Summary
Burada, insan limbal niş hücrelerini izole etmek ve tanımlamak için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Burada limbal niş hücrelerin (LNC'ler) izolasyonu ve tanımlanması için standart bir prosedür sunuyoruz. LNC'lerin izolasyonu için göz bankasından elde edilen limbus dokusu kullanıldı. Doku, aseptik koşullar altında 12 parçaya bölündü ve LNC'ler ve limbal epitelyal progenitör hücreler ile hücre kümeleri elde etmek için kollajenaz A kullanılarak hücre kültürü inkübatöründe 37 °C'de 18 saat sindirildi. Hücre kümeleri, tek hücreler elde etmek için% 0.25 tripsin-EDTA kullanılarak 37 ° C'de 15 dakika boyunca sindirildi ve daha sonra% 5 Matrigel ile kaplanmış plastik bir yüzey üzerinde modifiye embriyonik kök hücre ortamında (MESCM) kültürlendi. Hücreler %70 birleşme üzerine geçirildi ve LNC'ler immünofloresan, gerçek zamanlı kantitatif PCR (qPCR) ve akış sitometrisi kullanılarak tanımlandı. Birincil LNC'ler izole edildi ve 12 defadan fazla geçti. LNC'lerin P4'ten P6'ya proliferasyon aktivitesi en yüksekti. LNC'ler, BMMSC'lerden (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR ve PDGFRβ) daha yüksek kök hücre belirteçleri ifade etti. Ayrıca, sonuçlar, P4 LNC'lerin VIM, CD90, CD105 ve PDGFRβ'yi tekdüze olarak eksprese ettiğini, ancak LNC'lerin tanımlanması için bir belirteç olarak kullanılabilecek Pan-CK'yi eksprese etmediğini gösterdi. Akış sitometrik analizi, LNC'lerin yaklaşık %95, %97, %92 ve %11'inin sırasıyla CD73, CD90, CD105 ve SCF eksprese ettiğini, BMMSC'lerde ise %68, %99, %20 ve %3 olduğunu gösterdi. LNC izolasyonu ve tanımlanması için standart süreç, LNC'lerin yaygın kullanımı için güvenilir bir laboratuvar temeli sağlayabilir.
Introduction
Limbal kök hücre eksikliği (LSCD)1 olarak da adlandırılan kornea epitelyal kök hücre eksikliği (CESD) ve kornea epitel rejenerasyonu (CES) insidansı, kornea enfeksiyonu ve yaralanması nedeniyle giderek daha acil hale gelmektedir. Uygun şekilde tedavi edilmezse, CESD kornea nakli gerektiren körlüğe yol açabilir. Sonuç olarak, CES rejenerasyonu daha önemli hale geliyor. CES işlevi için gerekli desteği sağlayan limbal niş hücreler (LNC'ler) adı verilen bir grup destekleyici hücre vardır. Limbal stromal kök hücreler ilk olarak Polisetty ve ark.2 tarafından izole edilmiş ve Xie ve ark.3 tarafından limbal epitel, subjacent ve limbusun stromasında lokalize olan LNC'ler olarak tanımlanmıştır. LNC'ler, kornea kenarının anahtar destekleyici kök hücresidir ve kemik iliği kaynaklı MSC'nin (BMMSC'ler) işlevi ile kornea epitel hücrelerine ve kornea stromal hücrelerine vb. dönüşmeye teşvik edilebilir.3,4,5,6,7. Önceki çalışmalar, LNC'lerin kök hücre özelliklerinin, klinikte zaten yaygın olarak kullanılan BMMSC8'den daha ilkel olduğunu göstermiştir. LNC'ler, özellikle CESD tedavisi için MSC'den sonra bir sonraki uygun seçenek haline gelebilir. CES için önemli destekleyici hücreler olan LNC'ler aynı zamanda limbusun "niş" yapısından türetilen kök hücrelerdir. LNC'ler, olgun kornea epitel hücrelerinin (MCEC) CES9'a farklılaşmasında önemli bir rol oynayabilir. Bununla birlikte, LNC'ler ile ilgili çalışmalar hala nispeten yetersizdir ve LNC'lerin terminolojisi, izolasyonu, saflaştırılması, tanımlanması ve özellikleri konusunda bir fikir birliği yoktur. Bazı araştırmacılar LNC'leri limbal biyopsiden türetilmiş stromal kök hücreler10, limbal mezenkimal kök hücreler11, limbal fibroblast kök hücreler12 ve limbal mezenkimal stromal hücreler13 olarak adlandırmışlardır. LNC'lerin büyüme özellikleri ayrıntılı olarak tanımlanmadığından, umut verici bilimsel ve klinik uygulamaları nedeniyle ve gelecekte en önemli klinik araçlardan biri olabileceğinden, LNC'lerin izolasyonu, saflaştırılması, tanımlanması ve özelliklerini özetlemek gerekir.
Daha önceki bir çalışmayagöre 14, LNC'ler esas olarak limbal epitelin subjacent ve limbusun stromasında bulunur. Bu protokol, limbus dokusunun kollajenaz A kullanılarak işlenmesini, LEPC ve LNC'lerden oluşan bir küme elde edilmesini ve %0.25 tripsin-EDTA (TE) ile tek hücrelere sindirilmesini içerir. LNC'ler daha sonra saflaştırılmak üzere modifiye edilmiş bir embriyonik kök hücre ortamında (MESCM) seçici olarak kültürlendi. Bu yazıda bildirilen protokol basittir ve büyük miktarlarda insan LNC'lerinin elde edilmesinde yüksek verimliliğe sahiptir.
