거시적 규모의 하이드로겔에 cell-free 단백질 합성 반응을 임베딩하는 방법
Summary
여기에서 우리는 외부 액상 없이 매크로 스케일 하이드로겔 매트릭스에 cell-free 단백질 합성 반응을 포함하기 위한 두 가지 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
합성 유전자 네트워크는 과학자와 엔지니어가 유전자 수준에서 인코딩된 기능을 갖춘 새로운 시스템을 설계하고 구축할 수 있는 플랫폼을 제공합니다. 유전자 네트워크 배치에 대한 지배적인 패러다임은 세포 섀시 내에 있지만 합성 유전자 네트워크는 무세포 환경에도 배치될 수 있습니다. 무세포 유전자 네트워크의 유망한 응용 분야에는 바이오센서가 포함되며, 이러한 장치는 생물(에볼라, 지카 및 SARS-CoV-2 바이러스) 및 비생물적(중금속, 황화물, 살충제 및 기타 유기 오염 물질) 표적에 대해 입증되었습니다. Cell-free 시스템은 일반적으로 반응 용기 내에 액체 형태로 배치됩니다. 그러나 이러한 반응을 물리적 매트릭스에 포함시킬 수 있으면 더 넓은 환경에서 더 광범위한 적용을 용이하게 할 수 있습니다. 이를 위해, 다양한 하이드로겔 매트릭스에 무세포 단백질 합성(cell-free protein synthesis, CFPS) 반응을 내장하는 방법들이 개발되었다. 이 작업에 도움이 되는 하이드로겔의 주요 특성 중 하나는 하이드로겔 재료의 고수위 재구성 능력입니다. 또한 하이드로겔은 기능적으로 유익한 물리적, 화학적 특성을 가지고 있습니다. 하이드로겔은 저장을 위해 동결 건조하고 나중에 사용하기 위해 재수화할 수 있습니다. 하이드로겔에 CFPS 반응을 포함시키고 분석하기 위한 두 가지 단계별 프로토콜이 제시됩니다. 첫째, CFPS 시스템은 세포 용해물로 재수화를 통해 하이드로겔에 통합될 수 있습니다. 이어서, 하이드로겔 내의 시스템은 하이드로겔을 통해 완전한 단백질 발현을 위해 구성적으로 유도 또는 발현될 수 있다. 둘째, 세포 용해물은 중합 시점에서 하이드로겔에 도입될 수 있고, 전체 시스템은 하이드로겔 내에서 코딩되는 발현 시스템을 위한 유도제를 함유하는 수용액으로 동결건조 및 추후 시점에서 재수화될 수 있다. 이러한 방법은 하이드로겔 물질에 감각 기능을 부여하는 무세포 유전자 네트워크를 허용할 수 있는 잠재력을 가지고 있으며 실험실 외부로 배포할 수 있습니다.
Introduction
합성 생물학은 다양한 공학 분야를 통합하여 자연에서 볼 수 없는 기능을 수행할 수 있는 생물학적 기반 부품, 장치 및 시스템을 설계하고 엔지니어링합니다. 대부분의 합성 생물학 접근법은 여전히 살아있는 세포에 묶여 있습니다. 대조적으로, cell-free 합성 생물학 시스템은 전례 없는 수준의 제어와 설계의 자유를 촉진하여 전통적인 세포 기반 유전자 발현 방법 1,2,3의 많은 제약을 제거하면서 생물학적 시스템 엔지니어링을 위한 유연성을 높이고 시간을 단축할 수 있습니다. CFPS는 인공 세포 구성, 유전 회로 프로토타이핑, 바이오센서 개발, 대사산물 생산 등 다양한 분야에서 점점 더 많은 응용 분야에서 사용되고 있습니다 4,5,6. CFPS는 또한 응집되기 쉬운 단백질, 막횡단 단백질 및 독성 단백질 6,7,8과 같이 살아있는 세포에서 쉽게 발현될 수 없는 재조합 단백질을 생산하는 데 특히 유용했습니다.
