Summary
Aqui apresentamos um protocolo para visualizar o transporte de monocarboxilatos, glicose e ATP em células gliais e neurônios usando sensores baseados em transferência de energia de ressonância de Förster codificados geneticamente em uma preparação cerebral ex-vivo de larvas de Drosophila .
Abstract
As altas necessidades energéticas dos cérebros devido à atividade elétrica são uma de suas características mais distintivas. Esses requisitos são atendidos pela produção de ATP a partir da glicose e seus metabólitos, como os monocarboxilatos lactato e piruvato. Ainda não está claro como esse processo é regulamentado ou quem são os principais atores, particularmente em Drosophila.
Usando sensores baseados em transferência de energia de ressonância de Förster codificados geneticamente, apresentamos um método simples para medir o transporte de monocarboxilatos e glicose em células gliais e neurônios em uma preparação cerebral ex-vivo de larvas de Drosophila . O protocolo descreve como dissecar e aderir um cérebro larval expressando um dos sensores a uma lamínula de vidro.
Apresentamos os resultados de um experimento inteiro em que o transporte de lactato foi medido em cérebros de larvas derrubando transportadores monocarboxilatos previamente identificados em células gliais. Além disso, demonstramos como aumentar rapidamente a atividade neuronal e rastrear alterações de metabólitos no cérebro ativo. O método descrito, que fornece todas as informações necessárias, pode ser usado para analisar outros tecidos vivos de Drosophila .
Introduction
O cérebro apresenta elevadas necessidades energéticas devido ao alto custo de restauração de gradientes iônicos em neurônios causados pela geração e transmissão de sinais elétricos neuronais, bem como pela transmissão sináptica 1,2. Há muito se pensa que essa alta demanda energética é atendida pela oxidação contínua da glicose para produzir ATP3. Transportadores específicos na barreira hematoencefálica transferem a glicose no sangue para o cérebro. Níveis glicêmicos constantes garantem que o cérebro receba um suprimento constante de glicose4. Curiosamente, crescentes evidências experimentais sugerem que moléculas derivadas do metabolismo da glicose, como o lactato e o piruvato, desempenham um papel importante na produção de energia das células cerebrais 5,6. No entanto, ainda há algum debate sobre a importância dessas moléculas para a produção de energia e quais células do cérebro as produzem ou utilizam 7,8. A falta de ferramentas moleculares apropriadas com a alta resolução temporal e espacial necessárias para esta tarefa é uma questão significativa que tem impedido que esta controvérsia seja completamente resolvida.
O desenvolvimento e a aplicação de vários sensores metabólicos fluorescentes projetados resultaram em um aumento notável em nossa compreensão de onde e como os metabólitos são produzidos e usados, bem como como os fluxos metabólicos ocorrem durante a atividade neuronal basal e alta9. Sensores metabólicos codificados geneticamente, baseados na microscopia de transferência de energia por ressonância de Förster (FRET), como ATeam (ATP), FLII12Pglu700μδ6 (glicose), lacônico (lactato) e pirônico (piruvato), têm contribuído para o entendimento do metabolismo energético cerebral 10,11,12,13. No entanto, devido aos altos custos e equipamentos sofisticados necessários para a realização de experimentos em animais vivos ou tecidos, os resultados em modelos de vertebrados ainda são primariamente limitados a culturas de células (células gliais e neurônios).
O uso emergente do modelo de Drosophila para expressar esses sensores revelou que as principais características metabólicas são conservadas em todas as espécies e sua função pode ser facilmente abordada com esta ferramenta. Mais importante, o modelo de Drosophila lançou luz sobre como a glicose e o lactato/piruvato são transportados e metabolizados no cérebro das moscas, a ligação entre o consumo de monocarboxilato e a formação da memória, e a notável demonstração de como aumentos na atividade neural e fluxo metabólico se sobrepõem 14,15,16,17. O método apresentado aqui para medir os níveis de monocarboxilato, glicose e ATP usando sensores FRET codificados geneticamente expressos no cérebro da larva permite que os pesquisadores aprendam mais sobre como o cérebro de Drosophila usa energia, que pode ser aplicada aos cérebros de outros animais.