LNC izolasyonu, kültürü ve tanımlanmasının ayrıntılı prosedürü, LNC çalışmasıyla ilgilenen bilim adamları için videoya kaydedildi ve gerektiğinde rahatlıkla tekrarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
50 ila 60 yaşları arasındaki donörlerden alınan limbus dokusu, Tongji Hastanesi (Wuhan, Çin) Kızıl Haç Göz Bankası'ndan elde edildi. Protokol, Tongji Etik Komitesi tarafından onaylandı ve Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak yürütüldü.
1. İzolasyon
- Orta süreli kornea depolama ortamından limbus dokusu elde edin ve ultra temiz bir tezgah üzerinde aseptik koşullar altında çalıştırın.
- Steril bir cerrahi yuvarlak bıçak kullanarak korneanın etrafındaki iris ve endotelyumu kazıyın ve çıkarın.
- Kornea ve skleranın her iki tarafında 1 mm kalacak şekilde cerrahi bir bıçakla limbus dokusunu eşit büyüklükte on iki parçaya kesin.
- Limbus dokularını 3,5 cm'lik bir kültür plakasına aktarın, tüm dokuları sindirim için daldırmak için 1 mL kollajenaz A (DF-12 ortamında 2 mg / mL) ekleyin.
- Plakayı 37 ° C'lik hücre inkübatörüne koyun, limbal dokuları 18 saat boyunca sindirin.
NOT: Takip işlemleri genellikle ikinci gün yapılır. - %5 bazal membran matrisi (Matrigel) kaplı 6 oyuklu kültür plakası hazırlayın.
- Kuyu dibinde% 5 bazal membran matrisini (MESCM [Tablo 1] içinde çözülmüş) kaplayın.
- Sterilize edilmiş bir torbada 200 μL ve 1 mL uç, bir adet 15 mL santrifüj tüp ve bir adet 6 oyuklu plaka hazırlayın.
- Sterilize edilmiş torbayı (uçlar ve santrifüj tüp dahil) ve yeni bir 6 oyuklu plakayı -20 °C veya -80 °C ortamında 20 dakika bekletin. Bazal membran matrisini buzdolabında 4 °C'de çözdürün.
- Önceden soğutulmuş uçları, santrifüj boruyu ve 6 oyuklu plakayı -20 °C veya -80 °C ortamından çıkarın ve ardından ultra temiz tezgahta aşağıdaki işlemleri gerçekleştirin.
- 200 μL'lik bir uç kullanarak 50 μL %5 bazal membran matrisini 1 mL MESCM'ye aktarın ve nazikçe ve eşit şekilde karıştırın.
- Önceden soğutulmuş 1 mL ucu kullanarak %5 bazal membran matrisini (MESCM içinde çözülmüş) 6 oyuklu bir kültür plakasının bir kuyucuğuna aktarın.
- 6 oyuklu plakayı hafifçe ve yatay olarak çalkalayın, 6 oyuklu kültür plakasını 37 °C hücre inkübatörüne yaklaşık 1 saat koyun ve ardından bir sonraki adımı gerçekleştirin.
- 18 saatlik sindirimden sonra, kollajenaz A-sindirilmiş limbal dokuyu çıkarın, sadece bazı görünür küçük kümeler ve sindirilmemiş skleral dokular kalacaktır.
NOT: Yüksek büyütmeli mikroskopi, yoğun bir şekilde paketlenmiş birçok hücreden (LNC'ler dahil) oluşan bir kümeyi ortaya çıkarır. - Kümeleri stereomikroskop altında sindirilmemiş skleral dokulardan ayırmak için 200 μL'lik bir pipet ucu kullanın.
- Kümeleri 3,5 cm'lik kültür plakasına aktarın ve %0,25 TE'ye daldırın ve ardından plakayı 15 dakika boyunca hücre inkübatörüne yerleştirin.
- Hücre sindirimini durdurmak için %10 nakavt serumu ile 1 mL MESCM ekleyin ve 1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak kümeleri tek tek hücrelere yeniden süspanse etmek için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
- Hücre çökelmesini bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın ve ardından hücreleri yeniden süspanse etmek için 1 mL MESCM ekleyin.
- 1 mL pipet ucu kullanarak alt hücre çökelmesi MESCM'de eşit şekilde süspanse edilene kadar 2-3 kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve hücre sayımı için 20 μL hücre süspansiyonu alın.
- Hücre süspansiyonunu 1 mL pipet ucuna sahip %5 bazal membran matris kaplı 6 oyuklu plakaya aktarın ve MESCM hacmini 2,5 mL'ye yükseltin.
- Hücreleri eşit olarak dağıtmak için 6 oyuklu plakayı yatay olarak hafifçe sallayın.
- Hücreleri görüntülendikten ve kaydedildikten sonra kültür inkübatörüne aktarın. Hücreleri günlük olarak gözlemleyin ve fotoğraflayın ve ortamı her 3-4 günde bir değiştirin.
2. LNC'nin Tanımlanması
- İmmünofloresan boyama
- 37 ° C hücre inkübatörde 5 dakika boyunca 1 mL% 0.25 TE kullanarak LNC'leri plakanın altından sindirin.
- 1 mL MESCM (nakavt serumu içeren) ekleyerek sindirimi sonlandırın, hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice aspire edin.
- Süspansiyondaki hücreleri yeniden süspanse etmek için 1 mL MESCM ekleyin. 4 slayt (20 μL/slayt) için 80 μL hücre süspansiyonu (slayt başına 4 × 103 hücre) hazırlayın ve üreticinin talimatlarına göre hücreleri mikroskop slaytlarına yerleştirmek için santrifüj sistemi kullanın.
