Summary
Er wordt een protocol gepresenteerd om te evalueren of kleine EV's (sEV's) geïsoleerd uit placenta-explantaten gekweekt onder hypoxische omstandigheden (modellering van één aspect van pre-eclampsie) de bloed-hersenbarrière verstoren bij niet-zwangere volwassen vrouwelijke muizen.
Abstract
Cerebrovasculaire complicaties, waaronder hersenoedeem en ischemische en hemorragische beroerte, vormen de belangrijkste oorzaak van moedersterfte geassocieerd met pre-eclampsie. De onderliggende mechanismen van deze cerebrovasculaire complicaties blijven onduidelijk. Ze zijn echter gekoppeld aan placentadisfunctie en verstoring van de bloed-hersenbarrière (BBB). Niettemin wordt het verband tussen deze twee verre organen nog steeds vastgesteld. Toenemend bewijs suggereert dat de placenta signaalmoleculen, waaronder extracellulaire blaasjes, afgeeft aan de maternale circulatie. Extracellulaire blaasjes worden gecategoriseerd op basis van hun grootte, waarbij kleine extracellulaire blaasjes (sEV's kleiner dan 200 nm in diameter) worden beschouwd als kritische signaaldeeltjes in zowel fysiologische als pathologische omstandigheden. Bij pre-eclampsie is er een verhoogd aantal circulerende sEV's in de maternale circulatie, waarvan de signaalfunctie niet goed wordt begrepen. Placenta-sEV's die vrijkomen bij pre-eclampsie of van normale zwangerschapsplacenta's die worden blootgesteld aan hypoxie, veroorzaken endotheeldisfunctie in de hersenen en verstoring van de BBB. In dit protocol beoordelen we of sEV's geïsoleerd uit placenta-explantaten gekweekt onder hypoxische omstandigheden (modellering van een aspect van pre-eclampsie) de BBB in vivo verstoren.
Introduction
Ongeveer 70% van de maternale sterfte als gevolg van pre-eclampsie, een hypertensief zwangerschapssyndroom dat wordt gekenmerkt door verminderde placentatieprocessen, maternale systemische endotheeldisfunctie en, in ernstige gevallen, multi-orgaanfalen 1,2, wordt geassocieerd met acute cerebrovasculaire complicaties 3,4. De meeste moedersterfte komt voor in lage- en middeninkomenslanden5. De onderliggende mechanismen zijn echter nog steeds onduidelijk, ondanks de klinische en epidemiologische relevantie van cerebrovasculaire complicaties geassocieerd met pre-eclampsie.
Aan de andere kant zijn extracellulaire vesikels (EV's) (diameter ~30-400 nm) essentiële mediatoren van intercellulaire communicatie tussen weefsels en organen,inclusief maternale en placenta-interactie6. Naast eiwitten en lipiden op het uitwendige oppervlak, vervoeren EV's lading naar binnen (eiwitten, RNA en lipiden). EV's kunnen worden onderverdeeld in (1) exosomen (diameter ~50-150 nm, ook wel kleine EV's (sEV's) genoemd), (2) middelgrote/grote EV's en (3) apoptotische lichamen, die verschillen in grootte, biogenese, inhoud en potentiële signaalfunctie. De samenstelling van EV's wordt bepaald door de cellen waaruit ze afkomstig zijn en het ziektetype7. Syncytiotrofoblast-afgeleide EV's brengen placenta alkalische fosfatase (PLAP)8,9 tot expressie, die van placentae afgeleide circulerende kleine EV's (PDsEV's) tijdens de zwangerschap detecteert. PLAP helpt ook bij het onderscheiden van veranderingen in de lading van de PD'sEV's en hun effecten bij pre-eclampsie versus normotensieve zwangerschappen 10,11,12,13,14,15.
De placenta is erkend als de noodzakelijke component in de pathofysiologie van pre-eclampsie16 of cerebrale complicaties geassocieerd met deze ziekte 17,18,19. Het is echter onbekend hoe dit verre orgaan veranderingen in de hersencirculatie kan veroorzaken. Aangezien sEV's een cruciale rol spelen in cel-tot-celcommunicatie vanwege hun vermogen om bioactieve componenten over te dragen van donor- naar ontvangercellen 6,20,21, heeft een groeiend aantal onderzoeken placenta-sEV's in verband gebracht met het ontstaan van maternale endotheeldisfunctie 21,22,23,24, inclusief endotheelcellen in de hersenen 25,26bij vrouwen met pre-eclampsie. Het compromitteren van de endotheelfunctie van de hersenen kan dus leiden tot verstoring van de bloed-hersenbarrière (BBB), een cruciaal onderdeel bij cerebrovasculaire complicaties geassocieerd met pre-eclampsie3,27.
