יצירת ספרואידים תלת ממדיים להערכת תרופות
Summary
מאמר זה מדגים שיטה סטנדרטית לבניית ספרואידים תלת מימדיים של גידולים. כמו כן מתוארת אסטרטגיה לתצפית ספרואידית וניתוח למידה עמוקה מבוססת תמונה באמצעות מערכת הדמיה אוטומטית.
Abstract
בעשורים האחרונים, בנוסף לתאים חד-שכבתיים, פותחו ספרואידים סרטניים תלת-ממדיים ככלי רב עוצמה פוטנציאלי להערכת תרופות אנטי-סרטניות. עם זאת, שיטות התרבית הקונבנציונליות חסרות את היכולת לתפעל את ספרואידים הגידול באופן הומוגני ברמה התלת מימדית. כדי להתמודד עם מגבלה זו, במאמר זה, אנו מציגים שיטה נוחה ויעילה לבניית ספרואידים סרטניים בגודל ממוצע. בנוסף, אנו מתארים שיטה של ניתוח מבוסס תמונה באמצעות תוכנת ניתוח מבוססת בינה מלאכותית שיכולה לסרוק את כל הצלחת ולקבל נתונים על ספרואידים תלת מימדיים. נבדקו מספר פרמטרים. על ידי שימוש בשיטה סטנדרטית של בניית ספרואידים סרטניים ומערכת הדמיה וניתוח בתפוקה גבוהה, ניתן להגדיל באופן דרמטי את היעילות והדיוק של בדיקות תרופתיות המבוצעות על ספרואידים תלת מימדיים.
Introduction
סרטן הוא אחת המחלות המפחידות ביותר על ידי בני אדם, לא מעט בגלל שיעור התמותה הגבוה שלה1. בשנים האחרונות, האפשרות לטפל בסרטן גדלה כאשר טיפולים חדשים הוכנסו 2,3,4,5. מודלים דו-ממדיים (2D) ותלת ממדיים (3D) במבחנה משמשים לחקר סרטן בתנאי מעבדה. עם זאת, מודלים דו-ממדיים אינם יכולים להעריך באופן מיידי ומדויק את כל הפרמטרים החשובים המצביעים על רגישות אנטי-סרטנית; לכן, הם אינם מייצגים באופן מלא אינטראקציות in vivo בבדיקות טיפול תרופתי6.
מאז 2020, שוק התרבות התלת מימדי (3D) העולמי קיבל דחיפה משמעותית. על פי דיווח אחד של NASDAQ OMX, הערך העולמי של שוק תרביות התאים התלת-ממדיות יעלה על 2.7 מיליארד דולר עד סוף 2025. בהשוואה לשיטות תרבית דו-ממדיות, תרבית תאים תלת-ממדית מציגה תכונות מועילות, שניתן לייעל לא רק להתרבות והתמיינות אלא גם להישרדות ארוכת טווח 7,8. באמצעים כאלה, ניתן לדמות מיקרו-סביבות תאיות in vivo כדי להשיג אפיון מדויק יותר של הגידול, כמו גם פרופיל מטבולי, כך שניתן יהיה להבין טוב יותר שינויים גנומיים וחלבוניים. בשל כך, מערכות בדיקה תלת-ממדיות צריכות להיכלל כעת בפעולות פיתוח תרופות רגילות, במיוחד אלה המתמקדות בסינון והערכה של תרופות אנטי-סרטניות חדשות. גידולים תלת-ממדיים של קווי תאים מבוססים אימורטליים או תרביות תאים ראשוניות במבנים ספרואידים הם בעלי תכונות in vivo של גידולים כגון היפוקסיה וחדירת תרופות, כמו גם אינטראקציה בין תאים, תגובה ועמידות, וניתן לראות בהם מודל מחמיר ומייצג לביצוע בדיקות סקר לתרופות חוץ גופיות 9,10,11.