- Yaklaşık 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit kullanarak hücreleri (3. adımda slaytlara yapıştırılmış) sabitleyin ve ardından 15 dakika boyunca PBS'de% 0.2 Triton X-100 ile slaytlardaki hücreleri geçirgen hale getirin.
- Hücreleri primer antikorlarla (Pan-CK [1:1000], Vim [1:100], CD90 [1:100], CD105 [1:200], SCF [1:100], PDGFRβ [1:100]) ile inkübe etmeden önce% 2 sığır serum albümini (BSA) ile 1 saat bloke edin. İnkübasyondan sonra, slaytları PBST (PBS +% 0.1 Tween 20) ile yıkayarak (5 dakika / yıkama, 3x) bağlanmamış primer antikorları çıkarın.
- Karşılık gelen ikincil antikorları (eşek anti-fare IgG ikincil antikoru TRITC [1:1000], eşek anti-tavşan IgG FITC [1:500], eşek anti-fare IgG 488 [1:300], eşek anti-tavşan IgG 594 [1:400]) uygun IgG spesifik olmayan IgG antikorları ile 1 saat inkübe edin. PBST (5 dk / yıkama, 3x) kullanarak bağlanmamış ikincil antikoru çıkarın.
- Çekirdekleri 5 μg / mL DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-Fenilindol) ile boyayın ve slaytları kapatın.
- Floresan mikroskobu kullanarak floresan görüntüleme yapın (Büyütme: 400x; Maruz kalma süresi: 50 ms).
- Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR)
- Üreticinin talimatlarına göre toplam RNA'yı çıkarmak için RNA İzolasyon Kitini alın.
- 1-2 μg toplam RNA'yı cDNA'ya tersine çevirmek için yüksek kapasiteli bir cDNA Transkripsiyon Kiti kullanın.
- cDNA (100 ng), TaqMan Gen Ekspresyon Test Karışımı (1 μL), evrensel PCR Master Mix (10 μL) ve ddH 2 O (20 μL'ye kadar) içeren 20 μL'lik bir çözeltide ters transkripsiyon (42 °C,2dk; 50 °C, 85 dk) ve qPCR (95 °C, 5 dk; 95 °C, 10 s, 40 döngü) gerçekleştirin.
- Göreceli gen ekspresyonunu incelemek için karşılaştırmalı BT tekniğini (ΔΔCT)4,9 kullanın.
3. LNC'nin Karakterizasyonu
- Hücre sayımı (hemositometre)
- LNC'leri 37 °C hücre inkübatörde 5 dakika boyunca% 0.25 TE kullanarak plakanın altından sindirin.
- 1 mL MESCM (nakavt serumu içeren) ekleyerek sindirimi sonlandırın, hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice aspire edin.
- Hücreleri yeniden süspanse etmek için 1 mL MESCM ekleyin, ardından 0.5 mL'lik bir santrifüj tüpünde 10 μL hücre süspansiyonu alın. Eşit hacimde% 0.4 Tripan mavisi boyama çözeltisi ekleyin.
- Hemositometrenin sayım alanına 10 μL lekeli hücre süspansiyonu yerleştirin ve sayım için bir lamel ile örtün.
NOT: Ortadaki beş kare alandaki hücre sayısı "A" olarak tanımlanır; 1 mL'deki hücre sayısı 5A × 104 × 2 olarak hesaplanır.
- LNC ve BMMSC belirteçlerinin akım sitometrisi ile incelenmesi15
- Akış sitometrisi 15 (2-4 × 106 olay/örnek, örneklerin her birinden 2.000 hücre elde edildi, aynı anda kapılı toplam 550.000 hücre) kullanarak LNC'lerde ve BMMSC'lerde SCF, CD73, CD90 ve CD105 ekspresyonunu tespit edin).
- Hücreleri 20-30 ° C'de 15 dakika boyunca bir bloke edici tamponda (PBS'de% 3 BSA ve% 0.05 Tween-20) önceden etiketlenmiş antikorlar (SCF [1:50], CD70 [1:50], CD90 [1:50] ve CD105 [1:50]) kullanarak toplayın ve boyayın.
- Bir akış sitometresi kullanarak floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) analizi gerçekleştirin. Bu çalışmada FACS Diva yazılımı ve FlowJo yazılımı kullanılmıştır. Her örnek için 10.000 olay kaydedin ve canlı hücreleri geçit ve analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LNC'nin Büyümesi
LNC'ler, yukarıda tarif edildiği gibi, korneoskleral kenar dokusunun kollajenaz A (2 mg/mL) sindirim yöntemine göre başarılı bir şekilde izole edildi (Şekil 1). Daha önce bildirilen bir çalışma3 ile tutarlı olarak, kollajenaz A sindiriminden sonra, mikroskop altında tırtıl benzeri kümeler görüntülendi (Şekil 2). İğsi hücrelerinin oranı, hücre geçişi ile kademeli olarak artmıştır. Mil şeklindeki hücreler, kaplanmış bazal membran matrisi3 olmadan plastik üzerine yetiştirilen muadillerinin aksine, kaplanmış %5 bazal membran matris plakaları üzerinde büyüyebilir. P1'den P12'ye kadar olan hücreler, 2 ila 7 gün arasında bir hücre iki katına çıkma süresi ile tek tip bir proliferatif hız sergiledi (Tablo 2). Bu çalışmada, LNC'ler 13 pasaja ve 34 ikiye katlamaya kültürlenmiştir (Şekil 3)3. LNC'ler birincil hücrelerden (LNC P0) kültürlendi; LNC P0 yavaş büyüdü ve yaklaşık 12 gün sürdü. LNC'lerin P1-P8'e geçmesi için sadece yaklaşık 3 güne ihtiyacı vardı ve P9'dan sonra LNC'lerin büyüme hızı önemli ölçüde azaldı (Tablo 2). Hücre morfolojisi açısından, LNC'ler iğ şeklindeydi ve P0'da yuvarlaktı. P3'ten sonra, LNC'ler aynı morfolojik boyutta iğ şeklindeydi (Şekil 2). Toplam genişlemenin kapsamı, aşağıdaki formül kullanılarak P0'dan P13'e iki katına çıkan popülasyon sayısı olarak ölçüldü: hücre ikiye katlanma sayısı (NCD) = log10 (y/x) / log102, burada y, hücrelerin son yoğunluğu ve x, hücrelerin ilk tohumlama yoğunluğudur3. NCD, LNC'lerin büyüme oranını temsil eder (Şekil 3A). NCD ve birikimli NCD eğrilerinden (Şekil 3B), LNC'lerin üstel olarak artması en az zaman aldı ve P3-P5'ten en hızlı büyüdü (Şekil 3). P5'ten sonra, hücre büyüme hızı önemli ölçüde azaldı, NCD P13'te 1.32'ye döndü ve büyüme neredeyse durdu.
