Methoden voor het inbedden van celvrije eiwitsynthesereacties in hydrogels op macroschaal
Summary
Hier presenteren we twee protocollen voor het inbedden van celvrije eiwitsynthesereacties in hydrogelmatrices op macroschaal zonder dat er een externe vloeibare fase nodig is.
Abstract
Synthetische gennetwerken bieden een platform voor wetenschappers en ingenieurs om nieuwe systemen te ontwerpen en te bouwen met functionaliteit gecodeerd op genetisch niveau. Hoewel het dominante paradigma voor de inzet van gennetwerken zich binnen een cellulair chassis bevindt, kunnen synthetische gennetwerken ook worden ingezet in celvrije omgevingen. Veelbelovende toepassingen van celvrije gennetwerken omvatten biosensoren, omdat deze apparaten zijn aangetoond tegen biotische (Ebola, Zika en SARS-CoV-2-virussen) en abiotische (zware metalen, sulfiden, pesticiden en andere organische verontreinigingen) doelen. Celvrije systemen worden meestal in vloeibare vorm ingezet in een reactievat. Het kunnen inbedden van dergelijke reacties in een fysieke matrix kan echter hun bredere toepassing in een bredere reeks omgevingen vergemakkelijken. Hiertoe zijn methoden ontwikkeld voor het inbedden van celvrije eiwitsynthese (CFPS) reacties in een verscheidenheid aan hydrogelmatrices. Een van de belangrijkste eigenschappen van hydrogels die bevorderlijk zijn voor dit werk is de hoogwaterreconstitutiecapaciteit van hydrogelmaterialen. Bovendien bezitten hydrogels fysische en chemische eigenschappen die functioneel gunstig zijn. Hydrogels kunnen worden gevriesdroogd voor opslag en gerehydrateerd voor later gebruik. Twee stapsgewijze protocollen voor de inclusie en bepaling van CFPS-reacties in hydrogels worden gepresenteerd. Ten eerste kan een CFPS-systeem via rehydratie met een cellysaat in een hydrogel worden opgenomen. Het systeem in de hydrogel kan vervolgens worden geïnduceerd of constitutief worden uitgedrukt voor volledige eiwitexpressie via de hydrogel. Ten tweede kan cellysaat worden geïntroduceerd in een hydrogel op het punt van polymerisatie en kan het hele systeem worden gevriesdroogd en op een later punt worden gerehydrateerd met een waterige oplossing die de inductor bevat voor het expressiesysteem gecodeerd in de hydrogel. Deze methoden hebben het potentieel om celvrije gennetwerken mogelijk te maken die sensorische mogelijkheden verlenen aan hydrogelmaterialen, met het potentieel voor inzet buiten het laboratorium.
Introduction
Synthetische biologie integreert verschillende technische disciplines om biologisch gebaseerde onderdelen, apparaten en systemen te ontwerpen en te engineeren die functies kunnen uitvoeren die niet in de natuur voorkomen. De meeste synthetische biologische benaderingen zijn nog steeds gebonden aan levende cellen. Celvrije synthetische biologiesystemen daarentegen vergemakkelijken ongekende niveaus van controle en vrijheid in ontwerp, waardoor meer flexibiliteit en een kortere tijd voor het ontwerpen van biologische systemen mogelijk zijn, terwijl veel van de beperkingen van traditionele op cellen gebaseerde genexpressiemethoden worden geëlimineerd 1,2,3. CFPS wordt gebruikt in een toenemend aantal toepassingen in tal van disciplines, waaronder het bouwen van kunstmatige cellen, het prototypen van genetische circuits, het ontwikkelen van biosensoren en het produceren van metabolieten 4,5,6. CFPS is ook bijzonder nuttig geweest voor het produceren van recombinante eiwitten die niet gemakkelijk tot expressie kunnen worden gebracht in levende cellen, zoals aggregatiegevoelige eiwitten, transmembraaneiwitten en toxische eiwitten 6,7,8.
