Summary
유사형 바이러스(PV)는 실제 바이러스를 취급하는 것보다 더 안전한 조건에서 숙주-바이러스 상호 작용을 연구하는 데 사용되는 복제 결함 바이러스입니다. 여기에 제시된 자세한 프로토콜은 SARS-CoV-2 PV를 사용하여 COVID-19 백신 접종 후 환자 혈청의 중화 능력을 테스트하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
유사형 바이러스(PV)는 관심 유전자 전달을 위한 유전자 치료에 더 잘 알려진 용도 외에도 숙주-바이러스 상호 작용을 연구하고 혈청 샘플의 중화 능력을 테스트하는 데 사용할 수 있는 분자 도구입니다. PV는 바이러스 게놈이 PV에 통합되지 않은 서로 다른 플라스미드로 나뉘기 때문에 복제 결함이 있습니다. 이 안전하고 다재다능한 시스템을 통해 생물 안전 레벨 2 실험실에서 PV를 사용할 수 있습니다. 여기에서, 우리는 여기에 언급된 바와 같이 3개의 플라스미드를 기반으로 렌티바이러스 PV를 생산하기 위한 일반적인 방법론을 제시한다: (1) 감염을 모니터링하는 데 필요한 리포터 유전자를 운반하는 백본 플라스미드; (2) PV를 생성하는 데 필요한 모든 구조 단백질에 대한 유전자를 운반하는 패키징 플라스미드; (3) 바이러스 tropism을 결정하고 숙주 세포로의 바이러스 진입을 매개하는 envelope surface glycoprotein 발현 플라스미드. 이 연구에서 SARS-CoV-2 스파이크는 비복제성 SARS-CoV-2 유사형 렌티바이러스 생산에 사용되는 외피 당단백질입니다.
간단히 말해서, 패키징 셀(HEK293T)은 표준 방법을 사용하여 3개의 서로 다른 플라스미드와 co-transfection되었습니다. 48시간 후, PV를 함유하는 상층액을 수거, 여과하고, -80°C에서 보관하였다. SARS-CoV-2 PV의 감염성은 감염 후 48시간 후 표적 세포주에서 리포터 유전자(루시페라아제)의 발현을 연구하여 테스트되었습니다. 상대 발광 단위(RLU) 값이 높을수록 감염/전달률이 높아집니다. 또한, 감염성 PV를 연속적으로 희석된 혈청 샘플에 첨가하여 유사 바이러스가 표적 세포에 진입하는 중화 과정을 연구했으며, RLU 강도의 감소로 측정되었습니다: 높은 중화 활성에 해당하는 낮은 값.
Introduction
유사형 바이러스(PV)는 숙주-바이러스 및 병원체-병원체 상호 작용을 연구하기 위해 미생물학에서 사용되는 분자 도구입니다 1,2,3,4. PV는 바이러스 게놈을 보호하는 바이러스 코어인 내부 부분과 트로피즘을 정의하는 바이러스 표면의 외피 당단백질인 외부 부분으로 구성된다5. 유사 바이러스는 새로운 바이러스 입자를 생성하기 위한 모든 유전 정보를 포함하지 않기 때문에 표적 세포에서 복제가 불가능합니다. 이러한 특이한 특징의 조합으로 인해 PV는 야생형 바이러스에 대한 안전한 대안이 될 수 있습니다. 반면에 야생형 바이러스는 병원성이 높아 BSL 2 실험실에서 분석을 위해 사용할 수 없다6.
PV의 감염성은 일반적으로 형광 단백질(GFP, RFP, YFP) 또는 화학발광 산물(루시페라아제)을 생산하는 효소를 코딩하는 리포터 유전자에 의해 모니터링될 수 있습니다. 이것은 PV 생산에 사용되는 플라스미드 중 하나에 포함되어 있으며 유사 바이러스7의 게놈에 통합됩니다.