LNC'nin Tanımlanması
LNC'lerin izolasyonu ve kültüründen sonra, bir diğer önemli görev tanımlamaydı. LNC'ler ile ilgili mevcut çalışmalara göre VIM, CD90, CD105, SCF ve PDGFRβ için ifade edilen ancak Pan-CK için ifade edilmeyen LNC'ler (Şekil 4)9. Çift immün boyama LNC P4, bu hücrelerin tutarlı bir şekilde Pan-CK-/Vim+/CD90+/CD105+/SCF+/PDGFR+ olduğunu ortaya koydu (Şekil 4). qPCR ayrıca P2'de Pan-CK ekspresyonunun azaldığını ve P3'te Vim, CD90, CD105, SCF ve PDGFR transkriptlerinin arttığını ortaya koydu. Vim, CD90, CD105, SCF ve PDGFR transkripsiyon seviyeleri P4'te P1'e göre anlamlı olarak artmıştır (p < 0.01) (Şekil 4)9.
LNC'nin Özellikleri
Daha ileri analizler, LNC'lerin daha fazla embriyonik kök hücre (ESC) belirteçleri (Nestin, Rex1 ve SSEA4), mezenkimal kök hücre (MSC) belirteçleri (CD73, CD90 ve CD105) ve niş hücre (NC) belirteçleri (MSX1, P75NTR ve PDGFRβ) eksprese ettiğini gösterdi (Şekil 5)15. Akış sitometrisi, CD73, CD90 ve CD105 dahil olmak üzere MSC'lerin yüzey antijen özelliklerinin hem LNC'lerde hem de BMMSC'lerde ifade edildiğini gösterdi15. CD73, CD90, CD105 ve SCF'yi eksprese eden LNC'lerin yüzdeleri sırasıyla yaklaşık %95, %97, %92 ve %11 iken, BMMSC'lerinki sırasıyla %68, %99, %20 ve %3 idi. Bu, LNC'lerin BMMSC'lere kıyasla önemli ölçüde daha yüksek seviyelerde MSC pozitif belirteçler CD73, CD105 ve sitokin SCF (p < 0.01) ve benzer bir CD90 seviyesi (p > 0.05) eksprese ettiğini göstermektedir (Şekil 6)15.
Şekil 1: LNC'lerin izolasyon süreci . (A) Korneoskleral jant dokusu. (B) Kollajenaz A'dan sonra kümeler 37 °C'de 18 saat sindirim. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: MESCM'de %5 bazal membran matris kaplı 6 oyuklu plaka üzerinde kültürlenen P0 ila P13 LNC'ler. (Bar = 50 μm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: LNC'lerin P0-P13'ten büyüme modeli. (A) P0-P13'ten LNC'lerin NCD'si; (B) P0-P13'ten LNC'lerin kümülatif NCD'si. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: İmmünofloresan ve qPCR. İmmünofloresan ve qPCR, LNC'lerin Vim, CD90, CD105, SCF ve PDGFRβ'yi tekdüze olarak eksprese ettiğini, ancak Pan-CK'yi eksprese etmediğini ortaya koydu. Bu rakam Zhu ve ark.9'un izniyle çoğaltılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: LNC'ler, BMMSC'lerden daha fazla ESC, MSC ve NC belirteci ifade eder. P4 LNC'ler ve P4 BMMSC'ler, ESC belirteçlerinin (A), MSC ve nöral krest belirteçlerinin (B) transkripsiyon ekspresyonu için qPCR'ye tabi tutuldu (sırasıyla n = 3, *P < 0.05, #P < 0.05 ve **p < 0.01). ESC belirteçlerinin (C) ve MSC, NC belirteçlerinin (D) Hoechst 33342 tarafından nükleer karşı boyama ile immün boyanması. Ölçek çubukları = 25 μm. Bu rakam Li ve ark.15'in izniyle çoğaltılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: P4 LNC'lerin ve BMMSC'lerin (AF) floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması. CD73, CD90 ve CD105 dahil olmak üzere MSC belirteçlerinin floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) analizi (n=3). Bu rakam Li ve ark.15'in izniyle çoğaltılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Reaktif | Stok çözelti konsantrasyonu | Hacim | Son konsantrasyon | Depolama Ortamı |
| DME/F-12 1:1(1×) | Temel ortam | 180 mL | 90% | 4 °C |
| NakavtTMSR | - | 20 mL | 10% | -20 °C |
| ESC'ler/iPSC'ler için Serum Replasmanı | ||||
| Rekominant İnsan Lösemi İnhibitör Faktörü (Lif) | 50 μg/mL | 40 μL | 10 ng/mL | -80 °C |
| Rekombinant İnsan FGF-temel | 100 μg/mL | 8 μL | 4 ng/mL | -80 °C |
| ITS (insülin, transferrin, sodyum selenit) | 500 μg/mL insülin | 2 mL | 5 μg/mL insülin | -20 °C |
| 500 μg/mL transferrin | 5 μg/mL transferrin | |||
| 500 ng/Ml sodyum selenit | 5 ng/mL sodyum selenit | |||
| Gentamisin | 25 μg/mL | 2 mL | 50 μg/mL | 4 °C |
| Amfoterisin B | 2500 μg/mL | 100 μL | 1,25 μg/mL | 4 °C |
Tablo 1: MESCM formülasyonu.