CFPS wordt meestal uitgevoerd in vloeibare reacties. Dit kan echter in sommige situaties de inzet ervan beperken, omdat elk vloeistofcelvrij apparaat zich in een reactievat moet bevinden. De reden voor de ontwikkeling van de hier gepresenteerde methoden was om robuuste protocollen te bieden voor het inbedden van celvrije synthetische biologie-apparaten in hydrogels, niet als een eiwitproductieplatform op zich, maar in plaats daarvan om het gebruik van hydrogels mogelijk te maken als een fysiek chassis voor de inzet van celvrije apparaten buiten het laboratorium. Het gebruik van hydrogels als CFPS-chassis heeft verschillende voordelen. Hydrogels zijn polymere materialen die, ondanks een hoog watergehalte (soms meer dan 98%), vaste eigenschappen bezitten 9,10,11. Ze hebben toepassingen als pasta’s, smeermiddelen en lijmen en zijn aanwezig in producten zo divers als contactlenzen, wondverbanden, mariene kleefbanden, bodemverbeteraars en babyluiers 9,11,12,13,14. Hydrogels worden ook actief onderzocht als drug delivery vehicles 9,15,16,17. Hydrogels kunnen ook biocompatibel zijn, biologisch afbreekbaar en beschikken over een aantal stimulireacties van huneigen 9,18,19,20. Daarom is het doel hier om een synergie te creëren tussen van moleculaire biologie afgeleide functionaliteit en materiaalkunde. Hiertoe zijn inspanningen geleverd om celvrije synthetische biologie te integreren met een reeks materialen, waaronder collageen, laponiet, polyacrylamide, fibrine, PEG-peptide en agarose 11,21,22, evenals om oppervlakken van glas, papier en doek te coaten 11,23,24 met CFPS-apparaten. De hier gepresenteerde protocollen demonstreren twee methoden voor het inbedden van CFPS-reacties in hydrogelmatrices op macroschaal (d.w.z. >1 mm), met agarose als voorbeeldmateriaal. Agarose werd gekozen vanwege zijn hoge waterabsorptiecapaciteit, gecontroleerde zelf-gelenerende eigenschappen en instelbare mechanische eigenschappen 11,24,25,26. Agarose ondersteunt ook functionele CFPS, is goedkoper dan veel andere hydrogel-alternatieven en is biologisch afbreekbaar, waardoor het een aantrekkelijke keuze is als experimenteel modelsysteem. Deze methoden zijn echter eerder aangetoond als geschikt voor het inbedden van CFPS in een reeks alternatieve hydrogels11. Gezien het brede scala aan toepassingen van hydrogels en de functionaliteit van CFPS, kunnen de hier gedemonstreerde methoden een basis vormen van waaruit onderzoekers biologisch verbeterde hydrogelmaterialen kunnen ontwikkelen die geschikt zijn voor hun eigen doeleinden.
In eerdere studies zijn microgelsystemen met een groottebereik van 1 μm tot 400 μm gebruikt om CFPS uit te voeren in hydrogels ondergedompeld in reactiebuffer 23,27,28,29,30,31. De eis om hydrogels onder te dompelen in CFPS-reactiebuffers beperkt echter de mogelijkheden voor hun inzet als materiaal op zich. De hier gepresenteerde protocollen maken het mogelijk om CFPS-reacties op te treden in hydrogels zonder de gels onder te dompelen in reactiebuffers. Ten tweede maakt het gebruik van macroscale gels (tussen 2 mm en 10 mm groot) de studie van de fysieke interactie tussen hydrogels en celvrije genexpressie mogelijk. Met deze techniek is het bijvoorbeeld mogelijk om te bestuderen hoe de hydrogelmatrix CFPS-reacties11 beïnvloedt en hoe CFPS-reacties de hydrogelmatrix31 kunnen beïnvloeden. Grotere maten hydrogels maken ook de ontwikkeling van nieuwe, bio-programmeerbare materialen mogelijk32. Ten slotte is er, door CFPS-reacties in hydrogels in te bedden, ook een potentiële vermindering van de behoefte aan plastic reactievaten. Voor de inzet van celvrije sensoren heeft dit duidelijke voordelen ten opzichte van apparaten die afhankelijk zijn van plasticware. Al met al biedt het inbedden van CFPS-reacties in hydrogels verschillende voordelen voor de inzet van celvrije apparaten buiten het laboratorium.