Mostramos que este método é eficaz na detecção de lactato e glicose em células gliais e neurônios, e que um transportador monocarboxilato (Chaski) está envolvido na importação de lactato para as células gliais. Também demonstramos um método simples para estudar as alterações dos metabólitos durante o aumento da atividade neuronal, que pode ser facilmente induzido pela aplicação em banho de um antagonista do receptorGABA A . Finalmente, mostramos que esta metodologia pode ser usada para medir o transporte de monocarboxilato e glicose em outros tecidos metabolicamente significativos, como corpos adiposos.
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Protocol
1. Manutenção de cepas volantes e sincronização larval
- Para a realização desses experimentos, utilizaram-se culturas de moscas criadas a 25 °C em alimento padrão de Drosophila composto por 10% de levedura, 8% de glicose, 5% de farinha de trigo, 1,1% de ágar, 0,6% de ácido propiônico e 1,5% de metilparabeno.
- Para seguir este protocolo, use as seguintes linhas: w1118 (fundo de controle experimental), OK6-GAL4 (driver para neurônios motores), repo-GAL4 (driver para todas as células gliais), CG-GAL4 (driver para corpos gordos), UAS-Pyronic (sensor de piruvato), UAS-FLII12Pglu700μδ6 (sensor de glicose), UAS-Laconic (sensor de lactato), UAS-GCaMP6f (sensor de cálcio), UAS-AT1.03NL (sensor ATP) e UAS-Chk RNAi GD1829. Todas as linhagens que expressam sensores ou RNAi estão no background genético w1118 .
- Para obter larvas errantes sincronizadas de terceiro ínstar, colocar 300 moscas (3-5 dias de idade, 100 machos, 200 fêmeas virgens) do cruzamento genético desejado na câmara de oviposição, que contém uma placa de Petri de 60 mm coberta com agarose a 1% em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Coloque uma gota de levedura líquida/cremosa (1,5 cm de diâmetro) no centro da placa para incentivar as moscas a botar ovos (Figura 1).
- Manter as moscas a 25 °C durante 3 dias, substituindo a placa de Petri de agarose por uma fresca e levedura recém-dissolvida duas vezes por dia.
- Deixe as moscas botarem ovos por 4 h no quarto dia antes de trocar a placa de Petri. Remova esta placa. Em seguida, por 3 h, deixe as moscas depositarem ovos em uma nova placa de agarose com levedura recém-dissolvida. Use essas larvas nos experimentos.
- Após 3 h, retire a placa que contém os ovos e coloque-a em uma incubadora de 25 °C por 24 h.
- Recolher 50 a 100 larvas recém-eclodidas desta placa (0 h após a eclosão das larvas) e colocá-las num frasco de plástico contendo alimento padrão. Para permitir que as larvas se alimentem corretamente, certifique-se de que o alimento esteja moído e macio. Use as larvas 96 h após a transferência.
2. Faça as tampas de vidro com poli-L-lisina
- Realizar esta etapa 1 h antes da dissecção larval. Em uma placa de cultura celular de 6 poços, coloque lamínulas de vidro de 25 mm (o diâmetro das tampas a serem usadas depende da câmara de registro disponível no microscópio).
- Coloque uma gota (300 μL) de poli-L-lisina no centro de cada lamínula durante 30 minutos à temperatura ambiente.
- Lavar cada lamínula 3x com água destilada e, em seguida, 2x com uma solução salina desprovida de Ca2+ (a mesma solução utilizada para dissecar as larvas, ver passo 3.2). Instale as tampas na câmara de gravação e preencha-a com solução salina livre de Ca2+.
NOTA: Embora o cérebro da larva possa aderir diretamente às lamínulas de vidro, a adesão é fraca, e o cérebro ocasionalmente se move ou desloca durante o experimento devido ao fluxo contínuo de solução salina. A adição da etapa de poli-L-lisina reduz o risco de movimentos ou mesmo perda cerebral como resultado das lavagens.
3. Dissecção do cordão nervoso ventral (VNC) e corpos gordurosos (corpos estranhos)
- Reúna as larvas errantes de terceiro ínstar do cruzamento genético desejado (a partir do passo 1.7) e lave-as completamente 3x com água destilada.
- Colocar as larvas em uma placa de dissecção de vidro contendo 750 μL de solução salina gelada nominalmente zero de Ca2+ composta por NaCl 128 mM, KCl 2 mM, MgCl2 mM, trealose 5 mM, HEPES 5 mM e sacarose 35 mM (pH = 6,7, medido com um medidor de pH e ajustado com NaOH 1 M e HCl 37% v/v).
