Очистка хроматина локуса гена с одной копией у Saccharomyces cerevisiae
Summary
В этом протоколе представлен локусоспецифический метод выделения хроматина, основанный на сайт-специфической рекомбинации, для очистки однокопийного гена, представляющего интерес в его нативном контексте хроматина, от почковавшихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
Основной организационной единицей эукариотического хроматина является частица ядра нуклеосомы (NCP), которая состоит из ДНК, обернутой ~1,7 раза вокруг октамера гистона. Хроматин определяется как сущность NCP и многих других белковых комплексов, включая транскрипционные факторы, ремоделирование хроматина и модифицирующие ферменты. До сих пор неясно, как эти белок-ДНК-взаимодействия организуются на уровне специфических геномных локусов на разных стадиях клеточного цикла. В основном это связано с текущими техническими ограничениями, которые затрудняют получение точных измерений таких динамических взаимодействий. В этой статье мы опишем усовершенствованный метод, сочетающий сайт-специфичную рекомбинацию с эффективным одноступенчатым протоколом аффинной очистки для выделения интересующего нас однокопийного гена в его нативном хроматиновом состоянии. Этот метод позволяет надежно обогащать целевой локус с помощью геномного хроматина, что делает этот метод эффективной стратегией для идентификации и количественной оценки белковых взаимодействий непредвзятым и систематическим образом, например, с помощью масс-спектрометрии. В дополнение к такому анализу состава, нативный хроматин, очищенный этим методом, вероятно, отражает ситуацию in vivo в отношении позиционирования нуклеосом и модификаций гистонов и, следовательно, поддается дальнейшему структурному и биохимическому анализу хроматина, полученного практически из любого геномного локуса у дрожжей.
Introduction
Динамическая организация эукариотических геномов в хроматин уплотняет ДНК, чтобы она помещалась в пределах ядра, обеспечивая при этом достаточную динамику для экспрессии генов и доступность регуляторных факторов. Отчасти эта универсальность опосредована нуклеосомой, основной единицей хроматина, которая состоит из основной частицы со 147.н. ДНК, обернутой ~1,7 раза вокруг октамера гистонов1. Нуклеосома представляет собой очень динамичную структуру по отношению к своему составу, с многочисленными вариантами гистонов и посттрансляционными модификациями (ПТМ) на N- и C-концевых хвостах гистонов. Кроме того, эукариотический хроматин взаимодействует с множеством других важных компонентов, таких как транскрипционные факторы, механизмы обработки ДНК и РНК, архитектурные белки, ферменты, участвующие в ремоделировании и модификации хроматина, и молекулы РНК, связанные с хроматином. Эти важнейшие механизмы, участвующие в транскрипции, репликации и репарации, требуют доступа к хроматину, который служит естественным субстратом для этих процессов. Следовательно, понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе этих трансакций ДНК, требует точного определения коллективных изменений в структуре хроматина в конкретных областях генома, где эти механизмы сходятся и способствуют биологическим реакциям.
Несмотря на идентификацию многочисленных факторов хроматина с помощью генетики и исследований белок-белкового взаимодействия, проведение прямого, непредвзятого и всестороннего анализа взаимодействий хроматина на конкретных участках генома остается существенным препятствием 2,3. Первоначально для масс-спектрометрической идентификации ассоциированных белков 4,5,6,7 можно было выделить только очень распространенные участки генома (т.е. повторяющиеся локусы) или многокопийные плазмиды. Ряд новых подходов, основанных на прямой гибридизации зондов захвата с хроматинизированной ДНК, бесконтактном биотинилировании с использованием системы CRISPR-dCas9 или связывании последовательно-специфических белков-адаптеров с интересующим локусом, начал распутывать протеом однокопийных локусов из геномов дрожжей и млекопитающих 8,9,10. Однако все эти методы требуют сшивания формальдегида для стабилизации белок-ДНК взаимодействий и ультразвуковой обработки для солюбилизации хроматина для последующей очистки. В совокупности обе манипуляции исключают возможность последующих структурно-функциональных исследований очищенного хроматина.
Чтобы преодолеть эти ограничения, мы ранее разработали методологию, которая использует сайт-специфическую рекомбинацию для извлечения целевых хромосомных доменов из дрожжей11,12. По сути, интересующая область генома окружена сайт-специфической R-рекомбиназой из Zygosaccharomyces rouxi и одновременно включает группу из трех сайтов связывания ДНК для прокариотического транскрипционного репрессора белка LexA (LexA) в пределах одной и той же области. Дрожжевые клетки содержат экспрессионную кассету для одновременной экспрессии R-рекомбиназы и белка LexA, соединенного с меткой тандемной аффинной очистки (TAP). После индукции R-рекомбиназы фермент эффективно удаляет целевой участок из хромосомы в виде кольцевого домена хроматина. Этот домен может быть очищен с помощью белка-адаптера LexA-TAP, который связывается с сайтами связывания ДНК LexA, а также с аффинной опорой. Этот метод недавно был использован для выделения отдельных доменов хроматина, содержащих выбранные репликационные источники13-й хромосомы дрожжей.
