Summary
Denne protokollen skisserer en metode for eksplantasjon av den runde vindusmembranen fra marsvin temporale bein, og gir en verdifull ressurs for ex vivo studier.
Abstract
Effektiv og minimalt invasiv legemiddellevering til det indre øret er en betydelig utfordring. Den runde vindusmembranen (RWM), som er en av de få inngangspunktene til det indre øret, har blitt et viktig fokus for undersøkelser. På grunn av kompleksiteten ved å isolere RWM, er vår forståelse av farmakokinetikken imidlertid fortsatt begrenset. RWM består av tre forskjellige lag: det ytre epitelet, det midterste bindevevslaget og det indre epitellaget, som hver potensielt har unike leveringsegenskaper.
Nåværende modeller for å undersøke transport over RWM bruker in vivo dyremodeller eller ex vivo RWM-modeller som er avhengige av cellekulturer eller membranfragmenter. Marsvin fungerer som en validert preklinisk modell for undersøkelse av farmakokinetikken i det indre øret og er en viktig dyremodell for translasjonell utvikling av leveringsbiler til cochlea. I denne studien beskriver vi en tilnærming for eksplantasjon av et marsvin RWM med omkringliggende cochleabein for benchtop-legemiddelleveringseksperimenter. Denne metoden muliggjør bevaring av opprinnelig RWM-arkitektur og kan gi en mer realistisk representasjon av transportbarrierer enn dagens stasjonære modeller.
Introduction
Nye klasser av terapeutika har dukket opp for behandling av sensorinevralt hørselstap. Oversettelsen av disse behandlingene til kliniske populasjoner er begrenset av trygge og effektive transportveier til det indre øret. Nåværende metoder for in vivo levering i dyrestudier er avhengig av enten fenestrasjon i det indre øret eller diffusjon gjennom den runde vindusmembranen (RWM), en ikke-osseøs barriere som skiller mellomøret fra cochlea1.
Både kirurgisk fenestrasjon og mikroinjeksjon i det indre øret er invasivt og kan utgjøre en risiko for gjenværende indre ørefunksjon2. Derfor er RWM en viktig rute for lokal legemiddellevering, og marsvin er den primære prekliniske dyremodellen som brukes til å studere lokal legemiddelfarmakokinetikk over RWM og i det indre øret for farmasøytisk utvikling 3,4. Selv om den er tynnere enn den menneskelige RWM, deler marsvinet RWM en identisk trelags struktur. Den er ca. 1 mm i diameter, 15-25 μm tykk, og består av to epitelcellelag som sandwicher et bindevevslag5. Epitellaget mot mellomøret er tettpakket og forbundet via tette kryss, mens laget mot det indre øret og scala tympani har løsere arkitektur og har ikke signifikante intercellulære adhesjoner.
Nåværende prekliniske studier som undersøker legemiddelpermeabilitet hos marsvin RWM, er avhengige av in vivo mellomøreinjeksjoner etterfulgt av prøvetaking av perilymfevæsken i det indre øret, noe som ikke tillater den spesifikke studien av RWM-transport 6,7. Fragmenter av RWM-eksplanter har blitt brukt i prekliniske studier, men på grunn av deres skjørhet og lille størrelse er de ikke egnet for systematiske, mikrofluidiske undersøkelser av legemiddel- og kjøretøytransport som krever en vanntett forsegling over RWM2. Andre grupper har benyttet in vitro-modeller med dyrkede humane epitelceller for å tilnærme RWM 8,9,10. Imidlertid fokuserer flertallet av disse konstruksjonene utelukkende på det ytre epitellaget og fanger ikke kompleksiteten til innfødt vevsarkitektur. For en mer detaljert forståelse av transportmekanismer på tvers av RWM er det nødvendig med målrettede ex vivo-studier.