| Pasaj | Tohumlama Yoğunluğu (× 105 hücre/cm2) | Nihai yoğunluk (× 105hücre/cm2) | Kültür zamanı (gün) | Hücre İkiye Katlama Sayısı (NCD) | Kümülatif NCD |
| P0 | 0.22 | 0.385714 | 12 | 0.810029 | 0.810029 |
| P1 (İngilizce) | 0.08 | 0.365714 | 4 | 2.192645 | 3.002674 |
| P2 (İngilizce) | 0.051429 | 0.357143 | 3 | 2.795859 | 5.798533 |
| P3 (İngilizce) | 0.037143 | 0.337143 | 2 | 3.182203 | 8.980737 |
| P4 (İngilizce) | 0.028571 | 0.311429 | 6 | 3.446256 | 12.42699 |
| P5 (İngilizce) | 0.04 | 0.385714 | 3 | 3.269461 | 15.69645 |
| P6 (İngilizce) | 0.054286 | 0.48 | 4 | 3.14439 | 18.84084 |
| P7 (İngilizce) | 0.057143 | 0.351429 | 3 | 2.620586 | 21.46143 |
| P8 (İngilizce) | 0.08 | 0.394286 | 3 | 2.30117 | 23.7626 |
| P9 (İngilizce) | 0.06 | 0.345714 | 6 | 2.526546 | 26.28915 |
| P10 Serisi | 0.022857 | 0.122857 | 7 | 2.426265 | 28.71541 |
| P11 Serisi | 0.025714 | 0.122857 | 5 | 2.25634 | 30.97175 |
| P12 Serisi | 0.028571 | 0.114286 | 5 | 2 | 32.97175 |
| P13 Serisi | 0.045714 | 0.114286 | 10 | 1.321928 | 34.29368 |
Tablo 2: LNC'nin plastik üzerindeki Seri Geçişleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kornea şeffaflığı tipik olarak, normal görme keskinliği için çok önemli olan kornea stromasındaki küçük liflerin (25-30 nm çapında) düzenli olarak düzenlenmesi ve dağıtılmasıyla sağlanır16. Dünyada 36 milyonu kör olmak üzere 253 milyon görme engelliinsan var 17. Dünya Sağlık Örgütü (WHO), kornea körlüğünü insan görme duyusuna yönelik en ciddi tehlikelerden biri olarak kabul etmektedir ve dünya çapındaki tüm körlüklerin %5,1'ini oluşturmaktadır16. Normal CES ile kornea epitel defekti iz bırakmadan hızlı bir şekilde iyileşebilir18. Dünya çapında 12,7 milyondan fazla hastanın orta ila şiddetli görme kaybı nedeniyle kornea nakline ihtiyaç duyduğu tahmin edilmektedir19; Kornea nakli başarısızlığının %30'u CESD20'den kaynaklanmıştır. Bununla birlikte, dünya çapında çoğu ülkede kornea bağışı sıkıntısı nedeniyle, kornea körü yetmiş hastadan sadece biri sonunda kornea nakli alabilmiştir21. Şu anda, kornea epitelyal kök hücre nakli (CEST) CESD22'yi tedavi etmek için kullanılabilir. Monoküler CESD'li hastalar CEST için sağlıklı gözlerden CES alabilirler. Bununla birlikte, bilateral CESD'li hastalar için, tedavi için sadece allojenik CES elde edilebilir. İmmün rejeksiyon, allojenik CEST'in başarısızlığının ana nedeni olmaya devam etmektedir. CESD için terapötik tedaviyi azaltmak için umut verici bir yöntem, otojen CES'in yerini etkili bir şekilde alabilecek veya diğer otojen hücrelerin CES olmak için diğer yerlerden farklılaşmasını teşvik edebilecek bir hücre bulmaktır. BMMSC 23, oral mukozal epitel hücreleri (OMEC)24, diş pulpası kök hücreleri (DPSC)19, insan fibroblast kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSC)25 ve yağ kök hücreleri (ASC)26 dahil olmak üzere otolog hücrelerin CES'e in vitro farklılaşması da popüler hale gelmektedir. Rohaina ve ark.23, 10 gün boyunca amniyotik membranlar üzerinde kültürlenen BMMSC'lerin kornea epitel hücrelerine farklılaşabildiğini ve farklılaşma indüksiyonundan sonra CK3 ve p63 ekspresyonunun önemli ölçüde arttığını bulmuşlardır. 2020'de O'Callaghan ve ark.24, yeni bir kültür sistemi kullanarak oral mukozal epitel hücrelerinin kornea epitel hücrelerine farklılaşmasını indükledi ve trofoblastlar olarak insan oral mukozal fibroblastları ile oral mukozal epitel hücre kültürüne destek olarak bir 3D doku yapısı (RAFT) kullanarak CESD'yi tedavi etmek için başarıyla kullandı. Ek olarak, DPSC korneal stromal ve epitel hücrelerine başarılı bir şekilde farklılaşır. DPSC, K3, K12 ve CD90 ekspresyonunu yukarı regüle ederek kornea konjonktival invazyonunu önleyebilir. Başka bir çalışma, DPSC'yi bir tavşan CESD modelinde kornea yüzeyine sırtlanmış amniyotik hücre tabakaları olarak kullandı. Sonuçlar, DPSC grubunun kontrol grubuna göre daha temiz kornealara ve daha az anjiyogeneze sahip olduğunu gösterdi27. Hayashi ve ark.28, 12 hafta sonra PAX6(+) ve K12(+) kornea epitel hücrelerinde indüklenebilen fibroblast kaynaklı iPSC kullanarak farklılaşma elde etti. iPSC etkili bir şekilde kornea epitel hücrelerine dönüşür, K12'yi aktive eder ve NANOG25'i baskılar. Zeppieri ve ark.26, ASC'lerin fare CESD'sini iyileştirmek ve lazerle indüklenen bir hayvan modelinde kornea epitel yara iyileşmesini artırmak için kornea epitel hücrelerine farklılaşabileceğini keşfetti.