Одним из основных преимуществ этого подхода ex vivo является то, что он позволяет проводить функциональный анализ изолированного материала. Например, репликационные исходные домены, очищенные с помощью этого метода, могут быть подвергнуты анализу репликации in vitro для оценки эффективности возбуждения исходного сырья в пробирке из нативных хроматиновых матриц in vivo . В конечном счете, биохимическая и функциональная характеристика выделенного материала может позволить восстановить ядерные процессы с использованием очищенных белков вместе с нативным хроматиновым шаблоном. Таким образом, эта методология открывает захватывающие возможности в исследовании хроматина, поскольку можно будет проследить коллективные изменения состава и структуры хроматина в определенной области генома, претерпевающей определенную хромосомную трансакцию.
Protocol
Representative Results
Discussion
Идентификация факторов и хроматинового ландшафта конкретной целевой области генома по-прежнему представляет собой серьезную проблему в исследованиях хроматина18. Этот протокол описывает эффективную систему специфического удаления и очистки различных доменов хроматина…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа в лаборатории S.H. поддерживалась DFG через SFB1064 (идентификатор проекта 213249687), Европейским исследовательским советом (ERC Starting Grant 852798 ConflictResolution) и Обществом Гельмгольца.
Materials
| Yeast strains | |||
| Control Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR | Section 1, see references 13 and 14 | ||
| Recombination Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR | Section 1, see reference 13 and 14 | ||
| Plasmid | |||
| K238 plasmid | Section 1, see reference 13 Storage: Store at -20 °C |
||
| K071 Spike-in plasmid DNA | Section 7.1, see reference 13 Storage: Store at -20 °C |
||
| Reagents | |||
| Acetone | Carl Roth | 5025.1 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Ammonium acetate (NH4Ac) | Sigma Aldrich | A7262 | Section 6 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Ammonium solution (NH4OH) 25% | Merck Millipore | 533003 | Section 6 Storage: Store at room temperature |
| Ammonium sulfate | Santa Cruz | Sc-29085 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Bacto agar | BD (VWR) | 90000-760 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Bacto peptone | BD (VWR) | 211820 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 07604 | Section 7.2 Storage: Store at 4 °C |
| Chemiluminescent substrate kit | ThermoFisher | 34580 | Section 7.2 Storage: Store at 4 °C |
| Di-Sodium Hydrogen phosphate dodecahydrate | Merck | 1.06579.1000 | Section 2 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher | 15508013 | Section 4 Storage: Store at 4 °C |
| Ethanol | Merck | 100983 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Galactose (20% (w/v) stock) | Sigma Aldrich | G0625-1KG / 5KG | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Gel loading dye (6x) | BioLabs | B7024A | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Glusose | Sigma-Aldrich | G8270 | Section Storage: Store at room temperature |
| Glycine | Carl Roth | .0079.4 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Glycogen (5 mg/mL) | Invitrogen | AM9510 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Hydrochloric acid (HCl) | PanReac AppliChem | 182109.1211 | Section 2, 4 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Magnesium Acetate (MgAc) | Bernd Kraft | 15274.2600/C035 | Section 4 Storage: Store at room temperature |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M8266 | Section 6 Storage: Store at room temperature |
| Nu PAGE LDS sample buffer (4x) | Invitrogen | 2399549 | Section 7.2 Storage: Store at room temperature |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1 v/v) | Invitrogen | 15593-031 | Section 7.1 Storage: Store at 4 °C |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | Section 4 Storage: Store at room temperature |
| Radioactively labeled α-32P dATP (3,000 Ci/mmol, 10 mCi/mL) | Hartmann Analytic | SRP-203 | Section 7.1 Storage: Store at 4 °C |
| RadPrime labeling system | ThermoFisher | 18428-011 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Raffinose (20% (w/v) stock) | SERVA | 34140.03 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | K53710504142 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium citrate (Na3C6H5O7) | Sigma-Aldrich | 71402 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S5881 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium n-dodecyl sulfate (SDS) (5% stock (w/v) ) | Alfa Aesar | A11183 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71496 | Section 2 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium azide | Santa Cruz Biotechnology | sc-208393 | Section 2 Storage: Store at -20 °C |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | 90340 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Tris base | Chem Cruz | SC-3715B | Section 2 and 4 Storage: Store at room temperature |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | Section 2 and 4 Storage: Store at room temperature |
| Tween-20 | Bernd Kraft | 18014332 | Section 4 Storage: Store at room temperature |
| Yeast extract | BD (VWR) | 212720 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Yeast mating factor alpha (1 µg/mL stock ) | Biomol | Y2016.5 | Section 3 Storage: Store at -20 °C |