I denne studien demonstrerer vi eksplantasjonen av en marsvin RWM med omkringliggende benstøtte for å bevare membranintegritet og illustrere bruken av dem i et eksperimentelt paradigme designet for den spesifikke studien av RWM-transport av legemiddelleveringsbiler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (GP18M226). Hartley albino marsvin (både hann og kvinne, veier 500-700 g) ble brukt i denne studien.
1. Prosedyreoppsett og forberedelse
- Steriliser alle instrumenter med etylenoksid før du begynner forsøket.
- Avlive dyrene etter den institusjonelt godkjente protokollen.
MERK: I den nåværende studien ble et ikke-forhåndsladet kammer ansatt for å frigjøre 100% karbondioksid (CO2) fra en kommersiell sylinder. En inline-begrensning ble brukt til å regulere gasstrømmen, og holdt den innenfor området 30% til 70% av kammerets volum per minutt i samsvar med 2020 AVMA-retningslinjene11. - Plasser dyret i kammeret og dispenser karbondioksid i 5 minutter. CO2 -strømmen opprettholdes i 1 min etter åndedrettsstans.
- Utfør halshugging etter åndedrettsstans for å sikre aktiv dødshjelp.
2. Kirurgisk tilnærming og eksplantasjon
- Trekk ut det tidlige beinet fra marsvinskallen på vanlig måte12. Fjern overflødig bløtvev med en rongeur. Identifiser den eksterne akustiske meatus, temporal bulla og ansiktskanalen13 (figur 1).
- Bor bort de ventrale aspektene av temporal bulla med en 6 mm diamantbit (se materialfortegnelse), og eksponer mellomøret og den eksterne øregangen omkretsende.
- Bruk rongeurs, fjern forsiktig den eksterne hørskanalen og trommeringen, samtidig som du separerer det incudomalleolære leddet. Identifiser incus, incudostapedial ledd, cochlea, horisontal halvsirkelformet kanal og ansiktskanal13 (figur 2A).
- Separat incudostapedial ledd og fjern incus ved hjelp av tang. Identifiser den benete nisjen til det runde vinduet.
- Bruk en 6 mm diamantbit til å bore bort den benete laminaen som forbinder sneglehuset med den mediale veggen i trommehulen mot tensor tympanikanalen. Dekomprimer forsiktig den benete kanalen til tensor tympani og fjern tensor tympani-muskelen med en 28 G nål.
MERK: Den mediale veggen av tensor tympani fossa forbinder direkte med cochleabein rundt RWM, og det tas hensyn til ikke å forårsake brudd som kan strekke seg til det runde vinduet. - Bor bort den benete laminaen som forbinder sneglehuset med den nedre veggen i trommehulen til det er 1 mm benete avsats som ligger ved siden av sneglehuset igjen (figur 2B).
- Bruk en 2 mm diamantbit (se materialfortegnelse) til å lage en cochleostomy ved sneglehusets basale sving, slik at ca. 2 mm bein blir igjen i det runde vinduet. Fortsett cochleostomien dårligere i et plan parallelt med den runde vindusmembranen for å skille basen fra toppen av cochlea.
- Forleng cochleostomien kuttet gjennom skallebasen, som er mye tettere, noe som resulterer i et tverrsnittsbilde av cochleas basale sving.
MERK: Sikting av boret mot meatus i den indre hørskanalen resulterer i en bane som maksimerer beinfjerning samtidig som man unngår å krysse for nær det runde vinduet. - Undersøk prøven fra skallebunnsiden og, hvis det ikke allerede er gjort, identifiser den indre hørskanalen og bor til cochleaåpningen. Fjern cochlearnerven med en 28 G kanyle.
- Undersøk prøven fra intracochleær side. Identifiser og fjern den osseøse spirallamina i basalsvingen og den gjenværende modiolusen med tang eller en 28 G nål.
- Vanne den enhetlige scala tympani-scala vestibuli hulrom rikelig for å fjerne rusk. Det runde vinduet skal være godt synlig fra kokektomien uten overliggende rusk (figur 2C).