Het algemene doel van de hier gepresenteerde methoden is om de werking van CFPS-reacties binnen hydrogelmatrices mogelijk te maken. Er worden twee verschillende methoden gedemonstreerd voor het inbedden van celvrije eiwitproductiereacties in hydrogelmaterialen op macroschaal (figuur 1). In methode A worden CFPS-componenten geïntroduceerd in gelyofiliseerde agarose-hydrogels om een actief systeem te vormen. In methode B wordt gesmolten agarose gemengd met CFPS-reactiecomponenten om een compleet CFPS-hydrogelsysteem te vormen, dat vervolgens wordt gelyofiliseerd en opgeslagen totdat het nodig is. Deze systemen kunnen worden gerehydrateerd met een volume water of buffer en analyt om de reactie te starten.
Deze studie maakt gebruik van op Escherichia coli cellysaat gebaseerde systemen. Dit zijn enkele van de meest populaire experimentele CFPS-systemen, omdat E. coli-cellysaatpreparaat eenvoudig en goedkoop is en hoge eiwitopbrengsten bereikt. Het cellysaat wordt aangevuld met de macromoleculaire componenten die nodig zijn om transcriptie en translatie uit te voeren, waaronder ribosomen, tRNA’s, aminoacyl-tRNA-synthetasen en initiatie-, rek- en beëindigingsfactoren. In het bijzonder demonstreert dit artikel de productie van eGFP en mCherry in agarose hydrogels met behulp van E. coli-cellysaten en controleert het het uiterlijk van fluorescentie met behulp van een plaatlezer en confocale microscopie. Representatieve resultaten voor de microtiterplaatlezer zijn te zien in Whitfield et al.31, en de onderliggende gegevens zijn openbaar beschikbaar33. Verder wordt de expressie van fluorescerende eiwitten in de gels bevestigd met behulp van confocale microscopie. De twee protocollen die in dit artikel worden gedemonstreerd, maken de assemblage en opslag van op CFPS gebaseerde genetische apparaten in materia mogelijk met als uiteindelijk doel een geschikte fysieke omgeving te creëren voor de distributie van celvrije gencircuits op een manier die de inzet in het veld ondersteunt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier worden twee protocollen beschreven voor de opname van op E. coli-cellysaat gebaseerde CFPS-reacties in agarose-hydrogels . Deze methoden maken gelijktijdige genexpressie in het hele materiaal mogelijk. Het protocol kan worden aangepast voor andere CFPS-systemen en is met succes uitgevoerd met in de handel verkrijgbare CFPS-kits naast de in het laboratorium bereide cellysaten die hier worden beschreven. Belangrijk is dat het protocol genexpressie mogelijk maakt in afwezigheid van een externe vloeibare fase. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen de steun van de Biotechnology and Biological Sciences Research Council awards BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) en BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.), en de Engineering and Physical Sciences Research Council – Defence Science and Technology Laboratories award EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). Gegevens ter ondersteuning van deze publicatie zijn open beschikbaar op: 10.25405/data.ncl.22232452. Met het oog op open access heeft de auteur een Creative Commons Attribution (CC BY) licentie toegepast op elke Author Accepted Manuscript-versie die ontstaat.