Niettemin meldden preklinische bevindingen met behulp van cerebrale vaten van ratten die waren blootgesteld aan serum van vrouwen met pre-eclampsie28 of menselijke endotheelcellen van de hersenen die waren blootgesteld aan plasma van vrouwen met pre-eclampsie29 dat circulerende factor(en) verstoring van de BBB veroorzaken. Ondanks verschillende kandidaten met het potentieel om de BBB te schaden die aanwezig is in de maternale circulatie tijdens pre-eclampsie, zoals verhoogde niveaus van pro-inflammatoire cytokines (d.w.z. tumornecrosefactor)18,28 of vasculaire regulatoren (d.w.z. vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF))29,30,31, of oxidatieve moleculen zoals geoxideerde lipoproteïnen (oxo-LDL)32,33, onder andere 34, geen van hen brengt een directe verbinding tot stand tussen de placenta en de BBB. Onlangs hebben sEV's geïsoleerd uit hypoxische placenta's aangetoond dat ze de BBB kunnen verstoren bij niet-zwangere vrouwelijke muizen25. Aangezien placenta-sEV's de meeste van de genoemde circulerende factoren kunnen dragen met het vermogen om de BBB te verstoren, worden sEV's beschouwd als geschikte kandidaten om de gewonde placenta te verbinden, de drager te zijn van schadelijke circulerende factoren en de BBB te verstoren bij pre-eclampsie.
Dit protocol stelt ons in staat om te onderzoeken of sEV's geïsoleerd uit placenta-explantaten gekweekt onder hypoxische omstandigheden de BBB kunnen verstoren bij niet-zwangere vrouwelijke muizen als een proxy voor het begrijpen van de pathofysiologie van cerebrale complicaties tijdens pre-eclampsie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het onderzoek werd uitgevoerd volgens de principes die zijn verwoord in de Verklaring van Helsinki en met toestemming van de respectieve ethische beoordelingscommissies. Alle menselijke deelnemers gaven hun geïnformeerde toestemming vóór het verzamelen van monsters, zoals eerder gerapporteerd25. Bovendien keurde de Commissie Bio-ethiek en Bioveiligheid van de Universiteit van Bío-Bío dit project goed (Fondecyt-subsidie 1200250). Het dierwerk werd uitgevoerd in overeenstemming met de kardinale principes van de drie R's in het gebruik van dieren in experimenten35, en volgens de aanbevelingen van de richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren gepubliceerd door het Amerikaanse National Institute of Health. De dieren werden in geschikte omgevingen gehouden in het Vivarium van de Universiteit van Bío-Bío. Verse placenta's (n = 4) werden binnen 1 uur na een electieve keizersnede verkregen van moeders (leeftijd 28-31 jaar) met een normale zwangerschap op termijn (38 tot 41 weken zwangerschap). Keizersneden werden uitgevoerd in het Herminda Martin Clinical Hospital, Chillan, Chili, zoals eerder gemeld25. Om het in vivo model toe te passen, werden 4-6 maanden oude vrouwelijke niet-zwangere muizen (stam C57BLACK/6) gebruikt. Ze werden verdeeld in drie experimentele groepen: (1) controle (zonder behandeling), (2) behandeld met sEV's van normoxie (sEVs-Nor), en (3) behandeld met sEV's van hypoxische gekweekte placenta's (sEVs-Hyp), die werden gebruikt om de verstoring van de BBB in vivote evalueren 25. Alle geïnjecteerde oplossingen waren steriel. Ook werd de bereiding van sEV's uitgevoerd in aseptische omstandigheden en onder een klasse II bioveiligheidskap om besmetting te voorkomen.
1. Placentacultuur explanteert
- Om explantaten van normale zwangerschapsplacenta's te extraheren, raadpleegt u de methode gepubliceerd door Miller et al. 200536.
- Verwijder voorzichtig de stolsels van de basale plaat van de menselijke placenta met behulp van een gesteriliseerde pincet. Extraheer kleine explantaten om een uiteindelijke weefselextractie van 10 g te verkrijgen.
- Zorg ervoor dat placenta-explantaten worden verwijderd uit de vier kwadranten van het maternale deel van de placenta. Zorg ervoor dat gedevitaliseerd weefsel en verkalkte gebieden worden uitgesloten.
- Om placentaweefsel te manipuleren, doet u dit op ijs, onder steriele omstandigheden en in een bioveiligheidskast.
- Was de explantaten (minstens drie keer) met ruime hoeveelheden (vijf delen van de explantaten) koude (4 °C) fosfaatbufferoplossing (PBS 1x, pH 7,4) om zoveel mogelijk bloed te verwijderen. Centrifugeer (252 x g gedurende 10 min) op kamertemperatuur tussen wasbeurten.
- Resuspendeer 10 g gewassen explantaten in 20 ml kweekmedium aangevuld met 2% foetaal runderserum, 100 IE/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine (zie materiaaltabel).
- Doe de suspensie in een kweekschaal van 100 mm. Laat de explantaten 2 uur in een incubator bij 37 °C met 21% zuurstof en 5% CO2 staan.
- Was daarna de explantaten opnieuw met 1x PBS op 37 °C (drie keer). Centrifugeer (252 x g gedurende 10 min) op kamertemperatuur tussen wasbeurten.
- Resuspendeer het weefsel verder in 20 ml kweekmedium dat eerder is ontdaan van nanodeeltjes.
OPMERKING: Voer voor uitputting van nanodeeltjes ultracentrifugatie (120.000 x g gedurende 18 uur bij kamertemperatuur) en microfiltratie (0,22 μm filter) uit. - Verdeel de geresuspendeerde explantaten in twee kweekschalen (100 mm). Elk kweekschaaltje moet 10 ml geresuspendeerde explantaten bevatten.
- Plaats daarna een van de schalen met placenta-explantaten in standaardkweekomstandigheden (37 °C met 8% zuurstof en 5% CO2), terwijl u de andere in een hypoxische kamer met 1% O2 plaatst.