NOTA: Ajustar o pH para 6,7 é crítico porque, como observado anteriormente, o transporte de monocarboxilato é altamente dependente do pH da solução. Além disso, 6,7 corresponde ao pH na hemolinfa de uma larva de terceiro ínstar17,18. - Coloque a larva sob um estereomicroscópio e faça um corte transversal na parte de trás do abdômen com um par de pinças.
- Empurre a mandíbula com a pinça enquanto vira as larvas do avesso.
- Observe o cordão nervoso ventral (VNC) próximo à mandíbula. Remova cuidadosamente os discos imaginários e os tecidos cérebro-caudais remanescentes.
- Separe o VNC com o cérebro central e lobos ópticos do resto do tecido, cortando os nervos. Transferir a CNV, pegando-a com pinça dos nervos restantes e colocando-a na câmara de gravação contendo a solução de registro livre de Ca2+ (mesma solução do passo 3.2). Os VNCs aderirão imediatamente às tampas.
- Para evitar a interferência dos nervos remanescentes, fixe-os na parte inferior da lamínula usando pinça (os nervos também serão fluorescentes dependendo da linha de driver utilizada) (Figura 2).
- Para realizar experimentos em corpos gordurosos (corpos estranhos) medindo o transporte de glicose ou monocarboxilato em outro conjunto de experimentos, proceder ao isolamento dos tecidos seguindo as etapas 3.1-3.4. Uma vez que as larvas estão viradas do avesso, observe que o corpo estranho é um tecido branco, bilateral e plano.
- Colocar os corpos estranhos isolados que expressam os sensores FRET (obtidos a partir de um cruzamento genético utilizando os condutores apropriados) na câmara de registo que contém a solução de registo sem Ca2+.
OBS: O CORPO ESTRANHO é altamente hidrofóbico (tende a flutuar na superfície da solução) e extremamente vulnerável à manipulação com pinças, devendo ser manuseado com cuidado. Qualquer manuseio áspero desse tecido resultará em células mortas mais tarde (com uma diminuição da fluorescência dos sensores). - Coloque a câmara de registro contendo VNCs/FBs no palco do microscópio.
4. Imagem de células vivas
- Para obter imagens dos sensores que expressam tecidos, use um microscópio de fluorescência vertical acoplado a um sistema de divisão de emissão e uma câmera CCD. Ligue o sistema de iluminação do microscópio 30 minutos antes de iniciar qualquer experimento.
NOTA: Aqui usamos um microscópio de fluorescência Spinning Disk equipado com uma objetiva de imersão em água de 20x/0,5 para observar VNCs e FBs. A Figura 2 também mostra o uso de uma objetiva de imersão em água de 40x/0,8. - Para visualizar a fluorescência GCaMP6f, defina os comprimentos de onda de excitação e emissão em 488 nm e 540 nm, respectivamente. Para sensores Laconic/Pyronic/ATP/glucose, defina o comprimento de onda de excitação em 440 nm e os comprimentos de onda de emissão em 488 nm (mTFP, CFP) e 540 nm (Vênus, YFP).
- Adquira imagens de 512 x 512 pixels a cada 2 s para GCaMP6f e a cada 10-30 s para sensores Laconic/Pyronic/ATP/glicose. Determinar a exposição ótima à fonte de luz observando a qualidade da imagem obtida. Para seguir este protocolo, certifique-se de que as imagens sejam de exposição de 300 ms para os sensores Laconic e Pyronic e de 100-150 ms para os sensores de glicose e ATP .
NOTA: A exposição pode variar dependendo do uso de um microscópio de fluorescência confocal ou normal. - Uma vez instalada a câmara de registro no estágio do microscópio, coloque cuidadosamente a objetiva de imersão em água e certifique-se de que a objetiva permaneça submersa durante todo o experimento. Manter a temperatura ambiente a 25 °C.
- Conectar a câmara de registro a um sistema de perfusão e manter os tecidos banhados na solução de registro contendo NaCl 128 mM, KCl 2 mM, CaCl2 1,5 mM, MgCl2 4 mM, trealose 5 mM, HEPES 5 mM e sacarose 35 mM, pH 6,7 (medido com um medidor de pH e ajustado com NaOH e HCl).