Materials
| Material | |||
| 3-PGA | Santa Cruz Biotechnology | sc-214793B | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Agar | Thermo Fisher Scientific | A10752.22 | |
| Agarose | Severn Biotech | 30-15-50 | |
| Amino Acid Sampler Kit | VWR | BTRABR1401801 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937-1G | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501-1G | |
| Coenzyme A (CoA) | Sigma-Aldrich | C4282-100MG | |
| CTP | Alfa Aesar | J14121.MC | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0862 | |
| Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| GTP | Carbosynth | NG01208 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149-100G | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522-250MG | |
| PEG-8000 | Promega | V3011 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 757551-5G | |
| Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | RDD037-500G | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714-1BTL | |
| Qubit Protein concentration kit | Thermo Fisher Scientific | A50668 | |
| Rossetta 2 DE 3 E.coli | Sigma-Aldrich | 71397-3 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558-1G | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | 211705 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | GE17-1321-01 | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| UTP | Alfa Aesar | J23160.MC | |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | |
| Equipment | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | HS4323-500EA | |
| 10K MWCO dialysis cassettes | Thermo Fisher Scientific | 66381 | |
| 15 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 50 mL centrifuge bottles | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 500 mL centrifuge bottles | Thermo Fisher Scientific | 3120-9500 | |
| Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer | Christ | part no. 101521, 101522, 101527 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | H-X3R | |
| Black 384 well microtitre plates | Fischer Scientific | 66 | |
| Cuvettes | Thermo Fisher Scientific | 222S | |
| Elga Purelab Chorus | Elga | ##### | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5425R | Eppendorf | EP00532 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | B34183 | |
| JMP license | SAS Institute | 15 | |
| Magnetic Stirrer | Fischer Scientific | 15353518 | |
| Parafilm | Amcor | PM-966 | |
| Photospectrometer (Biophotometer) | Eppendorf | 16713 | |
| Pipettes and tips | Gilson | ##### | |
| Precision Balance | Sartorius | 16384738 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Shaking Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Sonic Dismembrator (Sonicator) | Thermo Fisher Scientific | 12893543 | |
| Static Incubator | Sanyo | MIR-162 | |
| Syringe and needles | Thermo Fisher Scientific | 66490 | |
| Thermo max Q8000 (Shaking Incubator) | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Varioskan Lux platereader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00GD1 | |
| Vortex Genie 2 | Cole-parmer | OU-04724-05 | |
| VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter | VWR | 662-1657 |
Referências
- Lu, Y. Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world. Synthetic and System Biotechnology. 2 (1), 23-27 (2017).
- Perez, J. G., Stark, J. C., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Engineering beyond the cell. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (12), e023853 (2016).
- Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology. Synthetic and System Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).
- Kopniczky, M. B., et al. Cell-free protein synthesis as a prototyping platform for mammalian synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 144-156 (2020).
- Pandi, A., Grigoras, I., Borkowski, O., Faulon, J. L. Optimizing cell-free biosensors to monitor enzymatic production. ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1952-1957 (2019).
- Khambhati, K., Bhattacharjee, G., Gohil, N., Braddick, D., Kulkarni, V. S. V. Exploring the potential of cell-free protein synthesis for extending the abilities of biological systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 248 (2019).
- Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Bioquímica. 55 (30), 4212-4219 (2016).
- Fogeron, M. L., Lecoq, L., Cole, L., Harbers, M., Böckmann, A. Easy synthesis of complex biomolecular assemblies: wheat germ cell-free protein expression in structural biology. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 63958 (2021).
- Bashir, S., et al. Fundamental concepts of hydrogels: synthesis, properties, and their applications. Polymers. 12 (11), 2702 (2020).
- Loo, S. L., Vásquez, L., Athanassiou, A., Fragouli, D. Polymeric hydrogels-A promising platform in enhancing water security for a sustainable future. Advanced Material Interfaces. 8 (24), 2100580 (2021).