- Deretter undersøker du prøven fra mellomøret. Bor den laterale halvcirkelformede kanalen og ansiktskanalen til nivået på det ovale vinduet. Fjern stiftene forsiktig med tang, og utsett den ovale vindusnisjen. Merk at det er en benete bro mellom crura av stiftene kjent som crista stapedis.
- Bruk et diamantbor på 1 mm (se materialfortegnelsen) til å åpne vestibylen ytterligere ved å forlenge det ovale vinduet langs det runde vinduet, og pass på at 1–2 mm cochleabein støter mot nisjen i det runde vinduet (figur 2D).
- Fullfør de temporale beinkuttene ved å koble de ovale vinduskuttene med cochlectomy kuttene på hver side av det runde vinduet.
MERK: På grunn av skjørheten til cochleabeinet, vil bevaring av tensor tympani fossa i prøven og unngå kutt gjennom den bidra til å forhindre cochleabeinfrakturer som strekker seg til RWM og kompromitterer integriteten. - Gjør de siste festene til det tette beinet i skallebunnen ved siden av den indre hørskanalen og barber forsiktig ned for å resultere i en utskåret RWM-prøve (figur 3A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som vist i figur 3A, tillater denne metoden eksplantasjon av den intakte marsvin runde vindusmembranen med en omkringliggende ring av stivt bein. RWM skal være fullt koblet til den benete ringrommet omkretsende. Ingen brudd i cochleabenet bør verdsettes. I sammenligning med menneskelige runde vindusprøver har marsvin RWM ikke en overliggende pseudomembran. I tillegg, i motsetning til mennesker, er det en benete bro mellom crura av marsvinstiftene, som krever oppsprekking og fjerning før utvinning av stiftens overbygning. Histologisk analyse (figur 3B) av den representative RWM viser en klar trelags epitelstruktur med en tilstøtende, intakt rund vindusnisje.
Fra et teknikkperspektiv er det to kritiske trinn. For det første, når du lager kokektomi i trinn 2.7, er det viktig å bruke ekvator av borekronen, i stedet for spissen, for å gjøre kuttet, da jitters på burrspissen kan føre til traumatiske brudd i cochleabenet som kan strekke seg til den runde vindusmembranen. For det andre er det viktig å bore ut den indre øregangen fullt ut, da dette muliggjør fullstendig fjerning av cochlearnerven og lettere disseksjon av den osseøse spirallaminaen, noe som resulterer i et enhetlig hulrom på intracochlea-siden for eksperimentell prøvetaking (figur 2C).
Etter at RWM har blitt ekstrahert, benyttet vår gruppe et modifisert Ussing-kammer for å evaluere farmakokinetiske egenskaper til membranen. Det modifiserte Ussing-kammeret har blitt validert av andre grupper i trommehinniske og runde vindusmembraner samt netthinnevev for å evaluere transportegenskapene til epitelmembraner 14,15. Denne 3D-printede enheten ble konstruert ved hjelp av Poly-Jet Vero og består av to trekantede basestykker, hver med et 400 μL væskekammer (figur 3). Den benete kanten av RWM er festet til basen ved hjelp av 2-delt epoksy (Gorilla, se materialtabell), etterfulgt av silisiumforseglingsmiddel (se materialtabell) for å sikre en vanntett forsegling (figur 4). Omhyggelig forsiktighet er tatt for å unngå at epoksy eller tetningsmasse kommer i kontakt med membranen. Med RWM klemt på plass, limes de to basene sammen med epoksy. Under transporteksperimenter fylles lastingen (mellomørevendt) med fosfatbufret saltvann (PBS) som inneholder leveringskjøretøyet (eller et hvilket som helst molekyl av interesse), og prøvetakingskammeret (scala tympani-vendt) er kun fylt med PBS. Med jevne mellomrom blir væske fra prøvetakingskammeret fullstendig aspirert og erstattet med fersk PBS.