OPMERKING: (OPTIONEEL) Analyse van de levensvatbaarheid van weefsels kan worden uitgevoerd met behulp van dezelfde weefselextracties en 3-(4,5-dimethylthiazool-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromidetest (MTT-test) als elders beschreven37,38. Gebruik de totale eiwitconcentratie gemeten in de explantatiehomogenaten om de MTT-waarden te normaliseren. - Oogst na 18 uur in cultuur de geconditioneerde media van de explantaten in een nieuwe buis van 15 ml.
OPMERKING: Bij deze stap kunnen geconditioneerde media voor een langere periode (weken) worden ingevroren (-80 °C).
2. Isolatie van sEV's op basis van placenta
- Isoleer sEV's uit het geconditioneerde medium met behulp van het differentiële centrifugatie- en microfiltratieprotocol volgens eerder gepubliceerde rapporten25,39.
- Voer sequentiële centrifugatie uit voor het geoogste geconditioneerde medium. De opeenvolgende stappen van centrifugaties zijn (1) 300 x g gedurende 10 min, (2) 2000 x g gedurende 10 min, (3) 10.000 x g gedurende 30 min en (4) 120.000 x g gedurende 2 uur. Voer de centrifugaties op kamertemperatuur uit.
- Verzamel bij al deze centrifugaties met een pipet van 20-100 μl voorzichtig het supernatans en gooi de pellet weg.
- Als u klaar bent, haalt u het laatst opgevangen supernatans door een filter van 0,22 μm (zie Materiaaltabel). Voer vervolgens een extra centrifugatie uit bij 120.000 x g gedurende 18 uur bij kamertemperatuur.
- Gooi daarna het supernatans weg terwijl u de pellet (die placenta-sEV's bevat) resuspendeert in 500 μL PBS (pH 7,4) en opnieuw door een filter van 0,22 μm gaat. Voer ten slotte nog een laatste centrifugatie uit bij 120.000 x g gedurende 3 uur bij kamertemperatuur.
- Resuspendeer vervolgens de pellet (die placenta-sEV's bevat) in 500 μL PBS (pH 7,4, eerder verarmd door sEV's) en passeer deze door een filter van 0,22 μm.
- Label de monsters als voorraad sEV's-Normoxia (sEVs-Nor) of sEVs-Hypoxie (sEVs-Hyp).
OPMERKING: Bereid aliquots van 50-100 μL van de geïsoleerde sEV's voor op verdere experimenten. Kleine EV's kunnen voor een langere periode (maanden) bij -80 °C worden opgeslagen. - Karakteriseer de placenta-sEV's op grootte, aantal en sEVs-eiwitmarker, zoals eerder gerapporteerd25. De ideale gemiddelde deeltjesdiameter van sEV's is 50-150 nm.
OPMERKING: de karakterisering van sEV's omvat positieve detectie van CD63, Tsg101, Alix en HSP70 (d.w.z. om de sEV-populatie verrijkt met exosomen te karakteriseren). Gebruik PLAP ook als een marker van placenta-oorsprong25. - Meet de totale hoeveelheid eiwit in de sEVs-oplossing met behulp van de BCA-eiwittestkit volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Figuur 1 toont een overzicht van de placenta-explantatiecultuur en extracellulaire vesikelisolatie.
3. Muizen injectie
- Verdoof het dier in een anesthesie-inductiekamer met een isofluraanverdeling van 5% (zie Materiaaltabel). Controleer het niveau van anesthesie door in de teen te knijpen.
- Plaats de muis na ~40 s in het anesthesiesysteem met behulp van een gezichtsmasker en handhaaf een anesthesieniveau van 2% isofluraan.
- Plaats het dier vervolgens op een verwarmingsplatform (zie Materiaaltabel) bij een kamertemperatuur van 28 °C. Houd de ogen gesmeerd met kunsttranen.
- Verdun vóór de injectie placenta-sEV's (200 μg totaal eiwit) met fosfaatbuffer (pH, 7,4) tot een eindvolume van 70 μl.
- Desinfecteer het injectiegebied met 70% ethanol en wattenstaafjes. Zorg ervoor dat u een insulinespuit met een naald van 30 G gebruikt om de sEVs-oplossing te injecteren.
NOTITIE: De spuit kan gedurende 5 minuten op het verwarmingsplatform worden geplaatst om een fysiologische temperatuur te verkrijgen. - Injecteer vervolgens de oplossing in de uitwendige halsader. Deze stap vereist een speciale training.
OPMERKING: De procedure moet voorzichtig worden uitgevoerd, waarbij de naald langzaam wordt teruggetrokken en voorzichtig wordt opgezogen tot tekenen van bloedreflux. - Oefen na injectie lichte druk uit op het geïnjecteerde gebied gedurende ~15 s met een droog wattenstaafje. Breng daarna de dieren terug naar hun respectievelijke kooien.
- Zorg ervoor dat u het bewustzijn en het gedrag gedurende 15 minuten evalueert. Een indicator voor het bereiken van het bewustzijn is het herstel van de totale motorische activiteit bij dieren.
NOTITIE: Zorg voor een warme temperatuur in de kooien van het dier.