- Manter um fluxo constante de 3 mL/min de solução de registro através do tecido usando gravidade, acoplado a uma bomba peristáltica de baixo fluxo para extrair o líquido da câmara, mantendo o volume constante. Para atingir o fluxo necessário, posicione os tubos contendo solução (tubos plásticos de 50 mL) 25 cm acima do estágio do microscópio.
NOTA: Este fluxo impulsionado pela gravidade é usado para evitar o movimento do tecido causado por bombas peristálticas, permitindo uma análise de imagem mais precisa mais tarde. - Antes de qualquer estimulação, mantenha a solução de gravação fluindo por 5-10 min para obter uma linha de base estável de fluorescência dos sensores. Altere a duração conforme necessário para obter essa linha de base.
- Substitua a solução fluida pela solução de estimulação durante 5 minutos para estimular os VNC/FB (com glicose, piruvato ou lactato na concentração descrita para cada experimento dissolvido em solução salina; ver cada figura).
NOTA: A duração da estimulação pode ser variada de acordo com as necessidades do experimento (por exemplo, pulsos de glicose podem ser aumentados para 10 min para atingir um platô nos neurônios, como relatado anteriormente16). - Para manter a osmolaridade na solução de estimulação, retifique a concentração de sacarose (um carboidrato não metabolizável pelo cérebro de Drosophila ) de acordo com a concentração do monocarboxilato ou glicose adicionada.
- Troque as soluções usando um sistema simples de válvulas. Tenha cuidado para não mover o estágio do microscópio.
- Expor o VNC a 80 μM de picrotoxina (PTX, fluxo contínuo) para estimular a atividade neuronal. Esse procedimento aumenta a frequência de oscilações de Ca2+ , tornando possível observar mudanças em moléculas metabolicamente relevantes (por exemplo, ATP intracelular).
- No final de qualquer experimento, lavar cuidadosamente todo o sistema de fluxo, incluindo os tubos e a câmara de registro, por pelo menos 10 min com a solução salina e outros 10 min com água destilada para eliminar qualquer vestígio das soluções utilizadas.
5. Processamento de imagens e análise de dados
- Para processar as imagens obtidas, prossiga com os passos mostrados na Figura 3.
- Importe a imagem (Laconic) para o software ImageJ. A imagem tem duas visões da amostra: a esquerda é o sinal mTFP e a da direita é o sinal de Vênus. Selecione uma região que inclua as células a serem analisadas e separe essas imagens (mTFP e Vênus) em uma nova janela. Certifique-se de que essas imagens contenham exatamente a mesma área.
- Abra o plugin de registro e corrija a pequena deriva do tecido que normalmente é observada no experimento com a função corpo rígido. Execute isso em ambas as imagens (mTFP e Vênus).
- Selecione pelo menos 10 regiões de interesse (ROIs) no citosol das 10 células correspondentes no sinal mTFP (488 nm) e transfira as seleções para a imagem de Vênus (540 nm).
- Selecione duas ou três ROIs próximas às células analisadas, mas sem sinal discernível (sempre dentro da VNC ou do tecido analisado, ver Figura 3). Estes são os ROIs de fundo.
- Com as ROIs selecionadas em ambas as imagens, obtenha-se o valor médio de cinza de cada sinal usando a medida da função. Transfira os dados para uma folha de dados e subtraia o valor médio de fundo para cada sinal.
- Determine a razão de fluorescência mTFP sobre Vênus (para Lacônico e Pirônico). Este valor é calculado de forma diferente dos outros sensores FRET descritos aqui (onde a razão é geralmente YFP/CFP) porque quando ligados aos seus respectivos substratos, tanto o Laconic quanto o Pyronic reduzem suas eficiências de FET.
- Normalize os dados dividindo cada valor registrado pela linha de base. Em uma folha de dados separada, calcule a linha de base tomando o valor médio da razão mTFP/Vênus durante os 2 min que antecedem o estímulo.
- Para as medições de glicose e ATP usando sensores baseados em FRET, calcule a razão YFP/CFP e normalize os dados conforme descrito na etapa 5.8.
