Summary
Este protocolo describe un método para la explantación de la membrana de ventana redonda de huesos temporales de conejillos de indias, proporcionando un recurso valioso para estudios ex vivo .
Abstract
La administración eficiente y mínimamente invasiva de fármacos al oído interno es un desafío importante. La membrana de ventana redonda (RWM), al ser uno de los pocos puntos de entrada al oído interno, se ha convertido en un foco vital de investigación. Sin embargo, debido a las complejidades de aislar el RWM, nuestra comprensión de su farmacocinética sigue siendo limitada. El RWM comprende tres capas distintas: el epitelio externo, la capa de tejido conectivo medio y la capa epitelial interna, cada una de las cuales posee propiedades de administración únicas.
Los modelos actuales para investigar el transporte a través de la RWM utilizan modelos animales in vivo o modelos RWM ex vivo que se basan en cultivos celulares o fragmentos de membrana. Los conejillos de indias sirven como un modelo preclínico validado para la investigación de la farmacocinética de fármacos en el oído interno y son un modelo animal importante para el desarrollo traslacional de vehículos de administración a la cóclea. En este estudio, describimos un enfoque para la explantación de un RWM de conejillo de indias con hueso coclear circundante para experimentos de administración de fármacos en el laboratorio. Este método permite la preservación de la arquitectura RWM nativa y puede proporcionar una representación más realista de las barreras al transporte que los modelos de sobremesa actuales.
Introduction
Han surgido nuevas clases de terapias para el tratamiento de la pérdida auditiva neurosensorial. La traslación de estas terapias a poblaciones clínicas está limitada por rutas seguras y eficaces de transporte al oído interno. Los métodos actuales de administración in vivo en estudios con animales se basan en la fenestración en el oído interno o en la difusión a través de la membrana de ventana redonda (RWM), una barrera no ósea que separa el espacio del oído medio de la cóclea1.
La fenestración quirúrgica y la microinyección en el oído interno son invasivas y pueden presentar riesgos para la función residual del oído interno2. Por lo tanto, la RWM es una ruta importante para la administración local de fármacos, y los conejillos de indias son el principal modelo animal preclínico utilizado para estudiar la farmacocinética local de fármacos en la RWM y en el oído interno para el desarrollo farmacéutico 3,4. Aunque es más delgado que el RWM humano, el conejillo de indias RWM comparte una estructura idéntica de tres capas. Tiene aproximadamente 1 mm de diámetro, 15-25 μm de espesor y está compuesto por dos capas de células epiteliales que intercalan una capa de tejido conectivo5. La capa epitelial que se enfrenta al oído medio está densamente empaquetada y conectada a través de uniones estrechas, mientras que la capa que se enfrenta al oído interno y al escalón del tímpano tiene una arquitectura más laxa y no tiene adherencias intercelulares significativas.
Los estudios preclínicos actuales que investigan la permeabilidad del fármaco en el RWM del conejillo de indias se basan en inyecciones in vivo en el oído medio seguidas de la toma de muestras del líquido perilinfático dentro del oído interno, lo que no permite el estudio específico del transporte de RWM 6,7. Los fragmentos de explantes de RWM se han utilizado en estudios preclínicos, pero debido a su fragilidad y pequeño tamaño, no son adecuados para investigaciones sistemáticas y microfluídicas de transporte de fármacos y vehículos que requieran un sello hermético a través del RWM2. Otros grupos han empleado modelos in vitro con células epiteliales humanas cultivadas para aproximarse a la RWM 8,9,10. Sin embargo, la mayoría de estas construcciones se centran únicamente en la capa epitelial externa y no capturan la complejidad de la arquitectura de los tejidos nativos. Para una comprensión más detallada de los mecanismos de transporte a través de la RWM, se requieren estudios ex vivo específicos.
En este estudio, demostramos la explantación de un RWM de cobaya con soporte óseo circundante para preservar la integridad de la membrana e ilustramos su uso en un paradigma experimental diseñado para el estudio específico del transporte de RWM de vehículos de administración de fármacos.