현재 HIV-1 게놈을 기반으로 하는 렌티바이러스 유래 입자를 포함하여 여러 유형의 PV 코어가 존재합니다. 다른 플랫폼에 비해 HIV-1 기반 PV의 가장 큰 장점은 표적 세포 게놈8에 내재된 통합 프로세스입니다. HIV-1은 전염성이 매우 높은 바이러스이고 AIDS의 원인균이지만, 이러한 렌티바이러스 벡터는 수년에 걸친 광범위한 최적화 단계 덕분에 안전하게 사용할 수 있습니다. 형질도입 능력에 영향을 주지 않으면서 바이러스 유전자가 고갈된 2세대 렌티바이러스 벡터의 도입으로 최적의 안전성 조건이 달성되었다9. 3세대 및 4세대는 바이러스 게놈을 별도의 플라스미드10,11로 추가로 분할하여 렌티바이러스 벡터 처리의 안전성을 높이는 데 기여했습니다. 최신 세대의 PV는 일반적으로 유전자 치료를 위한 렌티바이러스 벡터를 생산하는 데 사용됩니다.
PV는 생산 및 감염 단계에서 바이러스와 숙주 세포 간의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. PV는 특히 유사 바이러스 중화 분석(PVNA)에 사용됩니다. PVNA는 PV의 외피12,13에 있는 바이러스 당단백질을 표적으로 하여 혈청 또는 혈장의 중화 가능성을 평가하도록 널리 검증되었습니다. 억제 농도(50, IC50)로 표현되는 중화 활성은 바이러스 입자 진입의 50%를 차단하는 혈청/혈장의 희석으로 정의된다14. 이 프로토콜에서는 부스터 백신 접종을 받기 전후에 수집된 혈청에서 중증 급성 호흡기 증후군 - 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)에 대한 항체 활성을 테스트하기 위한 PVNA 설정에 대해 설명했습니다.
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Protocol
본 의정서는 베로나 대학교 윤리 위원회(승인 의정서 번호 1538)의 승인을 받았으며 지침을 따릅니다. 연구에 참여한 인간 피험자로부터 정보에 입각한 서면 동의를 얻었습니다. 전혈 샘플은 항 SARS-CoV-2 백신을 접종하는 과정에 있는 의료 종사자(HCW) 자원 봉사자로부터 수집되었습니다. 이들 샘플은 혈청15의 후속 분리를 위해 항응고제를 함유하는 플라스틱 튜브에서 수집하였다.
다음 모든 공정은 멸균 조건에서 작동하는 Class-2 생물학적 후드에서 수행되어야 합니다. 바이러스 취급은 주의해서 수행해야 하며 모든 폐기물은 희석된 표백제 용액으로 중화해야 합니다. 프로토콜에 대한 개요는 그림 1에 나와 있습니다.
그림 1: 중화 분석의 그래픽 표현. (A) PV 생산, (B) PV 적정 및 (C) 중화 분석. 모든 절차는 멸균 조건의 클래스 2 생물학적 후드에서 수행됩니다. 중화 분석(C)에 사용하기 전에 PV의 감염성 수준을 표준화하기 위해 적정 단계(B)를 수행해야 합니다. 이 피규어는 BioRender로 제작되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
1. SARS-CoV-2 PV 생산 및 감염성 테스트
- 사용된 형질주입 시약과 호환되는 적절한 세포 밀도에 도달하기 위해 6웰 플레이트(6WP)에 완전한 Dulbecco's Modified Eagle 배지(DMEM, 고포도당, 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% L-글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신)에 5 x 105 HEK293T 세포를 파종합니다. 폴리에틸레니민(PEI)으로 transfection을 수행하는 경우(제조업체 지침에 따라 시약 준비) transfection 당일에 세포가 40-60% 밀도에 도달하는지 확인합니다(단계 1.3). 세포를 37°C 및 5%CO2의 가습 인큐베이터에 보관합니다.
- 형질주입 전에 사용한 세포 배지를 항생제가 없는 신선한 배지(DMEM, 고포도당, 10% FBS, 1% L-글루타민)로 교체하여 더 높은 형질주입 효율을 달성하십시오.