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Representative Results
Por até 1 h, esse procedimento permite a fácil medição de alterações intracelulares na fluorescência de sensores de monocarboxilato e glicose. Como mostrado na Figura 4, sensores lacônicos tanto nas células gliais quanto nos neurônios motores respondem a 1 mM de lactato em uma taxa semelhante no início do pulso, mas os neurônios motores atingem um aumento maior em relação à linha de base durante o pulso de 5 min, como demonstrado anteriormente17. Essa concentração de lactato foi escolhida por ser comparável aos níveis encontrados na hemolinfa de larvas de terceiro ínstar. Da mesma forma, quando sensores de glicose que expressam CNV foram expostos a glicose de 5 mM (valor semelhante ao medido na hemolinfa por nós e outros19), o sinal do sensor aumentou a uma taxa semelhante em células gliais e neurônios. Durante o pulso de glicose, no entanto, o sinal nos neurônios aumenta mais do que nas células gliais. Isso é consistente com observações anteriores de preparações semelhantes de expressão de sensores FRET16.
Essa preparação pode ser usada para conduzir experimentos com monocarboxilatos não descritos e transportadores de glicose expressos em células gliais ou neurônios de Drosophila 20. Exemplificamos aqui o uso de RNA-interferência para mostrar que Chaski (Chk), que era previamente conhecido por transportar monocarboxilatos em células heterólogas, transporta lactato em células gliais (Figura 5). Sob condições de restrição nutricional, esse transportador foi descrito como tendo um papel importante na fisiologia e no comportamento animal21. Observamos que, nas células gliais, a eliminação da Chk reduziu o transporte de lactato em comparação com as VNCs controle expostas a 1 mM de lactato (Figura 5). Outros transportadores putativos podem ser testados para ver se eles podem transportar metabólitos em condições fisiológicas e patológicas.
Para abordar o estudo das alterações metabólicas associadas à atividade neuronal, desenvolvemos um método simples para aumentar a atividade neuronal sem utilizar procedimentos tecnicamente complexos, como a optogenética, que pode interferir nas medidas do sensor FRET (Figura 6). O CNV isolado foi exposto à Picrotoxina (PTX), um conhecido antagonistado receptor GABA A previamente utilizado por nós e outros17,22. A concentração utilizada aumenta a frequência de oscilações de cálcio nos neurônios (medida por mudanças na fluorescência do GCaMP6f), bem como alterações significativas em moléculas metabolicamente relevantes como glicose, lactato e piruvato17. Além disso, aumentos induzidos por PTX na atividade neuronal resultam em uma queda transitória nos níveis de ATP no soma dos neurônios motores. Esse fenômeno já foi descrito em modelos de vertebrados nos quais a atividade neuronal foi aumentada via estimulação elétrica ou pelo uso de antagonistas do receptor GABAA 23,24. Como resultado, esse modelo pode ser usado para rastrear alterações metabólicas em subconjuntos específicos de neurônios e células gliais, abordando a necessidade de transportadores relacionados à energia que contribuam para a produção de ATP durante a alta atividade neuronal.
O transporte de glicose e monocarboxilato também é importante em tecidos ou células além do cérebro. Mostramos aqui a visualização do monocarboxilato (lactato/piruvato) e da captação de glicose nos corpos adiposos, um tecido metabolicamente relevante presente nas larvas e na mosca adulta que tem várias funções-chave, como armazenamento e metabolização delipídios25. O sensor lacônico é bem expresso em FB, como mostrado na Figura 7, onde as gotículas lipídicas podem ser vistas como minúsculas esferas pretas dentro da célula. Este tecido isolado adere bem às lamínulas revestidas de poli-L-lisina, permitindo um procedimento de imagem celular de longo prazo que também é fácil de analisar. Observamos um aumento significativo na fluorescência do sensor de glicose quando o corpo estranho foi exposto a concentrações crescentes de glicose (aproximadamente 5 mM), o que é próximo à concentração de glicose encontrada na hemolinfa. Uma exposição adicional a concentrações mais elevadas de glicose (10 mM) não resulta no aumento esperado da fluorescência do sensor. Finalmente, no corpo estranho, foi possível medir a importação de lactato e piruvato (Figura 7C,D). Neste caso, o aumento das concentrações de lactato e piruvato causa um aumento proporcional na fluorescência lacônica e pirônica (variando de 0,1 a 1 mM). Concentrações mais elevadas de monocarboxilato resultam em saturação de sinal no interior das células.
