Metodi per incorporare reazioni di sintesi proteica cellulo-free in idrogel su macroscala
Summary
Qui, presentiamo due protocolli per incorporare reazioni di sintesi proteica cellulo-free in matrici di idrogel su macroscala senza la necessità di una fase liquida esterna.
Abstract
Le reti di geni sintetici forniscono una piattaforma per scienziati e ingegneri per progettare e costruire nuovi sistemi con funzionalità codificate a livello genetico. Mentre il paradigma dominante per l’implementazione di reti geniche è all’interno di un telaio cellulare, le reti genetiche sintetiche possono anche essere implementate in ambienti privi di cellule. Le applicazioni promettenti delle reti di geni privi di cellule includono i biosensori, poiché questi dispositivi sono stati dimostrati contro bersagli biotici (virus Ebola, Zika e SARS-CoV-2) e abiotici (metalli pesanti, solfuri, pesticidi e altri contaminanti organici). I sistemi privi di cellule sono tipicamente distribuiti in forma liquida all’interno di un recipiente di reazione. Essere in grado di incorporare tali reazioni in una matrice fisica, tuttavia, può facilitare la loro più ampia applicazione in un insieme più ampio di ambienti. A tal fine, sono stati sviluppati metodi per incorporare reazioni di sintesi proteica libera da cellule (CFPS) in una varietà di matrici di idrogel. Una delle proprietà chiave degli idrogel che favoriscono questo lavoro è l’elevata capacità di ricostituzione dell’acqua dei materiali idrogel. Inoltre, gli idrogel possiedono caratteristiche fisiche e chimiche funzionalmente vantaggiose. Gli idrogel possono essere liofilizzati per la conservazione e reidratati per un uso successivo. Vengono presentati due protocolli passo-passo per l’inclusione e il dosaggio delle reazioni CFPS negli idrogel. In primo luogo, un sistema CFPS può essere incorporato in un idrogel tramite reidratazione con un lisato cellulare. Il sistema all’interno dell’idrogel può quindi essere indotto o espresso costitutivamente per la completa espressione proteica attraverso l’idrogel. In secondo luogo, il lisato cellulare può essere introdotto in un idrogel nel punto di polimerizzazione e l’intero sistema può essere liofilizzato e reidratato in un secondo momento con una soluzione acquosa contenente l’induttore per il sistema di espressione codificato all’interno dell’idrogel. Questi metodi hanno il potenziale per consentire reti geniche prive di cellule che conferiscono capacità sensoriali ai materiali idrogel, con il potenziale per la distribuzione al di fuori del laboratorio.
Introduction
La biologia sintetica integra diverse discipline ingegneristiche per progettare e ingegnerizzare parti, dispositivi e sistemi a base biologica in grado di svolgere funzioni che non si trovano in natura. La maggior parte degli approcci di biologia sintetica sono ancora legati a cellule viventi. Al contrario, i sistemi di biologia sintetica senza cellule facilitano livelli senza precedenti di controllo e libertà nella progettazione, consentendo una maggiore flessibilità e un tempo ridotto per l’ingegnerizzazione dei sistemi biologici, eliminando al contempo molti dei vincoli dei tradizionali metodi di espressione genica basati sulle cellule 1,2,3. La CFPS viene utilizzata in un numero crescente di applicazioni in numerose discipline, tra cui la costruzione di cellule artificiali, la prototipazione di circuiti genetici, lo sviluppo di biosensori e la produzione di metaboliti 4,5,6. La CFPS è stata anche particolarmente utile per la produzione di proteine ricombinanti che non possono essere prontamente espresse nelle cellule viventi, come le proteine inclini all’aggregazione, le proteine transmembrana e le proteine tossiche 6,7,8.