- Whitfield, C. J., et al. Cell-free protein synthesis in hydrogel materials. Chemical Communications. 56 (52), 7108-7111 (2020).
- Yao, H., et al. Design strategies for adhesive hydrogels with natural antibacterial agents as wound dressings: Status and trends. Materials Today Bio. 15, 100429 (2022).
- Musgrave, C. S. A., Fang, F. Contact lens materials: A materials science perspective. Materials. 12 (2), 261 (2019).
- Maher, A. J., Rana, A. G., Rawan, A. Recovery of hydrogel from baby diaper wastes and its application for enhancing soil irrigation management. Journal of Environmental Management. 239, 255-261 (2019).
- Vigata, M., Meinert, C., Hutmacher, D. W., Bock, N. Hydrogels as drug delivery systems: A review of current characterization and evaluation techniques. Pharmaceutics. 12 (12), 1188 (2020).
- Jacob, S., et al. Emerging role of hydrogels in drug delivery systems, tissue engineering and wound management. Pharmaceutics. 3 (3), 357 (2021).
- Senapati, S., et al. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7 (2018).
- Chen, Y., et al. A biocompatible, stimuli-responsive, and injectable hydrogel with triple dynamic bonds. Molecules. 25 (13), 3050 (2020).
- Shi, Q., et al. Bioactuators based on stimulus-responsive hydrogels and their emerging biomedical applications. NPG Asia Materials. 11, 64 (2019).
- Fan, M., Tan, H. Biocompatible conjugation for biodegradable hydrogels as drug and cell scaffolds. Cogent Engineering. 7 (1), 1736407 (2020).
- Byun, J. Y., Lee, K. H., Lee, K. Y., Kim, M. G., Kim, D. M. In-gel expression and in situ immobilization of proteins for generation of three-dimensional protein arrays in a hydrogel matrix. Lab on a Chip. 13 (5), 886-891 (2013).
- Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
- Huang, A., et al. BiobitsTM explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 5105 (2018).
- Jaramillo-Isaza, S., Alfonso-Rodriguez, C. A., Rios-Rojas, J. F., García-Guzmán, J. A. Dynamic mechanical analysis of agarose-based biopolymers with potential use in regenerative medicine. Materials Today Proceeding. 49, 16-22 (2022).
- Wang, B. X., Xu, W., Yang, Z., Wu, Y. An overview on recent progress of the hydrogels: from material resources, properties to functional applications. Macromolecular Rapid Communications. 43 (6), 2100785 (2022).
- Salati, M. A., et al. Agarose-based biomaterials: Opportunities and challenges in cartilage tissue engineering. Polymers. 12 (5), 1150 (2020).
- Buddingh, B. C., Van Hest, J. C. M. Artificial cells: Synthetic compartments with life-like functionality and adaptivity. Accounts of Chemical Research. 50 (4), 769-777 (2017).
- Kahn, J. S., et al. DNA microgels as a platform for cell-free protein expression and display. Biomacromolecules. 17 (6), 2019-2026 (2016).
- Yang, D., et al. Enhanced transcription and translation in clay hydrogel and implications for early life evolution. Scientific Reports. 3, 3165 (2013).
- Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
- Whitfield, C. J., et al. Cell-free genetic devices confer autonomic and adaptive properties to hydrogels. BioRxiv. , (2019).
- Feng, L., Jianpu, T., Jinhui, G. D., Luo, D. Y. Polymeric DNA hydrogel: Design, synthesis and applications. Progress in Polymer Science. 98, 101163 (2019).
- Howard, T., et al. Datasets for Whitfield et al. 2020 Chemical Communications. , (2020).
- Banks, A. M., et al. Key reaction components affect the kinetics and performance robustness of cell-free protein synthesis reactions. Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 218-229 (2022).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli-based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
- Benítez-Mateos, A. I., et al. Micro compartmentalized cell-free protein synthesis in hydrogel µ-channels. ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2971-2978 (2020).