Figura 1: Sincronização das larvas de Drosophila . O procedimento de sincronização larval é representado graficamente. Duas horas antes do início do processo, as placas de agarose a 1% devem ser preparadas e trocadas duas vezes ao dia até o dia 4. As larvas que eclodem devem ser coletadas com cuidado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Isolado cérebro de larvas de Drosophila expressando o sensor de lactato lacônico. (A) Uma imagem representativa da VNC separada de uma larva de terceiro ínstar de Drosophila isolada aderiu a uma lamínula revestida de poli-L-lisina e expressou o sensor de lactato lacônico em neurônios motores (OK6-GAL4). As imagens mostram uma imagem de campo brilhante do VNC (esquerda) e a fluorescência mTFP do sensor (painel do meio) capturada com uma objetiva de imersão em água de 20x. As imagens no painel inferior são do mesmo VNC tiradas com uma objetiva de imersão em água de 40x. (B) Neurônios motores de um VNC expressando o sensor de lactato lacônico (OK6>Laconic) colocado em solução salina zero-lactato. A imagem mostra fluorescência mTFP (esquerda), fluorescência de Vênus (centro) e a relação entre as duas fluorescências (direita, produzida usando o plugin Ratio Plus do software ImageJ). Barras de escala = 50 μm (A, painel superior), 10 μm (painel inferior A , B). Abreviações: VNC = cordão nervoso ventral; mTFP = proteína monomérica teal fluorescente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análise passo a passo das imagens. Uma ilustração esquemática do protocolo do software ImageJ para análise de imagens, exibindo o processo (primeira coluna), os comandos ImageJ (segunda coluna) e os resultados do processamento da imagem (terceira coluna). O exemplo começa com uma imagem bruta retirada de um VNC expressando o sensor de lactato lacônico em neurônios motores (OK6-GAL4). Abreviações: VNC = cordão nervoso ventral; mTFP = proteína monomérica teal fluorescente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Transporte de monocarboxilato e glicose em neurônios e células gliais do cérebro de larvas de Drosophila . (A) Imagens representativas da VNC expressando o sensor de lactato lacônico em neurônios motores (OK6-Gal4>Laconic). A fluorescência lacônica em neurônios motores é observada antes, durante e após um pulso de 5 min de 1 mM de lactato. O plugin Ratio Plus do ImageJ foi usado para criar imagens de proporção (mTFP/Vênus). Barra de escala = 10 μm. (B) Registros representativos de sinais FRET de VNCs isoladas expressando o sensor de lactato lacônico em neurônios motores (OK6-GAL4, linhas cinzas) ou células gliais (REPO-GAL4, linhas pretas) expostos a 1 mM de lactato por 5 min. Os traços retratam os sinais de FRET ajustados para o valor médio coletado 2 min antes da exposição ao lactato. (C) Registros representativos de sinais FRET de VNCs isolados expressando o sensor de glicose FLII12Pglu700μδ6 em neurônios motores (OK6-GAL4, linhas cinzas) ou células gliais (REPO-GAL4, linhas pretas) expostos a glicose 5 mM por 5 min. Os traços retratam os sinais de FRET ajustados para o valor médio coletado dois minutos antes da exposição à glicose. Abreviações: VNC = cordão nervoso ventral; mTFP = proteína fluorescente monomérica teal; FRET = Transferência de energia de ressonância de Föster. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Transporte de lactato em células gliais do cérebro de larvas de Drosophila expressando RNAi de Chaski. (A) VNC isolado expressando o sensor de lactato Laconic sozinho (controle genético, w1118, linha preta) ou co-expressando um RNAi para a expressão de knockdown Chaski (Chk) (chk-RNAi, magenta) foram expostos a 1 mM de lactato por 5 min. Para cada condição, os traços representam o valor médio de FRET obtido de sete CNV separadas (70 células por condição, normalizado usando o valor médio obtido 2 min antes de ser exposto ao lactato). (B) A área sob a curva em A é usada para calcular o acúmulo de lactato intracelular. Para cada condição, os valores são o SE médio de 70 células e sete experimentos independentes (controle ou chk-RNAi). O teste t de Student não pareado foi utilizado para análise estatística (*p < 0,05). Abreviações: VNC = cordão nervoso ventral; FRET = Transferência de energia de ressonância de Föster. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Alterações nos níveis de ATP neuronal induzidas pela exposição à picrotoxina. Registros da fluorescência capturada de VNCs expressando o sensor de cálcio GCaMP6f codificado geneticamente (A) ou (B, um conjunto diferente de experimentos) o sensor ATP AT1.03NL em neurônios motores (OK6-GAL4) que foram expostos ao antagonista do receptor GABAA Picrotoxina (80 μM) durante o tempo indicado pela linhagem. O registro representativo provém de um único neurônio motor de uma VNC (em A) ou a média ± SE de 10 células de uma única VNC (em B) normalizada para os valores médios obtidos 2 min antes da exposição à PTX. Abreviações: VNC = cordão nervoso ventral; PTX = picrotoxina; EP = erro padrão; CFP = proteína fluorescente ciano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Transporte de monocarboxilato e glicose em corpos gordurosos de Drosophila . (A) Imagem do corpo gorduroso isolado de larvas de terceiro ínstar expressando o sensor de lactato lacônico (fluorescência mTFP). Barra de escala = 10 μm. (B) Traços representativos do sinal normalizado captado no corpo estranho expressando o sensor de glicose (FLII12Pglu700μδ6) exposto à glicose (1, 5 e 10 mM de glicose). Os dados foram normalizados para os primeiros 2 minutos antes da exposição à glicose. (C,D) Traços representativos do sinal normalizado obtido a partir do corpo estranho expressando o sensor de lactato (C) ou o sensor de piruvato (D) expostos a 0,1-0,5-1 mM de lactato ou piruvato. Os dados foram normalizados para os primeiros 2 min antes da exposição ao lactato ou piruvato. Abreviações: CE = corpo gordo; mTFP = proteína fluorescente monomérica teal; YFP = proteína fluorescente amarela; CFP = proteína fluorescente ciano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O uso do modelo de Drosophila para o estudo do metabolismo cerebral é relativamente novo26, e tem sido demonstrado que ele compartilha mais características com o metabolismo de mamíferos do que o esperado, o que tem sido estudado principalmente in vitro em culturas de neurônios primários ou fatias cerebrais. Drosophila se destaca em experimentos in vivo graças à bateria de ferramentas genéticas e sensores codificados geneticamente disponíveis que permitem aos pesquisadores visualizar em tempo real as mudanças metabólicas causadas pela atividade induzida ou mesmo em resposta a um estímulo sensorial.
O protocolo aqui descrito mostra como medir o transporte de monocarboxilato e glicose em células gliais e neurônios de Drosophila VNC em uma preparação ex-vivo que permite o uso de sensores metabólicos fluorescentes codificados geneticamente baseados em microscopia FRET para fazer vídeos time-lapse de alterações metabólicas em neurônios ativos e em repouso. Este protocolo pode ser facilmente montado e realizado em qualquer laboratório usando o modelo Drosophila sem o uso de maquinário complexo, usando um microscópio epifluorescente equipado com um sistema de divisão de emissões. Ele também pode ser dimensionado para equipamentos mais avançados, como um disco giratório, laser confocal ou microscópios de dois fótons (mas um divisor para dividir a emissão de luz é necessário) para registrar células específicas mais profundamente localizadas no cérebro, como ocorre no cérebro adulto de Drosophila . Como esses tipos de sinais metabólicos são relativamente lentos, uma câmera de vídeo rápida ou cara não é necessária.
Além disso, a preparação isolada de VNC ou corpo estranho não necessita de um método sofisticado para correção de movimento, às vezes necessário para gravações in vivo . Os plugins ImageJ podem corrigir satisfatoriamente a maioria dos movimentos dos VNCs que são produzidos durante o experimento. Como resultado, o aumento da atividade neuronal pela adição de PTX ou pela adição de metabólitos relevantes pode ser realizado concomitantemente, sem os problemas causados pela contração muscular natural do corpo, como visto em outros protocolos (como a preparação do filé)27.
Mostramos experimentos representativos em que o transporte de lactato e glicose é claramente observado em concentrações fisiologicamente relevantes desses metabólitos (1 e 5 mM, respectivamente). A partir daí, espera-se que qualquer gene não caracterizado ou proteína previamente relatada possa ser testada quanto à capacidade de transporte em diversas condições, como o uso de diferentes modelos de doenças neurodegenerativas ou insultos metabólicos (dietas hipercalóricas ou restrição de nutrientes). A este respeito, mostramos que o knockdown mediado por RNAi de um transportador monocarboxilato conhecido reduz significativamente o transporte de lactato nas células gliais. Curiosamente, os sinais obtidos dos sensores Laconic e Pyronic são altamente sensíveis às mudanças de lactato ou piruvato no meio, permitindo uma medida precisa das mudanças intracelulares nesses metabólitos. Essa ampla faixa dinâmica do sinal parece ser diferente em células de mamíferos, onde uma relação não linear entre o sinal do sensor e a concentração de lactato intracelular tem sido observada28.