LNC'ler, CES'in korunduğu ve desteklendiği limbal niş içinde lokalize olur ve MSC'lere benzer birçok özelliğe sahiptir. LNC'ler ilk olarak Polisetty ve ark.2 tarafından izole edilmiş ve ilk olarak Xie ve ark.3 tarafından adlandırılmıştır. Son çalışmalara göre, LNC'ler MSC'lerden daha temel kök hücrelerdir ve adipositlere, kondrositlere ve osteositlerekolayca farklılaşabilir 4,29. Yaygın olarak kullanılan BMMSC'lerle karşılaştırıldığında, LNC'ler daha fazla kök hücre özelliği gösterir (daha yüksek CD73, CD105, PDGFR, SCF, vb. ekspresyonu) (Şekil 5) 30. LNC'ler, kornea epitelinin ve stromanın onarımını teşvik ederek kornea alkali yanıklarının neden olduğu CESD'li tavşanları başarılı bir şekilde tedavi edebilir15. Kornea fibroblastlarında fibronektin (FN), bağ dokusu büyüme faktörü (CTGF) ve salgılanan asidik ve sisteinden zengin protein (SPARC) ekspresyonunun azalması, LNC sekresyonunun yara iyileşmesini artırdığını ve fibrozu azalttığını düşündürmektedir7.
3 boyutlu bir mikro ortamda, ilginç olan, LNC'lerin MCEC'lerle yeniden birleşebilmesi ve ikinci hücreleri kök hücre özelliklerini geri kazanmaları için uyarabilmesidir9. LNC'ler CES büyümesini etkili bir şekilde hızlandırır31 ve kornea yara iziniönler 10. Bununla birlikte, LNC'lerin miktarı sınırlıdır; Çalışmalar, sığır korneasındaki toplam limbal stromal hücre sayısının sadece yaklaşık%32'ünü temsil ettiğini ve önemli miktarda keratan sülfat, keratokan ve ALDH3A133 ekspresyonu olduğunu göstermiştir. İnsan kornealarında %1'den az olabilirler33.
Bu protokolde, LNC'leri izole etme, saflaştırma ve tanımlamaya yönelik önceki yöntemler tekrarlanmıştır 3,14,34. İnsan limbus dokusunun kollajenaz A (2 mg / mL) ile 18 saat tedavisinden sonra, LNC'ler izole edildi. P0 LNC yavaş gelişti ve iğ şeklindeki LNC'ler, poligonal diğerleri ve görünür küresel MCEC dahil olmak üzere çeşitli hücre morfolojileri sergiledi (Şekil 2, P0). Önceki çalışmalar, LNC'lerin homojen morfoloji ile kültür yüzeyinin dibine bağlanan iğ şeklindeki hücreler olduğunu göstermiştir14. Aynı zamanda, MCEC'ler, bu protokolde kültürlenen hücrelerin morfolojisi ile tutarlı olan29. yuvarlaktır. Ek olarak, P0 LNC'ler, yaklaşık 12 gün içinde hücre yoğunluğunun yaklaşık% 70-80'ini dolduran hücrelere yavaşça büyüdü. P1-P12 LNC önemli ölçüde daha hızlı çoğaldı ve 3-6 gün içinde pratik olarak tüm kültür plakasını kapladı. P1'i takiben, iğ şeklindeki LNC'lerin adneksiyal hücreleri, yuvarlak MCEC ve poligonal hücrelerden önemli ölçüde sayıca fazladır.