La CFPS viene tipicamente eseguita in reazioni liquide. Questo, tuttavia, può limitarne l’impiego in alcune situazioni, poiché qualsiasi dispositivo privo di cellule liquide deve essere contenuto all’interno di un recipiente di reazione. La logica per lo sviluppo dei metodi qui presentati era quella di fornire protocolli robusti per incorporare dispositivi di biologia sintetica privi di cellule in idrogel, non come piattaforma di produzione di proteine di per sé ma, invece, per consentire l’uso di idrogel come telaio fisico per l’implementazione di dispositivi privi di cellule al di fuori del laboratorio. L’uso di idrogel come telaio CFPS presenta diversi vantaggi. Gli idrogel sono materiali polimerici che, nonostante un elevato contenuto di acqua (a volte superiore al 98%), possiedono proprietà solide 9,10,11. Hanno usi come paste, lubrificanti e adesivi e sono presenti in prodotti diversi come lenti a contatto, medicazioni per ferite, nastri adesivi marini, ammendanti e pannolini per bambini 9,11,12,13,14. Anche gli idrogel sono oggetto di studio attivo come veicoli di somministrazionedi farmaci 9,15,16,17. Gli idrogel possono anche essere biocompatibili, biodegradabili e possedere alcune risposte agli stimoliproprie 9,18,19,20. Pertanto, l’obiettivo è quello di creare una sinergia tra la funzionalità derivata dalla biologia molecolare e la scienza dei materiali. A tal fine, sono stati compiuti sforzi per integrare la biologia sintetica priva di cellule con una serie di materiali, tra cui collagene, laponite, poliacrilammide, fibrina, peptide PEG e agarosio 11,21,22, nonché per rivestire superfici di vetro, carta e stoffa11,23,24 con dispositivi CFPS. I protocolli qui presentati dimostrano due metodi per incorporare reazioni CFPS in matrici di idrogel su macroscala (cioè >1 mm), utilizzando l’agarosio come materiale esemplare. L’agarosio è stato scelto per la sua elevata capacità di assorbimento d’acqua, le proprietà autogelificanti controllate e le proprietà meccaniche regolabili 11,24,25,26. L’agarosio supporta anche la CFPS funzionale, è più economico di molte altre alternative all’idrogel ed è biodegradabile, il che lo rende una scelta interessante come sistema modello sperimentale. Tuttavia, questi metodi si sono dimostrati in precedenza appropriati per incorporare la CFPS in una gamma di idrogel alternativi11. Considerando l’ampia gamma di applicazioni degli idrogel e la funzionalità della CFPS, i metodi qui dimostrati possono fornire una base da cui i ricercatori sono in grado di sviluppare materiali idrogel biologicamente migliorati adatti ai propri scopi.
In studi precedenti, sono stati utilizzati sistemi microgel con una gamma di dimensioni da 1 μm a 400 μm per eseguire CFPS in idrogel immersi nel tampone di reazione 23,27,28,29,30,31. L’obbligo di immergere gli idrogel all’interno dei tamponi di reazione CFPS, tuttavia, limita le opportunità per il loro impiego come materiali a sé stanti. I protocolli qui presentati consentono alle reazioni CFPS di avvenire all’interno degli idrogel senza la necessità di immergere i gel nei tamponi di reazione. In secondo luogo, l’uso di gel su macroscala (di dimensioni comprese tra 2 mm e 10 mm) consente lo studio dell’interazione fisica tra idrogel ed espressione genica cell-free. Ad esempio, con questa tecnica, è possibile studiare come la matrice di idrogel influenzi le reazioni di CFPS11 e come le reazioni di CFPS possano influenzare la matrice di idrogel31. Le dimensioni maggiori degli idrogel consentono inoltre lo sviluppo di nuovi materiali bioprogrammabili32. Infine, incorporando le reazioni CFPS negli idrogel, c’è anche una potenziale riduzione della necessità di recipienti di reazione in plastica. Per l’impiego di sensori privi di celle, questo presenta chiari vantaggi rispetto ai dispositivi che dipendono dalla plastica. Nel complesso, l’incorporazione di reazioni CFPS in idrogel offre diversi vantaggi per l’implementazione di dispositivi privi di cellule al di fuori del laboratorio.
L’obiettivo generale dei metodi qui presentati è quello di consentire il funzionamento di reazioni CFPS all’interno di matrici di idrogel. Sono stati dimostrati due diversi metodi per incorporare reazioni di produzione di proteine prive di cellule in materiali idrogel su macroscala (Figura 1). Nel metodo A, i componenti della CFPS vengono introdotti in idrogel di agarosio liofilizzati per formare un sistema attivo. Nel metodo B, l’agarosio fuso viene miscelato con i componenti della reazione CFPS per formare un sistema completo di idrogel CFPS, che viene quindi liofilizzato e conservato fino al momento del bisogno. Questi sistemi possono essere reidratati con un volume di acqua o tampone e analita per iniziare la reazione.