CFPS는 일반적으로 액체 반응에서 수행됩니다. 그러나 이것은 액체 무세포 장치가 반응 용기 내에 포함되어야 하기 때문에 일부 상황에서는 배치를 제한할 수 있습니다. 여기에 제시된 방법 개발의 근거는 단백질 생산 플랫폼 자체가 아니라 하이드로겔을 물리적 섀시로 사용할 수 있도록 하기 위해 무세포 합성 생물학 장치를 하이드로겔에 내장하기 위한 강력한 프로토콜을 제공하는 것이었습니다. 하이드로겔을 CFPS 섀시로 사용하면 몇 가지 장점이 있습니다. 하이드로겔은 높은 수분 함량(때로는 98% 초과)에도 불구하고 고체 특성 9,10,11을 갖는 고분자 물질입니다. 그들은 페이스트, 윤활제 및 접착제로 사용되며 콘택트 렌즈, 상처 드레싱, 해양 접착 테이프, 토양 개량제 및 아기 기저귀와 같은 다양한 제품에 존재합니다 9,11,12,13,14. 하이드로겔은 또한 약물 전달 비히클로서 활발히 연구되고 있다 9,15,16,17. 하이드로겔은 또한 생체적합성, 생분해성일 수 있으며, 그들 자신의자극 반응을 가질 수 있다 9,18,19,20. 따라서 여기서 목표는 분자 생물학에서 파생된 기능성과 재료 과학 간의 시너지 효과를 창출하는 것입니다. 이를 위해 콜라겐, 라포나이트, 폴리아크릴아미드, 피브린, PEG-펩타이드 및 아가로스 11,21,22를 포함한 다양한 물질과 무세포 합성 생물학을 통합하고 유리, 종이 및 천 11,23,24의 표면을 코팅하기 위한 노력이 이루어졌습니다 CFPS 장치로. 여기에 제시된 프로토콜은 아가로스를 예시 물질로 사용하여 거시적 규모(즉, >1mm) 하이드로겔 매트릭스에 CFPS 반응을 매립하는 두 가지 방법을 보여줍니다. 아가로스는 그의 높은 수분 흡수 능력, 제어된 자가-겔화 특성, 및 조정 가능한 기계적 특성 11,24,25,26 때문에 선택되었다. Agarose는 또한 기능성 CFPS를 지원하고 다른 많은 하이드로겔 대안보다 저렴하며 생분해성이어서 실험 모델 시스템으로 매력적인 선택입니다. 그러나, 이들 방법들은 이전에 CFPS를 다양한 대안적 하이드로겔에 매립시키기에 적합한 것으로 입증되었다(11). 하이드로겔의 광범위한 응용과 CFPS의 기능을 고려할 때, 여기에서 입증된 방법은 연구자들이 자신의 목적에 적합한 생물학적으로 강화된 하이드로겔 재료를 개발할 수 있는 기반을 제공할 수 있습니다.
이전 연구에서, 1 μm 내지 400 μm의 크기 범위를 갖는 마이크로겔 시스템은 반응 완충액 23,27,28,29,30,31에 잠긴 하이드로겔에서 CFPS를 수행하기 위해 사용되었다. 그러나 CFPS 반응 완충액 내에 하이드로겔을 담그야 한다는 요구 사항은 그 자체로 물질로 배치할 수 있는 기회를 제한합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 반응 완충액에 겔을 담그지 않고도 하이드로겔 내에서 CFPS 반응이 일어날 수 있도록 합니다. 둘째, 거대 스케일 젤(2mm에서 10mm 사이)을 사용하면 하이드로겔과 무세포 유전자 발현 사이의 물리적 상호작용을 연구할 수 있습니다. 예를 들어, 이 기술을 이용하여, 하이드로겔 매트릭스가 CFPS 반응(11)에 어떻게 영향을 미치는지, 그리고 CFPS 반응이 하이드로겔 매트릭스(31)에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지를 연구할 수 있다. 더 큰 크기의 하이드로겔은 또한 신규한, 생체-프로그램가능한 물질의 개발을 가능하게 한다32. 마지막으로, CFPS 반응을 하이드로겔에 내장함으로써 플라스틱 반응 용기에 대한 요구 사항도 잠재적으로 감소할 수 있습니다. cell-free 센서의 배치를 위해, 이것은 플라스틱 제품에 의존하는 장치에 비해 분명한 이점이 있습니다. 종합하면, 하이드로겔에 CFPS 반응을 내장하면 실험실 이외의 무세포 장치를 배치할 때 몇 가지 이점이 있습니다.
여기에 제시된 방법의 전반적인 목표는 하이드로겔 매트릭스 내에서 CFPS 반응의 작동을 허용하는 것입니다. 거시적 규모의 하이드로겔 재료에 cell-free 단백질 생산 반응을 임베딩하기 위한 두 가지 방법이 시연됩니다(그림 1). 방법 A에서, CFPS 성분은 활성 시스템을 형성하기 위해 동결건조된 아가로스 히드로겔에 도입된다. 방법 B에서, 용융된 아가로스를 CFPS 반응 성분과 혼합하여 완전한 CFPS 하이드로겔 시스템을 형성한 다음, 동결건조하고 필요할 때까지 저장한다. 이러한 시스템은 대량의 물 또는 완충액으로 재수화되고 분석물이 반응을 시작할 수 있습니다.