עם זאת, מודלים אלה של תרבות תלת ממדית סובלים גם ממספר בעיות שעשויות לקחת קצת זמן לפתור. ספרואידים של תאים יכולים להיווצר באמצעות פרוטוקולים אלה, אך הם נבדלים זה מזה בפרטים מסוימים, כגון זמן תרבית או הטמעת ג’לים12, כך שלא ניתן לשלוט היטב בכדורי תאים אלה תחת טווח גודל מוגבל. גודל הספרואידים עשוי להשפיע על עקביות בדיקת הכדאיות וניתוח ההדמיה. מיקרו-סביבות הגדילה וגורמי הגדילה משתנים גם הם, מה שעשוי להוביל למורפולוגיה שונה עקב הבדלים בהתמיינות בין תאים13. כיום יש צורך ברור בשיטה סטנדרטית, פשוטה וחסכונית לבניית כל סוגי הגידולים בגדלים מבוקרים.
מנקודת מבט אחרת, למרות שבדיקות הומוגניות וגישות הדמיה בעלות תוכן גבוה פותחו כדי להעריך מורפולוגיה, כדאיות וקצב צמיחה, הסינון בתפוקה גבוהה של מודלים תלת-ממדיים נותר אתגר מסיבות שונות שדווחו בספרות, כגון חוסר אחידות במיקום, בגודל ובמורפולוגיה של ספרואידים סרטניים14,15,16.
בפרוטוקול המוצג כאן, אנו מפרטים כל שלב בבניית ספרואידים גידוליים תלת-ממדיים ומתארים שיטה לתצפית וניתוח ספרואידים באמצעות מערכת הדמיה בעלת תפוקה גבוהה ותוכן גבוה הכוללת מיקוד אוטומטי, הדמיה אוטומטית וניתוח, בין מאפיינים מועילים אחרים. אנו מראים כיצד שיטה זו יכולה לייצר כדורי גידול תלת-ממדיים בגודל אחיד המתאימים להדמיה בתפוקה גבוהה. ספרואידים אלה מפגינים גם רגישות גבוהה לטיפול תרופתי בסרטן, וניתן לעקוב אחר שינויים מורפולוגיים בספרואידים באמצעות הדמיה בתוכן גבוה. לסיכום, אנו מדגימים את חוסנה של מתודולוגיה זו כאמצעי ליצירת מבנים תלת-ממדיים של גידולים למטרות הערכת תרופות.
Protocol
Representative Results
Discussion
המיקרו-סביבה ממלאת תפקיד חשוב בצמיחת הגידול. הוא עשוי להשפיע על מתן מטריצות חוץ-תאיות, שיפועי חמצן, תזונה ואינטראקציה מכנית, ובכך להשפיע על ביטוי גנים, מסלולי אותות ותפקודים רבים של תאי הגידול 19,20,21. במקרים רבים, תאים דו-ממדיים אינם מייצרים…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לכל חברי המעבדות שלנו על תרומתם והצעותיהם הקריטיות. מחקר זה נתמך על ידי פרויקט המפתח של ועדת הבריאות של ג’יאנגסו (K2019030). ההמשגה בוצעה על ידי C.W. ו- Z.C., המתודולוגיה בוצעה על ידי W.H. ו- M.L., החקירה בוצעה על ידי W.H. ו- M.L., איסוף הנתונים בוצע על ידי W.H., Z.Z., S.X. ו- M.L., הכנת הטיוטה המקורית בוצעה על ידי Z.Z., J.Z., S.X., W.H., ו-X.L., הסקירה והעריכה בוצעו על ידי Z.C., ניהול הפרויקט בוצע על ידי C.W. ו-Z.C., ורכישת המימון בוצעה על ידי C.W. כל המחברים קראו והסכימו לגרסה שפורסמה של כתב היד.
Materials
| 0.5-10 μL Pipette tips | AXYGEN | T-300 | |
| 1.5 mL Boil proof microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 100-1000μL Pipette tips | KIRGEN | KG1313 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Nest | 601052 | |
| 200 μL Pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | |
| 3D gel | Avatarget | MA02 | |
| 48-well U bottom Plate | Avatarget | P02-48UWP | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Nest | 602052 | |
| Alamar Blue | Thermo | DAL1100 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL | #07010 | |
| Certified FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Deionized water | aladdin | W433884-500ml | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 11965-092 | |
| DMSO | sigma | D2650-100ML | |
| Excel sofware | Microsoft office | ||
| Graphpad prism sofware | GraphPad software | ||
| High Content Microscope and SMART system | Avatarget | 1-I01 | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X) | Gibco | 51300-044 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Penicillin/streptomycin Sol | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Scientific Fluoroskan Ascent | Thermo | Fluoroskan Ascent | |
| T25 Flask | JET Biofil | TCF012050 | |
| Trypsin, 0.25% (1X) | Hyclone | SH30042.01 |
Referências
- Carioli, G., et al. European cancer mortality predictions for the year 2021 with focus on pancreatic and female lung cancer. Annals of Oncology. 32 (4), 478-487 (2021).