Questo studio utilizza sistemi basati su lisato cellulare di Escherichia coli. Questi sono alcuni dei sistemi CFPS sperimentali più popolari, poiché la preparazione del lisato cellulare di E. coli è semplice, poco costosa e raggiunge elevate rese proteiche. Il lisato cellulare è integrato con i componenti macromolecolari necessari per eseguire la trascrizione e la traduzione, inclusi ribosomi, tRNA, aminoacil-tRNA sintetasi e fattori di inizio, allungamento e terminazione. In particolare, questo articolo dimostra la produzione di eGFP e mCherry in idrogel di agarosio utilizzando lisati cellulari di E. coli e monitora l’aspetto della fluorescenza utilizzando un lettore di piastre e microscopia confocale. I risultati rappresentativi per il lettore di piastre per microtitolazione possono essere visti in Whitfield et al.31 e i dati sottostanti sono disponibili al pubblico 33. Inoltre, l’espressione di proteine fluorescenti in tutti i gel è confermata utilizzando la microscopia confocale. I due protocolli dimostrati in questo documento consentono l’assemblaggio e la conservazione di dispositivi genetici basati su CFPS in materia con l’obiettivo finale di creare un ambiente fisico adatto per la distribuzione di circuiti genici privi di cellule de modo da supportare la distribuzione sul campo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Di seguito sono delineati due protocolli per l’incorporazione di reazioni CFPS a base di lisato di cellule di E. coli in idrogel di agarosio. Questi metodi consentono l’espressione genica simultanea in tutto il materiale. Il protocollo può essere adattato ad altri sistemi CFPS ed è stato condotto con successo con i kit CFPS disponibili in commercio, oltre ai lisati cellulari preparati in laboratorio descritti qui. È importante sottolineare che il protocollo consente l’espressione genica in assenza di una fase…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono il sostegno dei premi BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) e BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.), e del premio EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). I dati a supporto di questa pubblicazione sono disponibili all’indirizzo: 10.25405/data.ncl.22232452. Ai fini dell’accesso aperto, l’autore ha applicato una licenza Creative Commons Attribution (CC BY) a qualsiasi versione del manoscritto accettato dall’autore.
Materials
| Material | |||
| 3-PGA | Santa Cruz Biotechnology | sc-214793B | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Agar | Thermo Fisher Scientific | A10752.22 | |
| Agarose | Severn Biotech | 30-15-50 | |
| Amino Acid Sampler Kit | VWR | BTRABR1401801 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937-1G | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501-1G | |
| Coenzyme A (CoA) | Sigma-Aldrich | C4282-100MG | |
| CTP | Alfa Aesar | J14121.MC | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0862 | |
| Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| GTP | Carbosynth | NG01208 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149-100G | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522-250MG | |
| PEG-8000 | Promega | V3011 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 757551-5G | |
| Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | RDD037-500G | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714-1BTL | |
| Qubit Protein concentration kit | Thermo Fisher Scientific | A50668 | |
| Rossetta 2 DE 3 E.coli | Sigma-Aldrich | 71397-3 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558-1G | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | 211705 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | GE17-1321-01 | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| UTP | Alfa Aesar | J23160.MC | |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | |
| Equipment | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | HS4323-500EA | |
| 10K MWCO dialysis cassettes | Thermo Fisher Scientific | 66381 | |
| 15 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 50 mL centrifuge bottles | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 500 mL centrifuge bottles | Thermo Fisher Scientific | 3120-9500 | |
| Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer | Christ | part no. 101521, 101522, 101527 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | H-X3R | |
| Black 384 well microtitre plates | Fischer Scientific | 66 | |
| Cuvettes | Thermo Fisher Scientific | 222S | |
| Elga Purelab Chorus | Elga | ##### | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5425R | Eppendorf | EP00532 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | B34183 | |
| JMP license | SAS Institute | 15 | |
| Magnetic Stirrer | Fischer Scientific | 15353518 | |
| Parafilm | Amcor | PM-966 | |
| Photospectrometer (Biophotometer) | Eppendorf | 16713 | |
| Pipettes and tips | Gilson | ##### | |
| Precision Balance | Sartorius | 16384738 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Shaking Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Sonic Dismembrator (Sonicator) | Thermo Fisher Scientific | 12893543 | |
| Static Incubator | Sanyo | MIR-162 | |
| Syringe and needles | Thermo Fisher Scientific | 66490 | |
| Thermo max Q8000 (Shaking Incubator) | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Varioskan Lux platereader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00GD1 | |
| Vortex Genie 2 | Cole-parmer | OU-04724-05 | |
| VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter | VWR | 662-1657 |
Referências
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