참고: 파종 다음 날, HEK293T 세포는 transfection할 준비가 됩니다. - 부착 HEK293T 세포를 제조업체의 지침에 따라 적절한 transfection 시약으로 transfection합니다. PEI를 사용하는 경우 두 개의 믹스를 준비하고 아래 단계를 따르십시오.
- 혼합 A를 준비하기 위해 500ng의 pCMV-dR8.91 패키징 플라스미드16, 750ng의 pCSFLW 리포터 플라스미드16 및 100μL의 환원 혈청 배지에 플라스미드를 발현하는 SARS-CoV-2 스파이크 450ng을 추가합니다.
- 혼합물 B를 준비하려면 환원 혈청 배지 100μL에 17.5μL의 PEI(농도: 1mg/mL)를 추가합니다.
- 두 혼합물을 실온(RT)에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, PEI 믹스 B를 DNA 믹스 A에 첨가하여 두 튜브의 내용물을 함께 혼합합니다.
- RT에서 20-30분 동안 튜브를 배양합니다. 3-4분마다 튜브를 부드럽게 튕겨 혼합을 향상시킵니다. 마지막으로 혼합물을 HEK293T 세포에 추가합니다.
- transfection 후 16-20시간 후, 배양 배지를 신선하고 완전한 DMEM으로 교체합니다. 37 °C 및 5 % CO2 에서 배양하여 transfection된 세포에 의한 PV 생산을 허용합니다.
- 형질주입 후 72시간 후, PV가 함유된 상층액을 수확합니다. 그런 다음 실온에서 1600 x g 에서 7분 동안 원심분리하여 세포 파편과 죽은 세포를 제거하고 0.45μm 셀룰로오스 아세테이트 필터를 통해 여과합니다.
- 옵션 단계: PV 역가의 최종 수율을 높이려면 여러 transfection을 수행하고, PV가 포함된 세포 배지를 모으고, 농축 튜브를 사용하여 농축합니다.
- 다음 단계("PV 적정", 섹션 2)를 직접 진행하거나 PV 함유 배지를 적절한 튜브에 분주하여 사용할 때까지 -80°C에서 보관합니다. 적정에 사용할 추가 부분 표본(400-500 μL)을 준비합니다.
참고: 여러 부분 표본을 만들면 과도한 해동-동결 주기를 방지하여 실험 간 재현성을 보장할 수 있습니다.
2. PV 적정
- 다음 단계를 위해 새로운 PV 함유 배지를 사용하거나 테스트 부분 표본(단계 1.7)을 해동하여 새로운 바이러스 스톡의 적정을 수행합니다. 동일한 PV 스톡의 부분 표본을 동결하면 재현성이 보장됩니다.
- PV 스톡을 복제하여 테스트하는 데 필요한 96웰 플레이트(96WP)의 모든 웰에 50μL의 완전한 DMEM(또는 사용 중인 표적 세포주와 호환되는 완전한 배지)을 추가하고 "A"행은 비워 둡니다. 100μL의 PV 스톡을 "A" 행에 추가합니다. 테스트할 제제의 수에 따라 바이러스가 없는 컬럼 하나를 "세포 전용" 대조군으로 남겨 둡니다(그림 2).
- A행에서 B행까지 50μL를 피펫팅하고 G행까지 이 과정을 반복하여 초기 스톡의 연속 희석을 얻습니다. 마지막 행에서 초과 볼륨을 버리십시오.
- 사용한 배지를 제거하고 DPBS 1x로 세포를 두 번 세척한 후 Dulbecco의 인산염 완충 식염수 1x(DPBS 1x)에 트립신/에틸렌디아민테트라아세트산 1x(EDTA)를 사용하여 세포를 분리합니다. 세포를 4 x 105 cells/mL의 밀도로 준비합니다.
참고: 이 프로토콜에서 PV 감염은 감수성 세포주 HEK293T/ACE2에서 테스트되었습니다. 이러한 세포는 HEK293T로부터 유도하고, ACE2 수용체를 발현하기 위해 렌티바이러스 벡터를 사용하여 형질도입하였다. - 각 웰에 50μL의 세포 현탁액을 추가하여 웰당 2 x 104 개의 세포 수를 보장합니다.