4. Snelle muizencoma- en gedragsschaal (RMCBS)
- Gebruik het KMCBS om de neurologische en welzijnsparameters van de dieren te evalueren40.
OPMERKING: RMCBS maakt een snelle evaluatie mogelijk (~ 3 min) met minimale stress bij de dieren als gevolg van tussenkomst van de operator. RMCBS heeft tien parameters (elke score is 0-2). - Evalueer het welzijn van muizen met de RMCBS-schaal na 0 uur (vóór het injecteren van sEV's) en 3 uur, 6 uur, 12 uur en 24 uur na injectie.
OPMERKING: Voer een analyse uit van claudine-5 (6 uur na injectie van sEV's) en Evan's blauwe extravasatie (24 uur na injectie van sEV's) om de verstoring van de BBB te evalueren (Figuur 2).
5. Analyse van Evan's blauwe extravasatie
- Na injectie van placenta-sEV's (24 uur) de muizen verdoven zoals beschreven in stap 3.1.
- Bereid Evan's Blue-oplossing (2%, verdund in fosfaatbufferoplossing, 1x) (zie materiaaltabel).
- Injecteer Evan's Blue-oplossing met behulp van retro-orbitale toegang25 in een dosis van 2 ml/kg.
- Laat Evan's blauwe oplossing 20 minuten circuleren onder narcose.
- Voer vervolgens intracardiale perfusie uit volgens eerder beschreven protocol41 met zoutoplossing (~3 ml, 0,9%, w/v) om Evan's blauwe kleurstof uit de bloedsomloop te verwijderen. Deze stap is verplicht.
OPMERKING: Verhoog voor deze procedure de anesthesie tot 5% en controleer een diep anesthesievlak (d.w.z. een drastische verlaging van de ademhalingsfrequentie). - Stel het hart bloot via mediale thoracotomie41 (Figuur 3).
- Fixeer daarna het hele dier met een intracardiale infusie van paraformaldehyde-oplossing (4% in PBS, v/v).
NOTITIE: Controleer de stijfheid van de staart om de juiste fixatie te controleren. - Verder, zodra de fixatie is voltooid, haalt u voorzichtig de hersenen eruit, weegt u ze en fotografeert u ze41. Maak foto's met het hele brein in de buurt van een liniaal42.
- Plaats vervolgens de hersenen in een hersenmuissnijder (zie Tabel met materialen).
- Ontleed de hersenen in negen secties, kraanvogel-caudaal, inclusief het cerebellum (100 μm per sectie).
- Visualiseer en leg na dissectie beelden van de hersenplakjes vast in een stereozoommicroscoop (zie Tabel met materialen).
- Gebruik de vastgelegde beelden om Evans blauwe extravasatie te kwantificeren met behulp van ImageJ-software (zie Tabel met materialen).
OPMERKING: Om de aanwezigheid van Evan's blauwe kleurstof te analyseren, stelt u Evan's blauwe waarden in met behulp van een positieve controle van het hersengedeelte (van een diercontroledier geïnjecteerd met kleurstof maar zonder intracardiale perfusie). De blauwe waarden van Evan die worden bereikt met positieve controle liggen over het algemeen tussen 75 en 110 in het intensiteitshistogram van het blauwe kanaal (Figuur 4). - Zorg ervoor dat hersenbeelden blindelings worden geanalyseerd door de betreffende experimentele groep om vooringenomenheid van de waarnemer te voorkomen. U kunt ook de blauwe extravasatie van Evan kwantificeren door middel van hersenhomogenisatie gevolgd door spectroscopie43.
OPMERKING: In afzonderlijke experimenten, met behulp van vers geïsoleerde hersenen van met sEV's geïnjecteerde muizen (6 uur), analyseer je de eiwitniveaus van claudine 5 (CLND-5) (zie Tabel met materialen), een kritische tight junction die betrokken is bij de dichtheid van de BBB44 (Figuur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol evalueert het vermogen van sEV's afkomstig van placenta's die zijn gekweekt in hypoxie om de BBB bij niet-zwangere muizen te verstoren. Deze methode stelt het mogelijk om de mogelijke verbinding tussen de placenta en de hersenen in normale en pathologische omstandigheden beter te begrijpen. In het bijzonder kan deze methode een proxy zijn voor het analyseren van de deelname van placenta-sEV's aan het ontstaan van cerebrale complicaties bij pre-eclampsie.
In tegenstelling tot muizen die zijn geïnjecteerd met sEVs-Nor, vertonen muizen die zijn geïnjecteerd met sEVs-Hyp een progressieve afname van de neurologische score tot 24 uur (tabel 1), wat suggereert dat het vermogen van sEVs-Hyp om de hersenfunctie te schaden suggereert.
Ook hebben muizenhersenen van de met sEVs-Hyp geïnjecteerde groep een hoger vers gewicht dan die geïsoleerd van muizen die zijn geïnjecteerd met sEVs-Nor of controlemuizen (respectievelijk 0,51 ± 0,008; 0,46 ± 0,008; 0,47 ± 0,01 g), wat een grove indicator van hersenoedeem kan vormen45.
Compatibel met deze bevinding, maakt dit protocol het mogelijk om Evan's blauwe extravasatie te identificeren als een indicator van verstoring van de BBB. In dat opzicht hebben hersenen van muizen die zijn geïnjecteerd met sEVs-Hyp een hogere Evan's blauwe extravasatie dan hersenen uit de sEVs-Nor-groep (Figuur 5A).
