W.H. en M.L., het onderzoek werd uitgevoerd door W.H. en M.L., de datacuratie werd uitgevoerd door W.H., Z.Z., S.X., en M.L., de oorspronkelijke conceptvoorbereiding werd uitgevoerd door Z.Z., J.Z., S.X., W.H., en X.L., de beoordeling en bewerking werd uitgevoerd door Z.C., de projectadministratie werd uitgevoerd door C.W. en Z.C., en de financieringsacquisitie werd uitgevoerd door C.W. Alle auteurs hebben de gepubliceerde versie van het manuscript gelezen en ermee ingestemd.
Materials
| 0.5-10 μL Pipette tips | AXYGEN | T-300 | |
| 1.5 mL Boil proof microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 100-1000μL Pipette tips | KIRGEN | KG1313 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Nest | 601052 | |
| 200 μL Pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | |
| 3D gel | Avatarget | MA02 | |
| 48-well U bottom Plate | Avatarget | P02-48UWP | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Nest | 602052 | |
| Alamar Blue | Thermo | DAL1100 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL | #07010 | |
| Certified FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Deionized water | aladdin | W433884-500ml | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 11965-092 | |
| DMSO | sigma | D2650-100ML | |
| Excel sofware | Microsoft office | ||
| Graphpad prism sofware | GraphPad software | ||
| High Content Microscope and SMART system | Avatarget | 1-I01 | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X) | Gibco | 51300-044 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Penicillin/streptomycin Sol | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Scientific Fluoroskan Ascent | Thermo | Fluoroskan Ascent | |
| T25 Flask | JET Biofil | TCF012050 | |
| Trypsin, 0.25% (1X) | Hyclone | SH30042.01 |
Referências
- Carioli, G., et al. European cancer mortality predictions for the year 2021 with focus on pancreatic and female lung cancer. Annals of Oncology. 32 (4), 478-487 (2021).
- Katti, A., Diaz, B. J., Caragine, C. M., Sanjana, N. E., Dow, L. E. CRISPR in cancer biology and therapy. Nature Reviews Cancer. 22 (5), 259-279 (2022).
- Abrantes, R., Duarte, H. O., Gomes, C., Walchili, S., Reis, C. A. CAR-Ts: New perspectives in cancer therapy. FEBS Letter. 596 (4), 403-416 (2022).
- Shokooohi, A., et al. Effect of targeted therapy and immunotherapy on advanced nonsmall-cell lung cancer outcomes in the real world. Cancer Medicine. 11 (1), 86-93 (2022).
- Chen, K., Zhang, Y., Qian, L., Wang, P. Emerging strategies to target RAS signaling in human cancer therapy. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 116 (2021).
- Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research. Pharmaceutics. 12 (12), 1186 (2020).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Qin, Y., Hu, X., Fan, W., Yan, J. A stretchable scaffold with electrochemical sensing for 3D culture, mechanical loading, and real-time monitoring of cells. Advanced Science. 8 (13), 2003738 (2021).
- Wartenberg, M., et al. Regulation of the multidrug resistance transporter P-glycoprotein in multicellular tumor spheroids by hypoxia-inducible factor (HIF-1) ad reactive oxygen species. FASEB Journal. 17 (3), 503-505 (2003).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nature Reviews Cancer. 6 (8), 583-592 (2006).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: How 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Brüningk, S. C., Rivens, I., Box, C., Oelfke, U., Ter Haar, G. 3D tumour spheroids for the prediction of the effects of radiation and hyperthermia treatments. Scientific Reports. 10, 1653 (2020).
- Graves, E. E., Maity, A., Thu Le, Q. The tumor microenvironment in non-small-cell lung cancer. Seminars in Radiation Oncology. 20 (3), 156-163 (2010).
- Kunz-Schughart, L. A., Frreyer, J. P., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model. Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).
- Carragher, N., et al. Concerns, challenges and promises of high-content analysis of 3D cellular models. Nature Review Drug Discovery. 17 (8), 606 (2018).
- Huang, Y., et al. Longitudinal morphological and physiological monitoring of three-dimensional tumor spheroids using optical coherence tomography. Journal of Visualized Experiments. (144), e59020 (2019).
- Yazdanfar, S., et al. Simple and robust image-baed autofocusing for digital microscopy. Optics Express. 16 (12), 8670-8677 (2008).
- Chen, Z., et al. Automated evaluation of tumor spheroid behavior in 3D culture using deep learning-based recognition. Biomaterials. 22 (272), 120770 (2021).
- Boucherit, N., Gorvel, L., Olive, D. 3D tumor models and their use for the testing of immunotherapies. Frontiers in Immunology. 11, 603640 (2020).
- Anastasiou, D., et al. Microenvironment factors shaping the cancer metabolism landscape. British Journal of Cancer. 116 (3), 277-286 (2017).
- Zhou, H., et al. Functions and clinical significance of mechanical tumor microenvironment: Cancer cell sensing, mechanobiology and metastasis. Cancer Communications. 43 (5), 374-400 (2022).
- Zhu, G. G., et al. Targeting KRAS cancers: From druggable therapy to druggable resistance. Molecular Cancer. 21 (1), 159 (2022).
- Ando, Y., Mariano, C., Shen, K. Engineered in vitro tumor models for cell-based immunotherapy. Acta Biomaterialia. 132, 345-359 (2021).
- Timmins, N. E., Dietmair, S., Nielsen, L. K. Hanging-drop multicellular spheroids as a model of tumor angiogenesis. Angiogenesis. 7 (2), 97-103 (2004).
- Costa, E. C., et al. 3D tumor spheroids: An overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).
- Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today. Technologies. 23, 27-36 (2017).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