- 37 °C 및 5 % CO2 에서 48 시간 동안 배양합니다.
- 배양 후 Luciferase 분석을 수행하여 제조업체의 지침에 따라 판독값을 얻습니다. 루시페라아제 시약 100μL를 웰에 넣고 어두운 곳에서 실온에서 2분 동안 배양합니다. 각 웰의 내용물을 검은색 96웰 플레이트(사용 가능한 플레이트 리더와 호환)로 옮기고 96웰 플레이트 리더에서 플레이트를 판독합니다.
참고: 루시페라아제 판독에 사용되는 광도계는 다운스트림 분석에 사용될 처리되지 않은 원시 데이터가 포함된 스프레드시트 파일을 생성합니다(이 경우 Excel 파일). 바이러스의 감염성은 상대 발광 단위(RLU)로 표현됩니다(단락 4.1에 설명됨).
그림 2: PV 적정을 위한 96웰 플레이트의 대표 레이아웃. 고정된 부피의 PV 함유 상층액을 열 A, 열 1-11에 첨가하고 순차적으로 희석합니다. 마지막 열은 "셀 전용" 컨트롤로 남습니다. 이 피규어는 BioRender로 제작되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 중화 분석
- 환자의 혈청을 얼음 위에서 해동합니다. 혈청 검체를 56°C에서 30분 동안 배양하여 비활성화합니다.
- 96웰 플레이트에서 B행(1-10열)에서 H행(1-10열)까지 각 웰에 신선하고 완전한 DMEM(또는 사용된 표적 세포주와 호환되는 완전한 배지) 50μL를 추가합니다. 95μL의 신선하고 완전한 DMEM을 A행(열 1-10)에 넣습니다. 50μL 및 100μL의 전체 DMEM을 각각 컬럼 11 및 12의 웰에 추가합니다. 이들은 각각 감염된(바이러스 제어 또는 VC) 및 감염되지 않은(세포 전용 또는 CC) 제어입니다(그림 3).
- 5μL의 열 비활성화 혈청/혈장 샘플을 A행(열 1-10)에 추가합니다. 각 샘플은 중복됩니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 첫 번째 행의 샘플을 혼합하고 혈청이 포함된 배지 50μL를 A행에서 B행으로 이동합니다. 마지막 행까지 이 과정을 반복합니다(그림 3). 나머지 50μL는 폐기합니다.
- 필요한 수의 PV 부분 표본을 해동하고 ≥ 104 RLU/mL로 희석합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 희석된 PV 함유 배지 50μL를 각 웰(컬럼 1에서 컬럼 11까지)에 추가하여 열 비활성화 혈청/혈장을 바이러스에 1:1로 희석합니다. 혈청 샘플의 항체가 PV의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 결합할 수 있도록 37°C 및 5%CO2에서 1시간 동안 배양합니다.
- 감수성 세포(HEK293T/ACE2)의 최소 5mL 현탁액을 4 x 105 cells/mL의 세포 밀도로 준비합니다. 세포 현탁액 50μL를 각 웰에 추가하고 37°C 및 5%CO2에서 48시간 동안 배양합니다.
- 배양 후 2.7단계에 설명된 대로 제조업체의 지침에 따라 루시페라아제 분석 판독을 수행합니다.
참고: 루시페라아제 판독에 사용되는 광도계는 스프레드시트 파일(이 경우 .xlsx)을 생성하며, 다운스트림 분석에 사용될 처리되지 않은 원시 데이터(루시페라아제 분석 파일).
그림 3: 혈청 희석을 기반으로 한 플레이트 표현. 밝은 빨간색은 혈청의 양이 많음을 나타내고 밝은 파란색 레인(열 11)은 감염된 세포 제어(VC, 바이러스 제어)에 해당합니다. 연한 파란색 레인(열 12)은 감염되지 않은 세포(CC, 세포 대조군)에 해당합니다. 이 피규어는 BioRender로 제작되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. 적정 분석
- Luciferase 분석 파일에서 해당 샘플에 이름/제목을 할당합니다.