Hoewel het onderliggende mechanisme van verstoring van de BBB geïnduceerd door sEVs-Hyp niet met dit protocol werd geanalyseerd, geven de resultaten ook aan dat met sEVs-Hyp geïnjecteerde muizen verminderde eiwithoeveelheden CLND-5 vertoonden in de gebieden waarin de BBB het meest werd aangetast (d.w.z. posterieure gebieden) (Figuur 5B). Daarom is het mogelijk dat sEVs-hyp de expressie van de functie van dit kritische endotheliale tight junction-eiwit schaadt.
Figuur 1: Placenta-explantatiecultuur en extracellulair blaasjesisolatieprotocol. (A) Normale placenta-explantatieculturen. (B) Explantaten zijn verdeeld in twee voorwaarden voor de biogenese van kleine extracellulaire vesikels (sEV's) van de placenta. Normoxie (sEVs-Nor, 8% O2) of hypoxie (sEVs-Hyp, 1% O2) gedurende 18 uur. (C) Geconditioneerde media worden geoogst, gefilterd en gecentrifugeerd om celresten te verwijderen. (D) sEV's worden geïsoleerd door middel van ultracentrifugaties. (E) sEV's worden gekarakteriseerd met behulp van nano-tracking-analyse en western blot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: In vivo evaluatie van het protocol voor verstoring van de bloed-hersenbarrière. Niet-zwangere C57BL6/J-muizen, 4-6 maanden oud, worden gebruikt. (A) Via de uitwendige halsader kregen de dieren sEV's (200 μg totaal eiwit) geïsoleerd uit normoxische (sEVs-Nor, 8% O2) of hypoxische (sEVs-Hyp, 1% O2) placentaculturen. RMCBS wordt 0-24 uur na injectie gecontroleerd. (B) 6 uur na de injectie van sEV's worden de hersenen geëxtraheerd en in negen segmenten verdeeld voor eiwitextractie. Claudin 5 (CLDN5) wordt geanalyseerd in homogenaten van die negen secties. (C) Evan's blauwe extravasatieanalyse (24 uur na injectie van sEV's) werd geanalyseerd na retro-orbitale punctie-injectie in elk van de negen segmenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Fotodocumentaires van Evan's blauwe kleurstof en intracardiale perfusie protocol. (A) Muis kreeg Evan's blauw via retro-orbitale injectie. (Links) Dier voor en (rechts) na injectie (15 s) van Evan's blauwtje. (B) Thoracotomie om intracardiale perfusie van fosfaatbufferoplossing (1x PBS) en paraformaldehyde (4% PFA) uit te voeren. De linker hartkamer is puntig met de punt van de naald. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Analyse van Evan's blauwe extravasatie na injectie van sEV's. (A) Representatief beeld van het hele brein met Evan's blauwe extravasatie. De stippellijn vertegenwoordigt negen secties die uit de hele hersenen zijn verkregen. (B) Hersenen ontleed met behulp van een hersenmuizensnijder. (C) Representatieve beelden van hersenplakjes 24 uur na injectie van sEV's. Controle (CTL), placenta in normoxische (sEVs-Nor) of hypoxische omstandigheden (sEVs-Hyp). Schaalbalk = 0,4 cm. (D) Digitale omlijning van hersenplak met behulp van ImageJ. (E) Histogram in het blauwe kanaal. Waarden tussen 75-110 worden geassocieerd met Evan's blauwe extravasatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Evan's blauwe extravasatie en claudine-5 niveaus bij muizen geïnjecteerd met sEV's geïsoleerd uit placenta-explantaten. (A) Percentage van Evan's blauwe (EB) extravasatie rekening houdend met de hele hersensecties. Controle (CTL, blauw), placenta in normoxische (sEVs-Nor, rood) of hypoxische omstandigheden (sEVs-Hyp, groen). (B) Relatieve niveaus van claudine-5 (CLDN5) in de negen hersensecties werden verkregen uit de drie experimentele groepen. β-actine wordt gebruikt als laadregeling. De waarden zijn gemiddelden ± interkwartielafstand. Elke stip vertegenwoordigt een individueel proefpersoon. *p < 0,05, **p < 0,005. p < 0,0001. p < 0,001; ANOVA-test gevolgd door Bonferroni post-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Tijd (h) | Beheersen | sEVs-Normoxia | sEV's-hypoxie | ANOVA |
| 0 | 18,75 ± 0,250 | 18,5 ± 0,288 | 18,75 ± 0,250 | Ns |
| 3 | 18,5 ± 0,866 | 17 ± 0,707 | 13.25 ± 1.750*α | 0.006 |
| 6 | 19,25 ± 0,750 | 17 ± 0,577 | 11.75 ± 1.250*α | 0.002 |
| 12 | 18,5 ± 0,645 | 16.75 ± 1.109 | 13 ± 0.816*α | 0.001 |
| 24 | 19,5 ± 0,288 | 17,75 ± 0,250 | 10.25 ± 0.853*α | <0,0001 |
| *P < 0,01 versus controle. αp < 0,01 versus sEV's-Normoxia | ||||
Tabel 1: Snelle muizencoma- en gedragsschaal (RMCBS) na 24 uur na injectie van sEV's. De score wordt uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. De scores van dieren die het dichtst bij 20 liggen, zijn standaard, terwijl hoe lager de score, hoe hoger de disfunctie van het CZS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze studie onthult nieuwe inzichten in mogelijke schade als gevolg van sEV's geïsoleerd uit placenta-explantaten gekweekt in hypoxische omstandigheden op de verstoring van de bloed-hersenbarrière van knaagdieren. Het pathologische mechanisme omvat een vermindering van CLND-5 in het achterste hersengebied25.