Tablo 2 ve Şekil 3'teki NCD değerlerinden, LNCs P0'ın en düşük NCD'ye (0.810) sahip olduğu ve hücre geçişinin 12 gün içinde gerçekleştiği açıktır. Bununla birlikte, P1'den sonra, LNC'lerin büyümesi önemli ölçüde hızlandı ve büyüme oranı P4'te 3,44'te zirve yaptı. P6'dan sonra, LNC'lerin büyüme hızı önemli ölçüde azalmıştır (Şekil 3). LNC'lerin büyüme hızı ve P4'ün aktivitesi, LNC'lerin büyüme modeli açısından önemli ölçüde en yüksekti ve P4-P6 LNC'lerin büyüme aktivitesinin en iyi9 olduğunu gösteren önceki bulgularla tutarlıydı. Bununla birlikte, bu yöntemin belirli sınırlamaları vardır, LNC P0 sayısı donörün yaşına ve ölüm zamanına göre büyük ölçüde değişir. Bu nedenle, donör doku daha genç ve daha taze olduğunda, daha fazla P0 LNC izole edilebilir. CES'in mikro çevresini in vitro taklit etmede en önemli faktör, laminamin açısından zengin hücre dışı matris35 gibi evrensel niş faktörlere duyulan ihtiyaçtır.
Sonuç olarak, LNC'ler kornea epitel kök hücrelerini desteklemede ve kendini yenileme ve olgun kornea epitel hücrelerine farklılaşma dahil olmak üzere CES'in köklülüğünü korumada çok önemli bir rol oynamaktadır. LNC'nin CESD 9,15'li hastaları tedavi etmek için yenilikçi bir hücre aracı olması beklenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların hiçbirinin ilgili herhangi bir finansal açıklaması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışmayla ilgili rehberlik için Wei Wang, Lingjuan Xu ve Rong Liu'ya, materyalin bir kısmını sağladıkları için Yongyao Tan, Bihui Jin, Chunxiu You ve Li Guigang'a, el yazmasını yazdığı için Guanyu Su'ya, el yazmasını düzelttiği için Xiao Zhou, Yihong Xiong ve Huatao Xie'ye ve tam rehberliği için Guigang Li'ye teşekkürler. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 82070936, 81470606, 81570819), Hubei Eyaleti sağlık ve aile planlaması bilimsel araştırma projesi (No. WJ2017M073), Tongji Hastanesi'nden İlk On Translasyonel Tıbbi Araştırma Projesi (No.2016ZHYX20), Wuhan Şehrindeki Genç Tıp Öncülerinin Eğitim Projesi (No.2015whzqnyxggrc10), Küresel Yetenekler İşe Alım Programı (G2022154028L), 2022'de Hubei Eyaleti Ulusal Sağlık Komisyonu projesi(WJ2021ZH0005) ve 2022'de Hubei Finans Departmanının Konu İnşaat Vakfı(42000022815T000000102)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole | ThermoFisher | D1306 | 5μg/mL |
| Amphotericin B | Sigma | V900919 | 1.25 μg/mL |
| Anti-CD73 | Abcam | ab202122 | 1:50 |
| Bovine Serum Albumin | MERCK | A1933 | - |
| CD105 | Proteintech | 67075-1-Ig | 1:200 |
| CD105 | Abcam | ab114052 | 1:50 |
| CD90 | Proteintech | 66766-1-Ig | 1:100 |
| CD90 | Abcam | ab307736 | 1:50 |
| Cell Incubator | Shanghai Lishen | K1119K4644 | HF90(HT) |
| Centrifuge system | StatSpin | StatSpin CytoFuge 12 | - |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | 2 mg/mL |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | - |
| Culture plate | virya | 3500356 | 35 mm |
| DME/F-12 1:1 (1x) | cytiva | SH30023.01 | 90% |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A16016 | 1:1000 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | 31568 | 1:1000 |
| FACS Diva sofware | BD Biosciences | Tree Star | - |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | Becton Dickinson LSRII | - |
| Fluorescence microscope | olympus | cx31 | |
| Gentamicin | Sigma | G1914 | 50 μg/mL |
| Hemocytometer | MERCK | Z359629 | Bright-Line |
| High-capacity cDNA Transcription Kit | ThermoFisher | 4374966 | |
| Inverted phase-contrast microscope | UOP | DSZ2000X | |
| ITS (insulin, transferrin, sodium selenite) | Sigma | I3146 | 5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite |
| KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs | gibco | 10828-028 | 10% |
| Matrigel | BioCoat | 356234 | - |
| Pan-CK | Abcam | ab7753 | 1:1000 |
| Paraformaldehyde | NoninBio | NBS0135 | 4.00% |
| Paraformaldehyde | MKBio | MM-1505 | 4% |
| PDGFRβ | Abclonal | A1444 | 1:100 |
| Real-time fluorescence quantitative PCR instrument | Applied Biosystems | Step One Plus | - |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | 4 ng/mL |
| Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif) | Peprotech | 300-05 | 10 ng/mL |
| RNeasy Mini RNA Isolation Kit | Qiagen | 74104 | - |
| SCF | Bioss | bs-0545R | 1:100 |
| SCF | Abcam | ab52603 | 1:50 |
| Stereomicroscope | ZEISS | SteREO Discovery. V8 | |
| Sterile surgical round blade | Careforde | 29500 | size 10 |
| TaqMan Gene Expression Assay Mix | Applied Biosystems | 4448489 | |
| Triton X-100 | MERCK | X100 | 0.20% |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | 0.40% |
| Trypsin-EDTA | Genview | GP3108 | 0.25% |
| Tween 20 | MERCK | P9416 | - |
| Ultra Clean Bench | LaiTe | LT20200705 | SW-CJ-IFDG |
| Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Vim | Abcam | ab92547 | 1:100 |
References
- Le, Q., Xu, J., Deng, S. X. The diagnosis of limbal stem cell deficiency. Ocular Surface. 16 (1), 58-69 (2018).
- Polisetty, N., Fatima, A., Madhira, S. L., Sangwan, V. S., Vemuganti, G. K. Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye. Molecular Vision. 14, 431-442 (2008).
- Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. Isolation and expansion of human limbal stromal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 279-286 (2012).