- RLU 측정값에 희석 계수(그리드의 상단에서 하단으로: 20x, 40x, 80x, 160x, 320x, 640x, 1,280x, 2,560x)를 곱하여 RLU/mL를 구합니다. 다른 희석 계수를 사용하는 경우 그에 따라 곱셈 계수를 변경하십시오.
- 각 PV 준비에 대한 평균 RLU/mL를 계산합니다.
5. PVs 중화 분석
- Luciferase 분석 스프레드시트 파일(이 경우 .xlsx)에서 테스트된 샘플에 해당 제목을 할당합니다. 샘플의 희석 계수(40초, 80배, 160배, 320배, 640배, 1,280배, 2,560배, 5,120배)를 입력합니다. 희석 계수의 Log10을 계산합니다.
- 감염되지 않은 대조군과 감염된 대조군의 평균 RLU를 계산합니다(그림 3, 각각 11열 및 12열). 이러한 값은 5.5단계의 정규화에 유용합니다.
- 데이터 분석을 위해 새 문서를 엽니다. X/Y 분석을 선택하고 X를 숫자 로 입력하고 Y를 입력으로 입력 2 반복 횟수 값을 나란히 하위 열에 입력합니다.
- Log10(희석) 값을 X 숫자로 입력합니다. 샘플의 중복 RLU를 입력합니다.
- Analyze( 분석) > Normalize>(정규화) 로 이동하여 동일한 시트의 모든 샘플에 플래그를 지정합니다. 0%는 어떻게 정의됩니까?, 100%는 어떻게 정의됩니까?에 각각 평균 VC 및 CC 값을 입력합니다. 확인을 클릭합니다.
- 정규화된 데이터 시트에서 해석 > XY 해석 > 비선형 해석(곡선 맞춤)으로 이동합니다. 모든 샘플에 플래그를 지정하고 확인을 클릭합니다. Dose-response - Inhibition의 경우 log(inhibitor) vs normalized response - variable slope를 선택합니다.
- 구속에서 HillSlope를 Must be less than 0으로 변경합니다.
- Output(출력)에서 Create summary table and graph(요약 테이블 및 그래프 생성) 플래그를 지정합니다. 확인을 클릭하여 최종 분석을 얻습니다. 분석을 위한 템플릿이 있는 작업 시트는 보충 파일 1에 제공됩니다.
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Representative Results
이 프로토콜은 SARS-CoV-2 PV의 생산 및 항COVID-19 백신 접종을 받는 피험자의 혈청/혈장의 중화 활성을 분석하기 위한 이러한 PV의 다운스트림 적용에 대해 설명합니다17. 또한 이 프로토콜은 중화 반응의 진화를 테스트하기 위해 각 SARS-CoV-2 우려 변이체(VOC)의 유사형을 생성하는 데 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 COVID-19 백신 접종 후 체액성 면역 반응에 대한 연구를 용이하게 함에도 불구하고, 다른 바이러스에 대한 다른 혈청/혈장의 중화를 쉽게 테스트하도록 조정할 수 있습니다 13,18,19.
그림 4A 는 RLU 신호의 증가에 해당하는 혈청 희석(Log(dilution))의 증가를 나타냅니다. 따라서 샘플의 희석도가 높을수록 바이러스 유입이 덜 차단됩니다(그림 4A). 이는 중화율로 더 표현됩니다(그림 4B).
IC50 결과는 시간 경과에 따른 단일 백신 혈청의 중화 능력을 보여줍니다. 그림 4C에 보고된 예에서, 피험자는 백신 접종 후 4주에 바이러스에 대한 강한 체액성 활동을 발달시켰다. 그러나 16주 후 IC50은 백신 투여 전과 유사합니다. 이 경우 PVNA는 시간이 지남에 따라 중화 전위의 손실을 보여주었습니다.