Kvalitetskontrolltiltak tas under hvert forsøk for å sikre at det både er en vanntett forsegling rundt prøven i apparatet, samt en helt intakt membran uten mikroperforeringer. Representative resultater med en brun, jernkjerne nanopartikkelløsning er vist nedenfor. Kvantitativ verifisering av en vanntett forsegling oppnås ved å aspirere hele volumet av prøvetakingskammeret i løpet av hvert prøvetakingsintervall; Væske som lekker ut av prøvetakingskammeret vil resultere i mindre enn hele aspirasjonsvolumet. Ved avslutningen av hvert eksperiment bør væskevolumet i lastkammeret også forbli det samme. I tillegg, ettersom målvæsken vår er brun i fargen, er den også lett synlig i tilfelle lekkasje.
For å sikre ingen lekkasje i membranen ble det tatt flere tilnærminger. For det første blir RWM-prøver brukt i denne studien umiddelbart ekstrahert, og lys-, konfokal- og elektronmikroskopibilder bekrefter intakte cellulære strukturer og membranstrukturer uten mikroperforeringer (figur 3A, B). For det andre ble mikroperforeringer bevisst opprettet i en delmengde av RWM-prøver for å sammenligne effekten på nanopartikkellevering. Visuell inspeksjon av prøvetakings- og lastekammeraspiratet tjener som ytterligere bekreftelse på prøveintegritet og vanntett vedlegg. I RWM med perforeringer er det rask likevekt av laste- og prøvetakingskammeret, som kan observeres via en tydelig fargeendring (tilleggsfigur 1). I tillegg ble det funnet at transport i mikroperforerte RWM var høyere enn maksimal varians observert i intakte membraner (tilleggsfigur 2). Sammen fungerer disse som kvalitetskontrollmekanismer for integriteten til den vanntette tetningen som omgir prøven, så vel som RWM.
Figur 1 Preoperativt bilde av marsvin tinningbein. Tympanisk bulla, ytre øregang og ansiktskanal (*) er vist på dette preoperative bildet av marsvinets tinningbein. Skala bar = 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Intraoperative bilder. Intraoperative bilder som viser forholdet mellom den runde vindusmembranen og incus (*), cochlea (**), stifter (†) og dekomprimert indre øregang (‡). Skraverte områder angir deler av prøven som skal fjernes. (A) Marsvin mellomørehulrom etter fjerning av trommehinnen og ansiktsnerven (trinn 2.3). (B) Mellomørehulen etter dekompresjon av tensortrommekanalen (trinn 2.6). (C) Basal visning av RWM etter cochleostomy og fjerning av indre øreinnhold (trinn 2.11). (D) Utsikt over RWM etter fjerning av stifter og identifisering av vestibylen (trinn 2.13). Skala bar = A,B (1 cm); C,D (5 mm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Endelig RWM-prøve og histologi. (A) Marsvin RWM bruttoprøve med et benaktig ringrom. Skalastang = 1 cm. (B) Histologi av den eksplanterte marsvinets runde vindusmembran demonstrerer en intakt trelags struktur. Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Mikrofluidisk enhet for transmembrane transporteksperimenter. (A) Diagram over den mikrofluidiske enheten som brukes til transmembrantransporteksperimenter. (B,C) Trykt mikrofluidisk enhet for forsøkene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: Lasting og prøvetaking kammerinnhold over et 5 timers jernkjerne nanopartikkelleveringseksperiment. (A) Lastkammeret til intakt RWM viser en gradvis reduksjon i fargeintensiteten når konsentrasjonen av nanopartikler reduseres. (B) Prøvetakingskammer av intakt RWM viser stabil farging over tid, i samsvar med lave nivåer av nanopartikkellevering. (C) Lastekammeret for perforert RWM viser en rask reduksjon i fargeintensiteten når innholdet likevektes med prøvetakingskammeret. (D) Prøvetakingskammer av perforert RWM viser en gradvis økning i farge over tid, i samsvar med høye nivåer av nanopartikkellevering. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 2: Representative transportresultater for levering av nanopartikler. Representative transportresultater for levering av nanopartikler (Fe3O4 kjerne med polyetylenglykolbelegg, gjennomsnittlig radius på 77 nm) over marsvin RWM, både intakt og med perforeringer (gjennomsnittlig ± SD, n ≥ 3 RWM eksperimenter). Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I lokal legemiddellevering til øret er RWM den primære passasjeveien for terapeutika for å nå det indre øret. En nøyaktig og pålitelig stasjonær modell er nødvendig for å bedre forstå transportmekanismer og permeabilitet på tvers av nye leveringskjøretøy og for legemiddelutvikling. I denne studien demonstrerer vi at marsvin RWM-eksplantasjon er en gjennomførbar og pålitelig prosedyre for å tillate systematiske undersøkelser av legemiddelmembraninteraksjoner. Lundman et al. og Kelso et al. har tidligere beskrevet bruk av en lignende RWM permeabilitetsmodell 2,16; De spesifikke trinnene i den kirurgiske ekstraksjonen har imidlertid ikke blitt detaljert før nå, og skjørheten i cochleabenet og kompleks anatomi har utgjort en utfordring for den konsistente en-blokk-høstingen av intakte RWM-er.
Marsvinet RWM ligger på enden av scala tympani i cochlea og er omgitt av et tynt lag av cochlear bein. Brudd på denne osseøse strukturen under eksplantasjonsprosessen kan resultere i en ubrukelig prøve, da RWM har en tendens til å rive bort hvis det omkringliggende cochleabenet ikke forblir intakt. Vår gruppe bemerket at brudd oftest oppsto ved boring nær krysset mellom det svært tette skallebasebeinet og sprøtt cochlea, da overgangen i bentetthet økte sannsynligheten for bruddforplantning gjennom det runde vinduet. Av denne grunn foreslås det at opprettholdelse av tettere bein av tensor tympani fossa, som er festet til cochlea i nærheten av RW, vil øke utbyttet av prøvehøsting, spesielt hos eldre dyr. Forstyrrelse av beinet kan også forekomme under fjerning av cochlearinnholdet; Det må utvises forsiktighet for å fjerne den øseformede spirallamina forsiktig med minimal manipulering av det omkringliggende cochleabenet.
En viktig detalj å vurdere med denne modellen er levedyktigheten til RWM etter eksplantasjon. Tidligere grupper har antydet at pattedyrs RWM forblir levedyktig i 24-48 timer etter ekstraksjon17. Den foreliggende studien har reflektert disse funnene; konsistente transportstudier og histologiske analyser som viser intakte cellestrukturer (figur 2A) har begge støttet levedyktigheten til marsvinet RWM på tidspunktet for forsøk. For å opprettholde den generelle helsen til den ekstraherte prøven, blir RWM ekstrahert og innebygd innen 3 timer etter eutanasi.