- Li, G. G., Zhu, Y. T., Xie, H. T., Chen, S. Y., Tseng, S. C. Mesenchymal stem cells derived from human limbal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5686-5697 (2012).
- Li, G. G., Chen, S. Y., Xie, H. T., Zhu, Y. T., Tseng, S. C. Angiogenesis potential of human limbal stromal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3357-3367 (2012).
- Hu, W., Zhang, Y., Tighe, S., Zhu, Y. T., Li, G. G. A new isolation method of human lacrimal canaliculus epithelial stem cells by maintaining close association with their niche cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (12), 1260-1267 (2018).
- Kumar, A., Xu, Y., Yang, E., Du, Y. Stemness and regenerative potential of corneal stromal stem cells and their secretome after long-term storage: Implications for ocular regeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3728-3738 (2018).
- Xiao, Y. T., Qu, J. Y., Xie, H. T., Zhang, M. C., Zhao, X. Y. A comparison of methods for isolation of limbal niche cells: Maintenance of limbal epithelial stem/progenitor cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (14), 16 (2020).
- Zhu, H., et al. Limbal niche cells and three-dimensional matrigel-induced dedifferentiation of mature corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (5), 1 (2022).
- Basu, S., et al. Human limbal biopsy-derived stromal stem cells prevent corneal scarring. Science Translational Medicine. 6 (266), 266ra172 (2014).
- Acar, U., et al. Effect of allogeneic limbal mesenchymal stem cell therapy in corneal healing: role of administration route. Ophthalmic Research. 53 (2), 82-89 (2015).
- Katikireddy, K. R., Dana, R., Jurkunas, U. V. Differentiation potential of limbal fibroblasts and bone marrow mesenchymal stem cells to corneal epithelial cells. Stem Cells. 32 (3), 717-729 (2014).
- Polisetti, N., Sharaf, L., Reinhard, T., Schlunck, G. Isolation and ex vivo expansion of limbal mesenchymal stromal cells. Bio-Protocols. 12 (14), e4471 (2022).
- Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. Limbal epithelial stem/progenitor cells attract stromal niche cells by SDF-1/CXCR4 signaling to prevent differentiation. Stem Cells. 29 (11), 1874-1885 (2011).
- Li, G., et al. Human limbal niche cells are a powerful regenerative source for the prevention of limbal stem cell deficiency in a rabbit model. Scientific Reports. 8, 6566 (2018).
- Kumar, A., Yun, H., Funderburgh, M. L., Du, Y.
- Pineda, R. World Corneal Blindness. Foundations of Corneal Disease. , Springer, Cham. 299-305 (2020).
- Zieske, J. D., Guimarães, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
- Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin of the World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).
- Tan, Y., et al. Limbal bio-engineered tissue employing 3D nanofiber-aerogel scaffold to facilitate LSCs growth and migration. Macromolecular Bioscience. 22 (5), e2100441 (2022).
- Aghamirsalim, M., et al. 3D printed hydrogels for ocular wound healing. Biomedicines. 10 (7), 1562 (2022).
- Sasamoto, Y., Ksander, B. R., Frank, M. H., Frank, N. Y. Repairing the corneal epithelium using limbal stem cells or alternative cell-based therapies. Expert Opinion on Biological Therapy. 18 (5), 505-513 (2018).
- Rohaina, C. M., et al. Reconstruction of limbal stem cell deficient corneal surface with induced human bone marrow mesenchymal stem cells on amniotic membrane. Translational Research. 163 (3), 200-210 (2014).
- O'Callaghan, A. R., Dziasko, M. A., Sheth-Shah, R., Lewis, M. P., Daniels, J. T. J. A. B. Oral mucosa tissue equivalents for the treatment of limbal stem cell deficiency. Advanced Biosystems. 4 (7), e1900265 (2020).
- Yu, D., Chen, M., Sun, X., Ge, J. Differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into corneal epithelial-like cells. Cell Biology International. 37 (1), 87-94 (2013).
- Zeppieri, M., et al. Adipose-derived stem cells for corneal wound healing after laser-induced corneal lesions in mice. Journal of Clinical Medicine. 6 (12), 115 (2017).
- Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. Secretome cues modulate the neurogenic potential of bone marrow and dental stem cells. Molecular Neurobiology. 54 (6), 4672-4682 (2017).
- Hayashi, R., et al. Coordinated generation of multiple ocular-like cell lineages and fabrication of functional corneal epithelial cell sheets from human iPS cells. Nature Protocols. 12 (4), 683-696 (2017).
- Guo, P., et al. Limbal niche cells are a potent resource of adult mesenchymal progenitors. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3315-3322 (2018).
- Wang, W., et al. Differential gene expression between limbal niche progenitors and bone marrow derived mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 17 (4), 549-557 (2020).
- González, S., Deng, S. X. Presence of native limbal stromal cells increases the expansion efficiency of limbal stem/progenitor cells in culture. Experimental Eye Research. 116, 169-176 (2013).
- Funderburgh, M. L., Du, Y., Mann, M. M., SundarRaj, N., Funderburgh, J. L. PAX6 expression identifies progenitor cells for corneal keratocytes. FASEB Journal. 19 (10), 1371-1373 (2005).
- Funderburgh, J. L., Funderburgh, M. L., Du, Y.
- Chen, S. Y., Hayashida, Y., Chen, M. Y., Xie, H. T., Tseng, S. C. A new isolation method of human limbal progenitor cells by maintaining close association with their niche cells. Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (5), 537-548 (2011).
- Sato, T., Clevers, H. SnapShot: Growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700-1701 (2015).