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Protocol
Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (GP18M226). En el presente estudio se utilizaron cobayas albinas Hartley (machos y hembras, con un peso de 500-700 g).
1. Configuración y preparación del procedimiento
- Esterilice todos los instrumentos con óxido de etileno antes de comenzar el experimento.
- Sacrificar a los animales siguiendo el protocolo aprobado institucionalmente.
NOTA: En el estudio actual, se empleó una cámara no precargada para liberar el 100% de dióxido de carbono (CO2) de un cilindro comercial. Se utilizó un limitador en línea para regular el flujo de gas, manteniéndolo dentro del rango del 30% al 70% del volumen por minuto de la cámara de acuerdo con las Directrices AVMA 202011. - Coloque al animal en la cámara y dispense dióxido de carbono durante 5 min. El flujo de CO2 se mantiene durante 1 min después de un paro respiratorio.
- Realizar la decapitación después de un paro respiratorio para asegurar la eutanasia.
2. Abordaje quirúrgico y explantación
- Extrae el hueso temporal del cráneo del conejillo de indias de la manera habitual12. Retire el exceso de tejido blando con un rongeur. Identificar el meato acústico externo, la bulla temporal y el canal facial13 (Figura 1).
- Taladre los aspectos ventrales de la bulla temporal con una broca de diamante de 6 mm (ver Tabla de materiales), exponiendo el espacio del oído medio y el conducto auditivo externo circunferencialmente.
- Con el uso de rongeurs, retire suavemente el conducto auditivo externo y el anillo timpánico, separando simultáneamente la articulación incudomaleolar. Identificar el yunque, la articulación incudostapedial, la cóclea, el canal semicircular horizontal y el canal facial13 (Figura 2A).
- Separe la articulación incudostapedial y retire el yunque con unas pinzas. Identifica el nicho óseo de la ventana redonda.
- Utilice una broca de diamante de 6 mm para perforar la lámina ósea que conecta la cóclea con la pared medial de la cavidad timpánica hacia el canal tensor del tímpano. Descomprima con cuidado el canal óseo del tensor del tímpano y retire el músculo tensor del tímpano con una aguja de 28 G.
NOTA: La pared medial de la fosa tensorial del tímpano se conecta directamente con el hueso coclear alrededor de la RWM, y se tiene cuidado de no causar fracturas que puedan extenderse a la ventana redonda. - Taladre la lámina ósea que conecta la cóclea con la pared inferior de la cavidad timpánica hasta que quede 1 mm de saliente óseo que colinda con la cóclea (Figura 2B).
- Con una broca de diamante de 2 mm (ver Tabla de materiales), realice una cocleostomía en el giro basal de la cóclea, dejando aproximadamente 2 mm de hueso hasta la ventana redonda. Continúe la cócleostomía inferiormente en un plano paralelo a la membrana de la ventana redonda para separar la base del ápice de la cóclea.
- Extienda la incisión de la cócleostoma a través de la base del cráneo, que es mucho más densa, lo que da como resultado una vista transversal del giro basal de la cóclea.
NOTA: Apuntar la fresa hacia el meato del conducto auditivo interno da como resultado una trayectoria que maximiza la remoción de hueso y evita pasar demasiado cerca de la ventana redonda. - Examine la muestra desde el lado de la base del cráneo y, si aún no lo ha hecho, identifique el conducto auditivo interno y perfore la abertura coclear. Extraer el nervio coclear con una aguja de 28 G.
- Examine la muestra desde el lado intracoclear. Identifique y retire la lámina espiral ósea en el giro basal y el modiolo restante con pinzas o una aguja de 28 G.
- Riegue abundantemente la cavidad unificada de la rampa timpánica-rampa vestibular para eliminar los escombros. La ventana redonda debe ser claramente visible desde la cochectomía sin ningún residuo suprayacente (Figura 2C).
- A continuación, examine la muestra desde el lado de la oreja media. Taladre el canal semicircular lateral y el canal facial hasta el nivel de la ventana ovalada. Retire suavemente el estribo con unas pinzas, exponiendo el nicho ovalado de la ventana. Cabe destacar que hay un puente óseo entre la crura del estribo conocida como crista stapedis.