Eerder onderzoek heeft aangetoond dat plasma-sEV's van personen met pre-eclampsie endotheeldisfunctie induceren in verschillende organen met behulp van in vitro modellen46,47. Dit onderzoek onderzocht met name de bloed-hersenbarrière en bood een nieuw perspectief op sEV's geïsoleerd uit hypoxie-gekweekte placenta, die deze vitale barrière verstoort. Deze ontdekkingen introduceren een nieuw onderzoeksgebied waarin sEV's kunnen dienen als een communicatiekanaal tussen de placenta en de hersenen in zowel normale als pathologische scenario's, zoals pre-eclampsie.
Het gepresenteerde protocol is eenvoudig, maar verschillende kritieke stappen verdienen vermelding. Dit protocol vereist verse placenta's binnen 1 uur na de bevalling. We raden ook af om de kweekperiode langer dan 24 uur te verlengen om weefselafbraak te voorkomen. Dit protocol vermindert mogelijke besmetting door sEV's geproduceerd door placenta's van muizen. Digitale analyse van Evan's blauwe extravasatie is tijdsintensief. Bovendien is de blauwe kleuring van Evan minder opvallend na een hersensectie. Daarom wordt een eerste instelling voor het identificeren van het blauwe bereik met behulp van een positieve controle aanbevolen. Een negatieve controle, zoals een brein van een muis die niet is onderworpen aan de blauwe injectie van Evan, kan ook worden gebruikt. Blinde analyse van experimentele groepen is absoluut noodzakelijk om mogelijke vooringenomenheid van waarnemers te voorkomen.
Tijdens dit protocol kunnen zich verschillende uitdagingen voordoen. Een belangrijke beperking ligt in de biologische variabiliteit die afkomstig is van zowel menselijke placenta's als geïnjecteerde muizen. Om de reproduceerbaarheid van Evan's blauwe extravasatie-experimenten te garanderen, wordt voorgesteld om sEV-doses vast te stellen die zijn geïsoleerd uit menselijke placenta's. We hebben gekozen voor een dosis van 200 μg totaal eiwit; deze hoeveelheid kan echter fluctueren op basis van de zuiverheid van blaasjes, de werkzaamheid van halsinjectie, de blauwe toediening van Evan, de klaring ervan uit de bloedsomloop en, niet in de laatste plaats, de biologische impact van sEV's gezien hun inhoud.
De cellulaire mechanismen waarmee sEV's van de menselijke placenta de bloed-hersenbarrière kunnen verstoren, vereisen aanvullende experimenten. Desalniettemin is deze methode relevant, wat wijst op mogelijke communicatie tussen de placenta en de hersenen, wat verder onderzoek rechtvaardigt. Daarom worden toekomstige onderzoeken aangemoedigd, waarbij de nadruk ligt op sEV's en hun interacties met de bloed-hersenbarrière, evenals de impact van hun lading op neuronale weefsels. Of een stoornis van de bloed-hersenbarrière leidt tot blijvende gevolgen voor de hersenen van de moeder, verdient verder onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflict te melden.
Acknowledgments
De auteurs willen de onderzoekers van GRIVAS Health bedanken voor hun waardevolle input. Ook verloskundigen en klinisch personeel van de dienst Verloskunde en Gynaecologie behoren tot het Hospital de Chillan, Chili. Opgericht door Fondecyt Regular 1200250.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult mice brain slecer matrice 3D printed | Open access file | Adult mice | Adult mice brain slicer. Printed in PLA filament. |
| Anti β-Actin primary antibody | Sigma-Aldrich | Clon AC-74 | Antibody for loading control (Western blot) |
| Anti-Claudin5 primary antibody | Santa cruz Biotechnology | sc-374221 | Primary antibody for tight junction protein CLDN5 of mice BBB (Western blot) |
| BCA protein kit | Thermo Scientific | 23225 | Kit for measuring protein concentration |
| Culture media #200 500 mL | Thermo Fisher Scientific | m200500 | Culture media for placental explants |
| D180 CO2 incubator | RWD Life science | D180 | Standard incubator to estabilize explants and culture sEVs-Nor |
| Evans blue dye > 75% 10 g | Sigma-Aldrich | E2129.10G | Dye to analize blood brain barrier disruption IN VIVO |
| Fetal bovine serum 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Additive growth factor for culture media 200 |
| Himac Ultracentrifuge CP100NX | Himac eppendorf group | 5720410101 | Ultracentrifuge for condicioned media > 1,20,000 x g |
| ImageJ software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Isoflurane x 100 mL | USP Baxter | 212-094 | Volatile inhalated anaesthesia agent for mice |
| Kit CellTiter 96 Non-radioactive | Promega | 0000105232 | In vitro assay for placental explants viability |
| Mouse IgG Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | MO 63103 | Secondary antibody for CLDN5 (western blot) |
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | 90278090 | Nanotracking analysis of particles from placental explants condicioned media |