이 연구는 대장균 세포 용해물 기반 시스템을 사용합니다. 이들은 대장균 세포 용해물 준비가 간단하고 저렴하며 높은 단백질 수율을 달성하기 때문에 가장 인기 있는 실험용 CFPS 시스템 중 일부입니다. 세포 용해물은 리보솜, tRNA, 아미노아실-tRNA 합성효소, 개시, 신장 및 종결 인자를 포함하여 전사 및 번역을 수행하는 데 필요한 거대분자 성분으로 보완됩니다. 특히, 이 논문은 대장균 세포 용해물을 사용하여 아가로스 하이드로겔에서 eGFP 및 mCherry의 생산을 보여주고 플레이트 리더 및 컨포칼 현미경을 사용하여 형광의 외관을 모니터링합니다. 마이크로타이터 플레이트 판독기에 대한 대표적인 결과는 Whitfield et al.31에서 볼 수 있으며, 기본 데이터는 공개적으로 이용 가능하다 33. 또한, 겔 전체에 걸친 형광 단백질의 발현은 공초점 현미경을 사용하여 확인된다. 이 논문에서 입증된 두 가지 프로토콜은 현장 배치를 지원하는 방식으로 cell-free 유전자 회로의 분포에 적합한 물리적 환경을 만드는 궁극적인 목표와 함께 재료에서 CFPS 기반 유전자 장치의 조립 및 저장을 허용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 요약된 것은 대장균 세포 용해물 기반 CFPS 반응을 아가로스 하이드로겔에 통합하기 위한 두 가지 프로토콜입니다. 이러한 방법은 물질 전체에 걸쳐 동시 유전자 발현을 허용합니다. 이 프로토콜은 다른 CFPS 시스템에 적용할 수 있으며 여기에 자세히 설명된 실험실에서 준비한 세포 용해물 외에도 상업적으로 이용 가능한 CFPS 키트를 사용하여 성공적으로 수행되었습니다. 중요하게도…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 생명 공학 및 생물 과학 연구 위원회(Biotechnology and Biological Sciences Research Council) 상 BB/V017551/1(S.K., T.P.H.) 및 BB/W01095X/1(A.L., T.P.H.)과 공학 및 물리 과학 연구 위원회(Engineering and Physical Sciences Research Council) – 국방 과학 기술 연구소(Defense Science and Technology Laboratories) 상 EP/N026683/1(C.J.W., A.M.B., T.P.H.)의 지원을 크게 인정합니다. 이 간행물을 뒷받침하는 데이터는 10.25405/data.ncl.22232452에서 공개적으로 사용할 수 있습니다. 오픈 액세스를 위해 저자는 발생하는 모든 저자 수락 원고 버전에 CC BY(Creative Commons Attribution) 라이선스를 적용했습니다.
Materials
| Material | |||
| 3-PGA | Santa Cruz Biotechnology | sc-214793B | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Agar | Thermo Fisher Scientific | A10752.22 | |
| Agarose | Severn Biotech | 30-15-50 | |
| Amino Acid Sampler Kit | VWR | BTRABR1401801 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937-1G | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501-1G | |
| Coenzyme A (CoA) | Sigma-Aldrich | C4282-100MG | |
| CTP | Alfa Aesar | J14121.MC | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0862 | |
| Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| GTP | Carbosynth | NG01208 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149-100G | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522-250MG | |
| PEG-8000 | Promega | V3011 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 757551-5G | |
| Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | RDD037-500G | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714-1BTL | |
| Qubit Protein concentration kit | Thermo Fisher Scientific | A50668 | |
| Rossetta 2 DE 3 E.coli | Sigma-Aldrich | 71397-3 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558-1G | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | 211705 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | GE17-1321-01 | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| UTP | Alfa Aesar | J23160.MC | |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | |
| Equipment | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | HS4323-500EA | |
| 10K MWCO dialysis cassettes | Thermo Fisher Scientific | 66381 | |
| 15 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 50 mL centrifuge bottles | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 500 mL centrifuge bottles | Thermo Fisher Scientific | 3120-9500 | |
| Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer | Christ | part no. 101521, 101522, 101527 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | H-X3R | |
| Black 384 well microtitre plates | Fischer Scientific | 66 | |
| Cuvettes | Thermo Fisher Scientific | 222S | |
| Elga Purelab Chorus | Elga | ##### | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5425R | Eppendorf | EP00532 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | B34183 | |
| JMP license | SAS Institute | 15 | |
| Magnetic Stirrer | Fischer Scientific | 15353518 | |
| Parafilm | Amcor | PM-966 | |
| Photospectrometer (Biophotometer) | Eppendorf | 16713 | |
| Pipettes and tips | Gilson | ##### | |
| Precision Balance | Sartorius | 16384738 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Shaking Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Sonic Dismembrator (Sonicator) | Thermo Fisher Scientific | 12893543 | |
| Static Incubator | Sanyo | MIR-162 | |
| Syringe and needles | Thermo Fisher Scientific | 66490 | |
| Thermo max Q8000 (Shaking Incubator) | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Varioskan Lux platereader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00GD1 | |
| Vortex Genie 2 | Cole-parmer | OU-04724-05 | |
| VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter | VWR | 662-1657 |
Referências
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