- Con una broca de diamante de 1 mm (ver Tabla de materiales), abra aún más el vestíbulo extendiendo la ventana ovalada a lo largo de la cara de la ventana redonda, teniendo cuidado de mantener 1-2 mm de hueso coclear que colinda con el nicho de la ventana redonda (Figura 2D).
- Complete los cortes del hueso temporal conectando los cortes de la ventana ovalada con los cortes de la cochectomía a cada lado de la ventana redonda.
NOTA: Debido a la fragilidad del hueso coclear, preservar la fosa tensorial del tímpano en la muestra y evitar cortes a través de ella ayudará a prevenir fracturas del hueso coclear que se extiendan hasta el RWM y comprometan su integridad. - Realice las uniones finales al hueso denso de la base del cráneo adyacente al conducto auditivo interno y afeite suavemente hacia abajo para obtener una muestra de RWM extirpada (Figura 3A).
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Representative Results
Como se demuestra en la Figura 3A, este método permite la explantación de la membrana de ventana redonda intacta del conejillo de indias con un anillo circundante de hueso rígido. El RWM debe estar completamente conectado circunferencialmente al anillo óseo. No se deben apreciar fracturas del hueso coclear. En comparación con los especímenes humanos de ventana redonda, el conejillo de indias RWM no tiene una pseudomembrana suprayacente. Además, a diferencia de los humanos, existe un puente óseo entre la crura del estribo del conejillo de indias, que requiere fractura y remoción antes de la extracción de la superestructura del estribo. El análisis histológico (Figura 3B) de la RWM representativa muestra una clara estructura epitelial de tres capas con un nicho de ventana redondo adyacente e intacto.
Desde el punto de vista de la técnica, hay dos pasos críticos. En primer lugar, al realizar la cochectomía en el paso 2.7, es importante utilizar el ecuador de la broca, en lugar de la punta, para realizar el corte, ya que el temblor en la punta de la fresa puede provocar fracturas traumáticas en el hueso coclear que pueden extenderse hasta la membrana de la ventana redonda. En segundo lugar, es importante perforar completamente el conducto auditivo interno, ya que esto permite la extirpación completa del nervio coclear y una disección más fácil de la lámina espiral ósea, lo que da como resultado una cavidad unificada en el lado intracoclear para la toma de muestras experimentales (Figura 2C).
Después de que el RWM se ha extraído con éxito, nuestro grupo utilizó una cámara de Ussing modificada para evaluar las propiedades farmacocinéticas de la membrana. La cámara de Ussing modificada ha sido validada por otros grupos en membranas timpánicas y de ventana redonda, así como en tejido retiniano para evaluar las propiedades de transporte de las membranas epiteliales14,15. Este dispositivo impreso en 3D se construyó con Poly-Jet Vero y consta de dos piezas base triangulares, cada una con una cámara de fluido de 400 μL (Figura 3). El borde óseo del RWM se fija a la base con epoxi de 2 partes (Gorilla, ver Tabla de Materiales), seguido de sellador de silicona (ver Tabla de Materiales) para asegurar un sellado hermético (Figura 4). Se tiene mucho cuidado para evitar que cualquier epoxi o sellador entre en contacto con la membrana. Con el RWM intercalado en su lugar, las dos bases se pegan con epoxi. Durante los experimentos de transporte, la carga (orientada hacia el oído medio) se llena con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene el vehículo de entrega (o cualquier molécula de interés), y la cámara de muestreo (orientación de la rampa timpánica) se llena solo con PBS. A intervalos de tiempo regulares, el fluido de la cámara de muestreo se aspira completamente y se reemplaza con PBS nuevo.