Essa abordagem pode fornecer respostas a aspectos importantes sobre onde e quando monocarboxilatos e glicose são processados ou utilizados para gerar energia no cérebro durante a atividade neuronal basal e alta. O aumento da atividade neuronal causado pela PTX pode causar alterações consideráveis nos metabólitos relacionados à energia, de forma semelhante ao observado em culturas celulares, lâminas cerebrais e organismos vivos23,24. Especificamente, um aumento na produção de ATP ocorre minutos após um aumento na atividade neuronal, provavelmente devido à metabolização da glicose e à troca de lactato e piruvato entre células gliais e neurônios, como relatado anteriormente17. O estudo das necessidades de células específicas para o fornecimento de glicose e monocarboxilatos, bem como dos mecanismos subjacentes ao seu transporte ou geração, pode ser possível através da manipulação da expressão de determinados genes em conjunto com o uso de sensores codificados geneticamente.
Outros tecidos metabolicamente importantes podem facilmente ligar-se a lamínulas revestidas de poli-L-lisina e as alterações dos metabolitos são obtidas durante vários minutos. Novos transportadores mediando o transporte de glicose ou lactato em diferentes tecidos podem ser estudados. A glicose circulante é transportada para produzir o dissacarídeo trealose em corpos gordurosos de larvas através de mecanismos que não são totalmente compreendidos, estes métodos poderiam ajudar a entender melhor esta via. Além disso, sob restrição nutricional, os ácidos graxos podem ser metabolizados para produzir corpos cetônicos no corpo estranho e os transportadores necessários para extrudê-los para a hemolinfa ainda são desconhecidos.
É importante notar que este protocolo pode ser usado para estimar o acúmulo de um metabólito ao longo do tempo ou para determinar taxas de aumento na fluorescência de um sensor específico entre as condições, mas não para considerar formalmente mudanças na "concentração", porque isso exigiria uma calibração do sensor in-situ. As diversas camadas celulares que compõem o VNC, neste caso, limitam a difusão de moléculas, como os ionóforos, necessárias para essa calibração. No entanto, aconselha-se seguir diretrizes de processamento de imagens que permitam níveis contrastantes de lactato entre vários órgãos ou células dentro de um animal29,30.
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Disclosures
Os autores declaram não ter interesses concorrentes ou financeiros.
Acknowledgments
Agradecemos a todos os membros do Sierralta Lab. Este trabalho foi apoiado pela FONDECYT-Iniciación 11200477 (para AGG) e FONDECYT Regular 1210586 (para JS). UAS-FLII12Pglu700μδ6 (sensor de glicose) foi gentilmente doado por Pierre-Yves Plaçais e Thomas Preat, CNRS-Paris.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| CCD Camera ORCA-R2 | Hamamatsu | - | |
| Cell-R Software | Olympus | - | |
| CG-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7011 | Fat body driver |
| Dumont # 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| DV2-emission splitting system | Photometrics | - | |
| Glass coverslips (25 mm diameter) | Marienfeld | 111650 | Germany |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 8,0,2 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| ImageJ software | National Institues of Health | Version 1,53t | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective | Olympus | - | |
| Methylparaben | Sigma | H5501 | |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| OK6-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | Motor neuron driver | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675S | CAUTION-Fatal if swallowed |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| Propionic Acid | Sigma | P1386 | |
| Repo-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7415 | Glial cell driver (all) |
| Sodium Lactate | Sigma | 71718 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI | Olympus | - | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Trehalose | US Biological | T8270 | |
| UAS-AT1.03NL | Kyoto Drosophila Stock Center | 117012 | ATP sensor |
| UAS-Chk RNAi GD1829 | Vienna Drosophila Resource Center | v37139 | Chk RNAi line |
| UAS-FLII12Pglu700md6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 93452 | Glucose sensor |
| UAS-GCaMP6f | Bloomington Drosophila Stock Center | 42747 | Calcium sensor |
| UAS-Laconic | Sierralta Lab | - | Lactate sensor |
| UAS-Pyronic | Pierre Yves Placais/Thomas Preat | - | CNRS-Paris |
| UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective | Olympus | - |
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