| Paraformaldehide E 97% solution 500 mL | Thermo Fisher Scientific | A11313.22 | Fixative solution for brain tissue slices and intracardial perfusion (once diluted) |
| PBS 1 X pH 7.4 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Wash solution for placenta explants |
| Peniciline-streptomicine 100x 20 mL | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | Antiobiotics for placental explants culture media |
| ProOX C21 Cytocentric O2 and CO2 Subchamber Controller | BioSpherix | SCR_021131 | CO2 regulator to induce Hypoxia in sealed chamber for sEVs-Hyp |
| Sodium Thiopental 1 g | Chemie | 7061 | humanitarian euthanasia agent |
| Somnosuite low flow anesthesia system | Kent Scientifics | SS-01 | Isoflurane vaporizer for small rodents |
| Surgical Warming platform | Kent Scientifics | A41166 | Warming platform for mainteinance anesthesia in mice |
| Syringe Filters, Polytetrafluoroethylene (PTFE), Hydrophobic, 0.22 µm, Sterile, 25 mm | Southern labware | 10026 | Filtration of condicioned media harvested from placental explants |
| Tabletop High-Speed Micro Centrifuges HITACHI himac CT15E/CT15RE | Hitachi medical systems | 6020 | Serial centrifugations of condicioned media < 1,20, 000 x g |
| Trinocular stereomicroscope transmided and reflective light 10x-160x | Center Medical | 2597 | Stereomicroscope to register brain slices |
References
- Lisonkova, S., Joseph, K. S. Incidence of preeclampsia: risk factors and outcomes associated with early- versus late-onset disease. Am J Obstet Gynecol. 209 (544), 544.e1-544.e12 (2013).
- Sibai, B., Dekker, G., Kupferminc, M.
- Hammer, E. S., Cipolla, M. J.
- Okanloma, K. A., Moodley, J. Neurological complications associated with the preeclampsia/eclampsia syndrome. Int J Gynaecol Obstet. 71, 223-225 (2000).
- Frias, A. E., Belfort, M. A. Post magpie: how should we be managing severe preeclampsia. Curr Opin Gynecol Obstet. 15 (6), 489-495 (2003).
- Familari, M., Cronqvist, T., Masoumi, Z., Hansson, S. R. Placenta-derived extracellular vesicles: Their cargo and possible functions. Reprod Fertil Dev. 29 (3), 433-447 (2017).
- Montoro-Garcia, S., Shantsila, E., Marin, F., Blann, A., Lip, G. Y. Circulating microparticles: new insights into the biochemical basis of microparticle release and activity. Basic Res Cardiol. 106, 911-923 (2011).
- Germain, S. J., Sacks, G. P., Sooranna, S. R., Sargent, I. L., Redman, C. W. Systemic inflammatory priming in normal pregnancy and preeclampsia: the role of circulating syncytiotrophoblast microparticles. J Immunol. 178 (9), 5949-5956 (2007).
- Tannetta, D., Masliukaite, I., Vatish, M., Redman, C., Sargent, I. Update of syncytiotrophoblast derived extracellular vesicles in normal pregnancy and preeclampsia. J Reprod Immunol. 119, 98-106 (2017).
- Collett, G. P., Redman, C. W., Sargent, I. L., Vatish, M. Endoplasmic reticulum stress stimulates the release of extracellular vesicles carrying danger-associated molecular pattern (DAMP) molecules. Oncotarget. 9 (6), 6707-6717 (2018).
- Cooke, W. R., et al. Maternal circulating syncytiotrophoblast-derived extracellular vesicles contain biologically active 5'-tRNA halves. Biochem Biophys Res Commun. 518 (1), 107-113 (2019).
- Gill, M., et al. Placental syncytiotrophoblast-derived extracellular vesicles carry active nep (neprilysin) and are increased in preeclampsia. Hypertension. 73 (5), 1112-1119 (2019).
- Kandzija, N., et al. Placental extracellular vesicles express active dipeptidyl peptidase IV; levels are increased in gestational diabetes mellitus. J Extracell Vesicles. 8 (1), 1617000 (2019).
- Motta-Mejia, C., et al. Placental vesicles carry active endothelial nitric oxide synthase and their activity is reduced in preeclampsia. Hypertension. 70 (2), 372-381 (2017).
- Sammar, M., et al. Reduced placental protein 13 (PP13) in placental derived syncytiotrophoblast extracellular vesicles in preeclampsia - A novel tool to study the impaired cargo transmission of the placenta to the maternal organs. Placenta. 66, 17-25 (2018).
- Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy. Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).
- Warrington, J. P., et al. Placental ischemia in pregnant rats impairs cerebral blood flow autoregulation and increases blood-brain barrier permeability. Physiological Reports. 2 (8), e12134-e12134 (2014).
- Warrington, J. P., Drummond, H. A., Granger, J. P., Ryan, M. J. Placental Ischemia-induced increases in brain water content and cerebrovascular permeability: Role of TNFα. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 309 (11), R1425-R1431 (2015).
- Johnson, A. C., et al. Magnesium sulfate treatment reverses seizure susceptibility and decreases neuroinflammation in a rat model of severe preeclampsia. PLoS ONE. 9 (11), e113670 (2014).