Se toman medidas de control de calidad durante cada experimento para garantizar que haya un sello hermético alrededor de la muestra dentro del aparato, así como una membrana completamente intacta sin microperforaciones. A continuación se muestran resultados representativos con una solución de nanopartículas de núcleo de hierro marrón. La verificación cuantitativa de un sello hermético se logra aspirando el volumen total de la cámara de muestreo durante cada intervalo de muestreo; El líquido que se escapa de la cámara de muestreo daría como resultado menos del volumen total de aspiración. Al final de cada experimento, el volumen de fluido en la cámara de carga también debe permanecer igual. Además, como nuestro fluido objetivo es de color marrón, también es fácilmente visible en caso de fuga.
Para garantizar que no haya fugas dentro de la membrana, se adoptaron varios enfoques. En primer lugar, se extraen inmediatamente las muestras de RWM utilizadas en este estudio, y las imágenes de microscopía óptica, confocal y electrónica confirman las estructuras celulares y de membrana intactas sin microperforaciones (Figura 3A, B). En segundo lugar, se crearon deliberadamente microperforaciones en un subconjunto de muestras de RWM para comparar el efecto en la entrega de nanopartículas. La inspección visual del aspirado de la cámara de muestreo y carga sirve como confirmación adicional de la integridad de la muestra y de la fijación hermética. En RWM con perforaciones, hay un rápido equilibrio de la cámara de carga y muestreo, que se puede observar a través de un cambio de color distintivo (Figura suplementaria 1). Además, se encontró que el transporte en las RWM microperforadas fue mayor que la varianza máxima observada en las membranas intactas (Figura suplementaria 2). Juntos, sirven como mecanismos de control de calidad para la integridad del sello hermético que rodea la muestra, así como el RWM.
Figura 1: Imagen preoperatoria del hueso temporal de la cobaya. La bulla timpánica, el conducto auditivo externo y el conducto facial (*) se muestran en esta imagen preoperatoria del hueso temporal de la cobaya. Barra de escala = 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes intraoperatorias. Imágenes intraoperatorias que demuestran la relación entre la membrana de la ventana redonda y el yunque (*), la cóclea (**), el estribo (†) y el conducto auditivo interno descomprimido (‡). Las áreas sombreadas indican partes del espécimen que se eliminarán. (A) Cavidad del oído medio del conejillo de Indias después de la extirpación de la membrana timpánica y el nervio facial (paso 2.3). (B) Cavidad del oído medio después de la descompresión del canal tensor timpánico (paso 2.6). (C) Vista basal de RWM después de la cocleostomía y la extirpación del contenido del oído interno (paso 2.11). (D) Vista de RWM después de la extracción del estribo y la identificación del vestíbulo (paso 2.13). Barra de escala = A,B (1 cm); C,D (5 mm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Espécimen final e histología de RWM. (A) Espécimen macroscópico RWM de cobaya con un anillo óseo. Barra de escamas = 1 cm. (B) La histología de la membrana de ventana redonda del conejillo de indias explantado demuestra una estructura intacta de tres capas. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Dispositivo microfluídico para experimentos de transporte transmembrana. (A) Diagrama del dispositivo microfluídico utilizado para experimentos de transporte transmembrana. (B,C) Dispositivo microfluídico impreso para los experimentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Carga y muestreo del contenido de la cámara durante un experimento de entrega de nanopartículas con núcleo de hierro de 5 h. (A) La cámara de carga de RWM intacto muestra una disminución gradual en la intensidad del color a medida que disminuye la concentración de nanopartículas. (B) La cámara de muestreo de RWM intacto muestra una coloración estable a lo largo del tiempo, consistente con bajos niveles de entrega de nanopartículas. (C) La cámara de carga de RWM perforado demuestra una rápida disminución en la intensidad del color a medida que el contenido se equilibra con la cámara de muestreo. (D) La cámara de muestreo de RWM perforado muestra un aumento gradual del color a lo largo del tiempo, consistente con altos niveles de entrega de nanopartículas. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 2: Resultados representativos del transporte para la administración de nanopartículas. Resultados representativos del transporte para la entrega de nanopartículas (núcleo de Fe3O4 con recubrimiento de polietilenglicol, radio medio de 77 nm) a través de RWM de cobaya, tanto intactos como con perforaciones (media ± SD, n ≥ 3 experimentos RWM). Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
En la administración local de fármacos al oído, la RWM es la principal vía de paso para que la terapéutica llegue al oído interno. Se necesita un modelo de sobremesa preciso y fiable para comprender mejor los mecanismos de transporte y la permeabilidad a través de nuevos vehículos de administración y para el desarrollo de fármacos. En este estudio, demostramos que la explantación de RWM de cobaya es un procedimiento factible y confiable para permitir investigaciones sistemáticas de las interacciones fármaco-membrana. Lundman et al. y Kelso et al. describieron previamente la utilización de un modelo similar de permeabilidad RWM 2,16; sin embargo, los pasos específicos de la extracción quirúrgica no se han detallado hasta ahora, y la fragilidad del hueso coclear y la anatomía compleja han planteado un desafío para la cosecha consistente y en bloque de RWM intactos.