| Yeast Synthetic Drop-out medium Supplements without LEUCINE | Sigma Aldrich | Y1376 | Section 1, see reference 14 |
| Enzymes | |||
| HpaI restriction enzyme (5,000 U/mL) | NEB | R0105S | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) | ThermoFisher Scientific | 78446 | Section 4 Storage: Store at4 °C |
| Proteinase K (10 mg/mL) | SERVA | 33756 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| RNase A (10 mg/mL) | ThermoFisher | EN0531 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| TEV protease (10000 U/µL) | NEB | P8112S | Section 5 Storage: Store at -20 °C |
| Materials | |||
| BcMag Epoxy-Activated Magnetic Beads | Bioclone Inc. | FC-102 | Section 2 Storage: Store at 4 °C |
| Dry ice | Section 4 | ||
| Low-binding centrifuge tubes 2.0 mL | Eppendorf | 22431102 | Section 4 |
| Microspin G-25 Columns | Cytiva | 27-5325-01 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Parafilm | Merck | P7793 | Section 4 |
| Positive nylon membrane | Biozol | 11MEMP0001 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| PVDF transfer membrane | Immobilon-Merck Millipore | IPVH00010 | Section 7.2 Storage: Store at room temperature |
| SDS-PAGE gel 4-12% bis-tris (15 well, 1.5 mm) | Invitrogen | NP0336BOX | Section 7.2 Storage: Store at 4 °C |
| Syringe (25 mL) with luer fitting | Henke Sass Wolf | 4200-000V0 | Section 3 |
| Whatman paper (Grade 3MM CHR Cellulose Western Blotting Paper Sheet) | Cytiva | 3030-917 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Antibodies | |||
| Anti-LexA, rabbit polyclonal IgG, DNA binding region antibody | Merck Millipore | 06-719 | Section 7.2 Storage: Store at -20 °C |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Horseradish peroxidase conjugate | Invitrogen | G21234 | Section 7.2 Storage: Store at -20 °C |
| Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP) antibody produced in rabbit for the detection of TAP-tagged proteins | Sigma Aldrich | P1291-500UL | Section 7.2 Storage: Store at -20 °C |
| Rabbit IgG antibodies | Sigma | I5006-100MG | Section 2 Storage: Store at 4 °C |
| Primers (10 µM) | |||
| ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT | Section 7.1 | ||
| K071 Spike-in plasmid DNA: fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT | Section 7.1 | ||
| PCR fragment from yeast genomic DNA as a template for ARS316 amplification (for southern blot): fwd 5’- AAATTCTGCCCTTGATTCGT rev 5’- TTTGTTTATCTCATCACTAAT | Section 7.1 | ||
| PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT | Section 7.1 | ||
| Equipment | |||
| Coffee grinder | Gastroback | 42601 | Section 4 |
| Dewar flask | NAL GENE | 4150-2000 | Section 3 |
| DynaMag TM-2 magnetic rack | Invitrogen | 12321D | Section 4, 5 and 6 |
| Hybridization oven | Hybaid Mini10 | Ri418 | Section 2 |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424R | Section 4 and 7.1 |
| UV-crosslinker | Analytikjena | 95-0174-02 | Section 7.1 |
Referências
- Kornberg, R. D., Lorch, Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome. Cell. 98 (3), 285-294 (1999).
- Gauchier, M., van Mierlo, G., Vermeulen, M., Déjardin, J. Purification and enrichment of specific chromatin loci. Nature Methods. 17 (4), 380-389 (2020).
- Korthout, T., et al. Decoding the chromatin proteome of a single genomic locus by DNA sequencing. PLoS Biology. 16 (7), e2005542 (2018).
- Antão, J. M., Mason, J. M., Déjardin, J., Kingston, R. E. Protein landscape at Drosophila melanogaster telomere-associated sequence repeats. Molecular and Cellular Biology. 32 (12), 2170-2182 (2012).
- Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
- Ide, S., Dejardin, J. End-targeting proteomics of isolated chromatin segments of a mammalian ribosomal RNA gene promoter. Nature Communications. 6, 6674 (2015).
- Unnikrishnan, A., Gafken, P. R., Tsukiyama, T. Dynamic changes in histone acetylation regulate origins of DNA replication. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 430 (2010).
- Buxton, K. E., et al. Elucidating protein-DNA interactions in human alphoid chromatin via hybridization capture and mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3433-3442 (2017).
- Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of chromatin-associated proteins via sequence-specific capture and mass spectrometric protein identification in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Proteome Research. 13 (8), 3810-3825 (2014).
- Liu, S. J., et al. CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells. Science. 355, 7111 (2017).
- Hamperl, S., et al. Purification of specific chromatin domains from single-copy gene loci in Saccharomyces cerevisiae. Functional Analysis of DNA and Chromatin. 1094, 329-341 (2014).
- Hamperl, S., et al. Compositional and structural analysis of selected chromosomal domains from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 42 (1), 2 (2014).
- Weiβ, M. Single-copy locus proteomics of early- and late-firing DNA replication origins identifies a role of Ask1/DASH complex in replication timing control. Cell Reports. 42 (2), 112045 (2023).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Western blot membrane stripping for restaining protocol. Abcam Available from: https://www.abcam.com/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol (2023)
- Vermeulen, M., Déjardin, J. Locus-specific chromatin isolation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (5), 249-250 (2020).
