Generación de esferoides tumorales 3D para estudios de evaluación de fármacos
Summary
Este artículo demuestra un método estandarizado para construir esferoides tumorales tridimensionales. También se describe una estrategia para la observación de esferoides y el análisis de aprendizaje profundo basado en imágenes utilizando un sistema automatizado de imágenes.
Abstract
En las últimas décadas, además de las células cultivadas en monocapa, se han desarrollado esferoides tumorales tridimensionales como una herramienta potencialmente poderosa para la evaluación de medicamentos contra el cáncer. Sin embargo, los métodos de cultivo convencionales carecen de la capacidad de manipular los esferoides tumorales de manera homogénea a nivel tridimensional. Para abordar esta limitación, en este documento, presentamos un método conveniente y efectivo para construir esferoides tumorales de tamaño promedio. Además, describimos un método de análisis basado en imágenes utilizando un software de análisis basado en inteligencia artificial que puede escanear toda la placa y obtener datos sobre esferoides tridimensionales. Se estudiaron varios parámetros. Mediante el uso de un método estándar de construcción de esferoides tumorales y un sistema de imágenes y análisis de alto rendimiento, la eficacia y la precisión de las pruebas de drogas realizadas en esferoides tridimensionales se pueden aumentar drásticamente.
Introduction
El cáncer es una de las enfermedades más temidas por los seres humanos, sobre todo por su alta tasa de mortalidad1. En los últimos años, la posibilidad de tratar el cáncer ha aumentado a medida que se han introducido nuevas terapias 2,3,4,5. Los modelos in vitro bidimensionales (2D) y tridimensionales (3D) se utilizan para estudiar el cáncer en un entorno de laboratorio. Sin embargo, los modelos 2D no pueden evaluar de forma inmediata y precisa todos los parámetros importantes que indican sensibilidad antitumoral; por lo tanto, no logran representar completamente las interacciones in vivo en las pruebas de terapia farmacológica6.
Desde 2020, el mercado global de cultura tridimensional (3D) se ha impulsado enormemente. Según un informe de NASDAQ OMX, el valor global del mercado de cultivo celular 3D superará los USD 2.7 mil millones para fines de 2025. En comparación con los métodos de cultivo 2D, el cultivo celular 3D exhibe propiedades ventajosas, que pueden optimizarse no solo para la proliferación y diferenciación, sino también para la supervivencia a largo plazo 7,8. De esta manera, se pueden simular microambientes celulares in vivo para obtener una caracterización tumoral más precisa, así como perfiles metabólicos, de modo que se puedan comprender mejor las alteraciones genómicas y proteicas. Debido a esto, los sistemas de prueba 3D ahora deben incluirse en las operaciones convencionales de desarrollo de medicamentos, especialmente aquellos con un enfoque en la detección y evaluación de nuevos medicamentos antitumorales. Los crecimientos tridimensionales de líneas celulares establecidas inmortalizadas o cultivos celulares primarios en estructuras esferoides poseen características in vivo de tumores como hipoxia y penetración de fármacos, así como interacción celular, respuesta y resistencia, y pueden considerarse como un modelo estricto y representativo para realizar el cribado in vitro de drogas 9,10,11.
Sin embargo, estos modelos de cultura 3D también sufren de varios problemas que pueden tardar algún tiempo en resolverse. Los esferoides celulares se pueden formar utilizando estos protocolos, pero difieren en ciertos detalles, como el tiempo de cultivo o los geles de incrustación12, por lo que estos esferoides celulares construidos no pueden controlarse bien en un rango de tamaño restringido. El tamaño de los esferoides puede influir en la consistencia de la prueba de viabilidad y el análisis de imagen. Los microambientes de crecimiento y los factores de crecimiento también varían, lo que puede conducir a diferentes morfologías debido a las diferencias en la diferenciación entre las células13. Ahora existe una necesidad obvia de un método estándar, simple y rentable para construir todos los tipos de tumores con tamaños controlados.
Desde otra perspectiva, aunque se han desarrollado ensayos homogéneos y enfoques de imagen de alto contenido para evaluar la morfología, la viabilidad y la tasa de crecimiento, el cribado de alto rendimiento de los modelos 3D sigue siendo un desafío por varias razones reportadas en la literatura, como la falta de uniformidad en la posición, tamaño y morfología de los esferoides tumorales14,15,16.
En el protocolo presentado aquí, enumeramos cada paso en la construcción de esferoides tumorales 3D y describimos un método para la observación y el análisis de esferoides utilizando un sistema de imágenes de alto rendimiento y alto contenido que involucra enfoque automático, imágenes automáticas y análisis, entre otras características ventajosas. Mostramos cómo este método puede producir esferoides tumorales 3D de tamaño uniforme que son adecuados para imágenes de alto rendimiento. Estos esferoides también demuestran una alta sensibilidad al tratamiento farmacológico contra el cáncer, y los cambios morfológicos en los esferoides pueden ser monitoreados usando imágenes de alto contenido. En resumen, demostramos la robustez de esta metodología como un medio para generar construcciones tumorales 3D con fines de evaluación de fármacos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El microambiente juega un papel importante en el crecimiento del tumor. Puede afectar la provisión de matrices extracelulares, gradientes de oxígeno, nutrición e interacción mecánica y, por lo tanto, afectar la expresión génica, las vías de señalización y muchas funciones de las células tumorales 19,20,21. En muchos casos, las células 2D no producen tales efectos o incluso producen efectos opuestos, afectando así la…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a todos los miembros de nuestros laboratorios por sus aportes y sugerencias críticas. Esta investigación fue apoyada por el Proyecto Clave de la Comisión de Salud de Jiangsu (K2019030). La conceptualización fue realizada por C.W. y Z.C., la metodología fue realizada por W.H. y M.L., la investigación fue realizada por W.H. y M.L., la curación de datos fue realizada por W.H., Z.Z., S.X. y M.L., la preparación original del borrador fue realizada por Z.Z., J.Z., S.X., W.H., y X.L., la revisión y edición fue realizada por Z.C., la administración del proyecto fue realizada por C.W. y Z.C., y la adquisición de fondos fue realizada por C.W. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.
Materials
| 0.5-10 μL Pipette tips | AXYGEN | T-300 | |
| 1.5 mL Boil proof microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 100-1000μL Pipette tips | KIRGEN | KG1313 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Nest | 601052 | |
| 200 μL Pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | |
| 3D gel | Avatarget | MA02 | |
| 48-well U bottom Plate | Avatarget | P02-48UWP | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Nest | 602052 | |
| Alamar Blue | Thermo | DAL1100 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL | #07010 | |
| Certified FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Deionized water | aladdin | W433884-500ml | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 11965-092 | |
| DMSO | sigma | D2650-100ML | |
| Excel sofware | Microsoft office | ||
| Graphpad prism sofware | GraphPad software | ||
| High Content Microscope and SMART system | Avatarget | 1-I01 | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X) | Gibco | 51300-044 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Penicillin/streptomycin Sol | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Scientific Fluoroskan Ascent | Thermo | Fluoroskan Ascent | |
| T25 Flask | JET Biofil | TCF012050 | |
| Trypsin, 0.25% (1X) | Hyclone | SH30042.01 |
Referências
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