El conejillo de indias RWM se encuentra al final de la rampa timpánica de la cóclea y está rodeado por una fina capa de hueso coclear. La fractura de esta estructura ósea durante el proceso de explantación puede dar lugar a una muestra inutilizable, ya que el RWM tiende a desprenderse si el hueso coclear circundante no permanece intacto. Nuestro grupo observó que las fracturas ocurrían con mayor frecuencia cuando se perforaba cerca de la unión entre el hueso de la base del cráneo altamente denso y la cóclea frágil, ya que la transición en la densidad ósea aumentaba la probabilidad de propagación de la fractura a través de la ventana redonda. Por esta razón, se sugiere que mantener el hueso más denso de la fosa tensorial del tímpano, que está unida a la cóclea muy cerca del RW, aumentará el rendimiento de la recolección de muestras, particularmente en animales más viejos. La alteración del hueso también puede ocurrir durante la extracción del contenido coclear; Se debe tener cuidado de eliminar suavemente la lámina ósea en espiral con una manipulación mínima del hueso coclear circundante.
Un detalle importante a tener en cuenta con este modelo es la viabilidad del RWM después de la explantación. Grupos previos han sugerido que la RWM en mamíferos sigue siendo viable durante 24-48 h después de la extracción17. El presente estudio ha reflejado estos hallazgos; Los estudios de transporte consistentes y los análisis histológicos que demuestran estructuras celulares intactas (Figura 2A) han respaldado la viabilidad del RWM de cobaya en el momento de los experimentos. Para mantener la salud general de la muestra extraída, se extrae el RWM y se incluye dentro de las 3 h posteriores a la eutanasia.
En el estudio de la farmacocinética de fármacos a través de la RWM in vivo, sigue habiendo una dificultad técnica considerable para realizar mediciones de la distribución y concentración perilinfática1. Los cambios en los métodos de administración intratimpánica y la cantidad aplicada han dado lugar a resultados terapéuticos variados. Estas dificultades se ven agravadas por la compleja dinámica de fluidos dentro del laberinto, así como por la salida irregular del material inyectado a través de la trompa de Eustaquio. El método de explantación descrito permite el estudio aislado de la RWM y de los factores que afectan a su permeabilidad como modelo ex vivo . Además, el explante también permite la interrogación directa y la visualización de varios métodos empleados actualmente para aumentar la permeabilidad de RWM, como las microburbujas de ultrasonido18 y la modulación de unión inducida químicamente19. Los estudios futuros sobre los mecanismos específicos de endocitosis implicados en la administración de fármacos también se beneficiarían de este modelo de laboratorio.
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Disclosures
Los autores no tienen revelaciones que hacer.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado en parte por las subvenciones del NIDCD No. 1K08DC020780 y 5T32DC000027-33, y el Fondo de Investigación Auditiva Rubenstein.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 1SD-G1 | |
| 2 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 2SD-G1 | |
| 6 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 6D-G1 | |
| ANSPACH EMAX 2 Plus System | Anspach | EMAX2PLUS | Any bone cutting drilling system will work |
| BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe | Becton, Dickinson, and Co. | 382903057894 | Any 27-28 G needle |
| Gorilla Epoxy | Gorilla | 4200101 | |
| Kwik-CAST | World Precision Instruments | KWIK-CAST |
References
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