- Escudero, C. A., et al. Role of extracellular vesicles and microRNAs on dysfunctional angiogenesis during preeclamptic pregnancies. Front Physiol. 7, 1-17 (2016).
- Salomon, C., et al. Placental exosomes as early biomarker of preeclampsia: Potential role of exosomalmicrornas across gestation. J Clin Endocrinol Metab. 102 (9), 3182-3194 (2017).
- Knight, M., Redman, C. W., Linton, E. A., Sargent, I. L. Shedding of syncytiotrophoblast microvilli into the maternal circulation in pre-eclamptic pregnancies. Br J Obstet Gynaecol. 105 (6), 632-640 (1998).
- Gilani, S. I., Weissgerber, T. L., Garovic, V. D., Jayachandran, M.
- Dutta, S., et al. Hypoxia-induced small extracellular vesicle proteins regulate proinflammatory cytokines and systemic blood pressure in pregnant rats. Clin Sci (Lond). 134 (6), 593-607 (2020).
- Leon, J., et al. Disruption of the blood-brain barrier by extracellular vesicles from preeclampsia plasma and hypoxic placentae: attenuation by magnesium sulfate. Hypertension. 78 (5), 1423-1433 (2021).
- Han, C., et al. Placenta-derived extracellular vesicles induce preeclampsia in mouse models. Haematologica. 105 (6), 1686-1694 (2020).
- Amburgey, O. A., Chapman, A. C., May, V., Bernstein, I. M., Cipolla, M. J. Plasma from preeclamptic women increases blood-brain barrier permeability: role of vascular endothelial growth factor signaling. Hypertension. 56 (5), 1003-1008 (2010).
- Cipolla, M. J., et al. Pregnant serum induces neuroinflammation and seizure activity via TNFalpha. Exp Neurol. 234 (2), 398-404 (2012).
- Bergman, L., et al. Preeclampsia and increased permeability over the blood brain barrier - a role of vascular endothelial growth receptor 2. Am J Hypertens. 34 (1), 73-81 (2021).
- Torres-Vergara, P., et al. Dysregulation of vascular endothelial growth factor receptor 2 phosphorylation is associated with disruption of the blood-brain barrier and brain endothelial cell apoptosis induced by plasma from women with preeclampsia. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1868 (9), 166451 (2022).
- Schreurs, M. P., Houston, E. M., May, V., Cipolla, M. J. The adaptation of the blood-brain barrier to vascular endothelial growth factor and placental growth factor during pregnancy. FASEB J. 26 (1), 355-362 (2012).
- Schreurs, M. P., Cipolla, M. J. Cerebrovascular dysfunction and blood-brain barrier permeability induced by oxidized LDL are prevented by apocynin and magnesium sulfate in female rats. J Cardiovasc Pharmacol. 63 (1), 33-39 (2014).
- Schreurs, M. P. H., et al. Increased oxidized low-density lipoprotein causes blood-brain barrier disruption in early-onset preeclampsia through LOX-1. FASEB J. 27 (3), 1254-1263 (2013).
- Escudero, C., et al. Brain vascular dysfunction in mothers and their children exposed to preeclampsia. Hypertension. 80 (2), 242-256 (2023).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. Universities Federation of Animal Welfare. , https://awionline.org/lab-animal-search/russell-w-m-s-burch-r-l-1959-principles-humane-experimental-technique-methuen-co (1959).
- Miller, R. K., et al. Human placental explants in culture: approaches and assessments. Placenta. 26 (6), 439-448 (2005).
- Troncoso, F. A. J., Herlitz, K., Ruiz, F., Bertoglia, P., Escudero, C. Elevated pro-angiogenic phenotype in feto-placental tissue from gestational diabetes mellitus. Placenta. 36 (4), 2 (2015).
- Zhang, H. C., et al. Microvesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells stimulated by hypoxia promote angiogenesis both in vitro and in vivo. Stem Cells Dev. 21 (18), 3289-3297 (2012).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit 3), 22 (2006).
- Carroll, R. W., et al. A rapid murine coma and behavior scale for quantitative assessment of murine cerebral malaria. PLoS One. 5 (10), e13124 (2010).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 11 (5), e3988 (2021).
- Walchli, T., et al. Quantitative assessment of angiogenesis, perfused blood vessels and endothelial tip cells in the postnatal mouse brain. Nat Protoc. 10 (1), 53-74 (2015).
- Wang, H. L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, 6588 (2014).
- Morita, K., Sasaki, H., Furuse, M., Tsukita, S. Endothelial claudin: claudin-5/TMVCF constitutes tight junction strands in endothelial cells. J Cell Biol. 147 (1), 185-194 (1999).
- Lara, E., et al. Abnormal cerebral microvascular perfusion and reactivity in female offspring of reduced uterine perfusion pressure (RUPP) mice model. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (12), 2318-2332 (2022).
- Chang, X., et al. Exosomes from women with preeclampsia induced vascular dysfunction by delivering sflt (soluble fms-like tyrosine kinase)-1 and seng (soluble endoglin) to endothelial cells. Hypertension. 72, 1381-1390 (2018).
- Smarason, A. K., Sargent, I. L., Starkey, P. M., Redman, C. W. The effect of placental syncytiotrophoblast microvillous membranes from normal and pre-eclamptic women on the growth of endothelial cells in vitro. BJOG. 100 (10), 943-949 (1993).