그림 4: PVNA의 대표적인 결과. (A) 감염성(RLU) 및 (B) 중화율은 0주차(W0, 백신 접종 전)에 표시됩니다. W4(백신 접종 후 4주); W16(W0 후 16주). (C) 동일한 시점의 IC50 값. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 중화 분석 템플릿. 중화 분석을 수행하기 위한 템플릿이 있는 작업 시트입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
야생형 바이러스를 사용하면 실제 감염을 시뮬레이션할 수 있지만, 렌티바이러스 PV는 병원성 바이러스를 다루는 데 필요한 엄격한 안전 요건 없이 바이러스 유입 및 감염과 관련된 메커니즘을 연구하는 데 더 안전한 옵션입니다 4,20,21. PV는 연구의 목적인 병원성 바이러스의 표면 외피 당단백질로 둘러싸인 복제 결함 바이러스 코어로 구성됩니다.
HIV-1 기반 PV는 가장 널리 사용되는 플랫폼 중 하나이며 SARS-CoV-2 유사 바이러스 입자 생산을 위해 이 프로토콜에 사용되었습니다. 리포터 유전자는 PV의 사용에 따라 다를 수 있습니다. 이 경우 루시페라아제 리포터 유전자를 선택하면 생산된 PV의 감염성을 쉽고 빠르며 민감하게 판독할 수 있습니다.
렌티바이러스를 기반으로 하는 PV는 항-HIV-1 체액성 반응 연구에 널리 적용된다22. PV 기술은 SARS-CoV-2로 인한 최근 COVID-19 대유행 기간 동안 즉시 적용되었습니다. SARS-CoV-2는 고병원성 인간 베타 코로나바이러스로, 급속히 유행병이 된 중국(Wu Han)에서 처음으로 확인되어 전 세계적으로 600만 명 이상의 사망자를 발생시켰습니다23,24. 백신 전략의 검증으로 인해 전염병은 대부분 통제되었습니다. 그럼에도 불구하고, 암 환자나 HIV 감염인과 같은 대부분의 취약한 사람들에게는, 여전히 위험을 내포하고 있다 25,26,27. 이러한 맥락에서, 중화 활성 측면에서 항 백신 체액성 반응을 모니터링하기 위해 검증된 분석법이 여전히 필요합니다. 이 글에서는 카테고리-3 격리에 접근할 수 없는 실험실에서 쉽게 수행할 수 있는 간단한 프로토콜에 대해 설명했습니다. 또한 PV 플랫폼은 다양한 SARS-COV-2 바이러스 변종을 연구할 수 있는 다목적 시스템입니다. 실제로, 서로 다른 스파이크로 envelope-expressing 플라스미드를 변화시킴으로써, SARS-CoV-2 새로운 변종 또는 다른 코로나바이러스의 PV를 생성할 수 있다28. 이러한 바이러스 포트폴리오는 다양한 우려 변이에 대한 백신 유도 체액성 반응의 반응성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다 15,29,30,31,32. 이 정보는 새롭고 더 효과적인 백신을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다.
transfection 조건, 적정 실패 및/또는 중화 분석과 관련하여 이 프로토콜을 따르는 동안 세 가지 주요 장애물에 직면할 수 있습니다. 첫째, 패키징 세포는 형질주입 시 충분히 합류하지 않을 수 있습니다. 이것은 영양소 부족 때문일 수 있습니다. 1.1단계를 확인합니다. 제대로 따릅니다. 그렇지 않으면 transfection 전날 아침에 seeding을 수행하고 다음 날 나중에 패키징 cell을 transfection하여 성장 시간을 늘립니다. 반복되는 문제는 transfection과 다음 날 배지 교체 사이에 세포 배지의 잠재적인 오염입니다. 이 경우 BSL2 후드 아래에서 작업할 때 사용하기 전에 멸균 절차를 늘려 절차를 반복하거나 원치 않는 오염을 방지하기 위해 항생제를 포함하십시오. 둘째, 검출되지 않은 루시페라아제 신호가 발생할 수 있으며, 이는 PV 생산의 다양한 단계 또는 표적 세포주의 특성에 기인할 수 있습니다. 플라스미드는 내독소가 없는 키트로 추출해야 합니다. transfection 단계는 프로토콜의 결과에 매우 중요합니다. PEI 시약은 1mg/mL의 정확한 농도로 준비해야 합니다. transfection 혼합물을 준비하는 동안 튜브를 부드럽게 튕기면 DNA-PEI 복합체의 형성이 향상됩니다. 세포가 올바르게 transfection되었는지 확인하려면 세포를 수확한 직후 루시페라아제 분석을 수행하는 것이 좋습니다. 또한 VSV와 같은 대조군 바이러스 외피 당단백질을 포함합니다: VSV-PV는 인간 세포주에서 강력한 RLU 신호를 제공합니다. 또한, 표적 세포주가 수용체를 발현해야 하며, 이는 웨스턴 블롯 또는 유세포 분석을 통해 쉽게 확인할 수 있습니다.