I studien av legemiddelfarmakokinetikken på tvers av RWM in vivo er det fortsatt betydelige tekniske vanskeligheter med å gjøre målinger av perilymfatisk distribusjon og konsentrasjon1. Endringer i intra-tympaniske leveringsmetoder og anvendt mengde har resultert i varierte terapeutiske resultater. Disse vanskelighetene forsterkes av den komplekse væskedynamikken i labyrinten, samt uregelmessig utgang av injisert materiale gjennom eustachianrøret. Den beskrevne eksplantasjonsmetoden tillater den isolerte studien av RWM og faktorer som påvirker permeabiliteten som en ex vivo-modell . Videre tillater eksplanten også direkte avhør og visualisering av ulike metoder som for tiden brukes for å øke RWM-permeabiliteten, for eksempel ultralydmikrobobler18 og kjemisk indusert kryssmodulasjon19. Fremtidige studier av spesifikke endocytosemekanismer involvert i legemiddellevering vil også ha nytte av denne benchtop-modellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen avsløringer å komme med.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av NIDCD Grants No. 1K08DC020780 og 5T32DC000027-33, og Rubenstein Hearing Research Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 1SD-G1 | |
| 2 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 2SD-G1 | |
| 6 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 6D-G1 | |
| ANSPACH EMAX 2 Plus System | Anspach | EMAX2PLUS | Any bone cutting drilling system will work |
| BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe | Becton, Dickinson, and Co. | 382903057894 | Any 27-28 G needle |
| Gorilla Epoxy | Gorilla | 4200101 | |
| Kwik-CAST | World Precision Instruments | KWIK-CAST |
References
- Duan, M. I., Zhi-qiang, C. Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review. J Otol. 4 (1), 34-43 (2009).
- Kelso, C. M., et al. Microperforations significantly enhance diffusion across round window membrane. Otol Neurotol. 36 (4), 694-700 (2015).
- Salt, A. N., Plontke, S. K. Pharmacokinetic principles in the inner ear: Influence of drug properties on intratympanic applications. Hear Res. 368, 28-40 (2018).
- Szeto, B., et al. Inner ear delivery: Challenges and opportunities. Laryngoscope Investig Otolaryngol. 5 (1), 122-131 (2020).
- Carpenter, A. M., Muchow, D., Goycoolea, M. V. Ultrastructural studies of the human round window membrane. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 115 (5), 585-590 (1989).
- Forouzandeh, F., Borkholder, D. A. Microtechnologies for inner ear drug delivery. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 28 (5), 323-328 (2020).
- Leong, S., et al. Microneedles facilitate small-volume intracochlear delivery without physiologic injury in guinea pigs. Otol Neurotol. 44 (5), 513-519 (2023).
- Singh, R., Birru, B., Veit, J. G. S., Arrigali, E. M., Serban, M. A. Development and characterization of an in vitro round window membrane model for drug permeability evaluations. Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1105 (2022).
- Du, X., et al. Magnetic targeted delivery of dexamethasone acetate across the round window membrane in guinea pigs. Otol Neurotol. 34 (1), 41-47 (2013).
- Kopke, R. D., et al. Magnetic nanoparticles: inner ear targeted molecule delivery and middle ear implant. Audiol Neurootol. 11 (2), 123-133 (2006).
- AVMA. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. AVMA. , (2020).
- Goksu, N., et al. Anatomy of the guinea pig temporal bone. Ann Otolaryngol. 101 (8), 699-704 (1992).
- Wysocki, J. Topographical anatomy of the guinea pig temporal bone. Hear Res. 199 (1), 103-110 (2005).
- Veit, J. G. S., et al. An evaluation of the drug permeability properties of human cadaveric in situ tympanic and round window membranes. Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1037 (2022).
- Kansara, V., Mitra, A. K. Evaluation of an ex vivo model implication for carrier-mediated retinal drug delivery). Curr Eye Res. 31 (5), 415-426 (2006).
- Lundman, L., Bagger-Sjöbäck, D., Holmquist, L., Juhn, S. Round window membrane permeability. An in vitro model. Acta Otolaryngol Suppl. 457, 73-77 (1989).
- Moatti, A., et al. Assessment of drug permeability through an ex vivo porcine round window membrane model. iScience. 26 (6), 106789 (2023).
- Lin, Y. C., et al. Ultrasound microbubble-facilitated inner ear delivery of gold nanoparticles involves transient disruption of the tight junction barrier in the round window membrane. Front Pharmacol. 12, 689032 (2021).
- Jeong, S. H., et al. Junctional modulation of round window membrane enhances dexamethasone uptake into the inner ear and recovery after NIHL. Int J Mol Sci. 22 (18), 10061 (2021).