- Katti, A., Diaz, B. J., Caragine, C. M., Sanjana, N. E., Dow, L. E. CRISPR in cancer biology and therapy. Nature Reviews Cancer. 22 (5), 259-279 (2022).
- Abrantes, R., Duarte, H. O., Gomes, C., Walchili, S., Reis, C. A. CAR-Ts: New perspectives in cancer therapy. FEBS Letter. 596 (4), 403-416 (2022).
- Shokooohi, A., et al. Effect of targeted therapy and immunotherapy on advanced nonsmall-cell lung cancer outcomes in the real world. Cancer Medicine. 11 (1), 86-93 (2022).
- Chen, K., Zhang, Y., Qian, L., Wang, P. Emerging strategies to target RAS signaling in human cancer therapy. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 116 (2021).
- Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research. Pharmaceutics. 12 (12), 1186 (2020).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Qin, Y., Hu, X., Fan, W., Yan, J. A stretchable scaffold with electrochemical sensing for 3D culture, mechanical loading, and real-time monitoring of cells. Advanced Science. 8 (13), 2003738 (2021).
- Wartenberg, M., et al. Regulation of the multidrug resistance transporter P-glycoprotein in multicellular tumor spheroids by hypoxia-inducible factor (HIF-1) ad reactive oxygen species. FASEB Journal. 17 (3), 503-505 (2003).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nature Reviews Cancer. 6 (8), 583-592 (2006).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: How 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Brüningk, S. C., Rivens, I., Box, C., Oelfke, U., Ter Haar, G. 3D tumour spheroids for the prediction of the effects of radiation and hyperthermia treatments. Scientific Reports. 10, 1653 (2020).
- Graves, E. E., Maity, A., Thu Le, Q. The tumor microenvironment in non-small-cell lung cancer. Seminars in Radiation Oncology. 20 (3), 156-163 (2010).
- Kunz-Schughart, L. A., Frreyer, J. P., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model. Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).
- Carragher, N., et al. Concerns, challenges and promises of high-content analysis of 3D cellular models. Nature Review Drug Discovery. 17 (8), 606 (2018).
- Huang, Y., et al. Longitudinal morphological and physiological monitoring of three-dimensional tumor spheroids using optical coherence tomography. Journal of Visualized Experiments. (144), e59020 (2019).
- Yazdanfar, S., et al. Simple and robust image-baed autofocusing for digital microscopy. Optics Express. 16 (12), 8670-8677 (2008).
- Chen, Z., et al. Automated evaluation of tumor spheroid behavior in 3D culture using deep learning-based recognition. Biomaterials. 22 (272), 120770 (2021).
- Boucherit, N., Gorvel, L., Olive, D. 3D tumor models and their use for the testing of immunotherapies. Frontiers in Immunology. 11, 603640 (2020).
- Anastasiou, D., et al. Microenvironment factors shaping the cancer metabolism landscape. British Journal of Cancer. 116 (3), 277-286 (2017).
- Zhou, H., et al. Functions and clinical significance of mechanical tumor microenvironment: Cancer cell sensing, mechanobiology and metastasis. Cancer Communications. 43 (5), 374-400 (2022).
- Zhu, G. G., et al. Targeting KRAS cancers: From druggable therapy to druggable resistance. Molecular Cancer. 21 (1), 159 (2022).
- Ando, Y., Mariano, C., Shen, K. Engineered in vitro tumor models for cell-based immunotherapy. Acta Biomaterialia. 132, 345-359 (2021).
- Timmins, N. E., Dietmair, S., Nielsen, L. K. Hanging-drop multicellular spheroids as a model of tumor angiogenesis. Angiogenesis. 7 (2), 97-103 (2004).
- Costa, E. C., et al. 3D tumor spheroids: An overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).
- Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today. Technologies. 23, 27-36 (2017).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