이 방법은 transfection 시약의 선택, PV의 생성에 필요한 상이한 플라스미드 간의 비율의 결정, 표적 세포주의 선택, 리포터 유전자로서의 루시페라아제의 사용을 포함하는 실험 조건과 관련하여 이전에 최적화되었다(16). 그럼에도 불구하고 각 실험실은 사용 가능한 장비에 따라 제안된 방법을 검증해야 합니다. 예를 들어, (단계 2.7)에서는 생산자가 제안한 대로 100μL의 루시페라아제 기질을 추가해야 하며, 이는 현재 사용 가능한 플레이트 리더를 사용하여 루시페라아제 분석을 판독하는 데 최적입니다. 반면에, 상이한 플레이트 리더를 구비한 다른 실험실은 상이한 루시페라아제 기질 또는 시약(33)의 부피를 사용하여 프로토콜을 적응시킬 수 있다. 게다가, 다른 저자는 luciferase 대신에 기자 유전자로 녹색 형광 단백질 (GFP)의 사용을 제안했다. 이것은 실험실이 GFP 판독을 위해 완전히 갖춰져 있지만 루시페라아제34,35가 아닌 경우 고려할 수 있습니다.
결론적으로 PV는 간단한 탐지 방법을 사용하여 감염을 정량화할 수 있는 유연하고 간단한 시스템입니다. 이는 많은 연구 그룹이 보다 쉽게 접근할 수 있고 생물안전 레벨 3 실험실21을 필요로 하는 병원성 바이러스의 사용을 피할 수 있는 비용 효율적인 접근 방식을 나타냅니다. PV의 사용은 SARS-CoV-2 감염 및/또는 백신 접종을 경험한 개인의 항체 매개 중화를 연구하기 위한 잘 특성화되고 안전한 접근 방식을 나타냅니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 의료 종사자 자원 봉사자들의 기여를 인정합니다. 이 프로젝트는 이탈리아 MUR의 Department of Excellence 2023/2027에서 지원했습니다. AR과 DZ는 PRIN2022(EU 자금 지원; NextGenerationEU)를 참조하십시오
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm filter | SARSTEDT | 83 1826 | |
| 6-well plate | SARSTEDT | 83 3920 | |
| 96-well plate | SARSTEDT | 8,33,924 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck | 10403892 | |
| Black Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 60005270 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | SIGMA-ALDRICH | D6546 - 500ML | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x) | AUROGENE | AU-L0615-500 | |
| Foetal Bovine Serum | AUROGENE | AU-S1810-500 | |
| Graphpad Prism version 7 | graphpad dotmatics | NA | In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program' |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEK293T/ACE2 cells | ATCC | CRL-3216 | HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector. |
| L-glutamine | AUROGENE | AU-X0550-100 | |
| Luminometer - Victor3 | Perkin Elmer | HH35000500 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'luminometer' |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium' |
| p8.91 packaging plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| pCSFLW reporter plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| Penicillin/streptomycin | AUROGENE | AU-L0022-100 | |
| Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa) | SIGMA-ALDRICH | 408727 | |
| RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126) | Addgene | 145839 | This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2 |
| SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid | Addgene | pGBW-m4137382 | |
| steadylite plus Reporter Gene Assay System | Perkin Elmer | 6066759 | In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent' |
| Trypsin EDTA 1x | AUROGENE | AU-L0949-100 |
References
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