Summary
噬菌体（噬菌体）是感染细菌的病毒，是肠道微生物组的一个组成部分。尽管这些共生居民驱动细菌适应性和种群动态，但人们对它们如何影响肠道稳态和疾病知之甚少。该方案研究小鼠模型中分离的T4噬菌体，适应其他噬菌体 - 细菌对。
Abstract
噬菌体（噬菌体）是以物种和菌株水平特异性感染细菌的病毒，是所有已知生态系统中最丰富的生物实体。在细菌群落中，例如在肠道微生物群中发现的细菌群落中，噬菌体与调节微生物群群动态和驱动细菌进化有关。在过去十年中，人们对噬菌体研究重新产生了兴趣，部分原因是裂解噬菌体的宿主特异性杀伤能力，这为对抗日益增长的抗菌素耐药细菌威胁提供了一种有前途的工具。此外，最近的研究表明噬菌体粘附在肠道粘液上，这表明它们可能在防止细菌入侵底层上皮细胞方面具有保护作用。重要的是，与细菌微生物组一样，被破坏的相体组与炎症性肠病等疾病的恶化结果有关。先前的研究表明，噬菌体可以通过粪便滤液移植调节动物和人类的微生物组，有益于宿主的健康。随着最近的研究浪潮，有必要建立和标准化在肠道微生物组背景下研究噬菌体的方案。 该协议提供了一套程序，用于在小鼠胃肠道的背景下研究分离的T4噬菌体及其细菌宿主大肠杆菌。这里描述的方法概述了如何从噬菌体裂解物开始，将其施用于小鼠并评估对细菌宿主和噬菌体水平的影响。该方案可以修改并应用于其他噬菌体 - 细菌对，并为研究体内宿主 - 噬菌体动力学提供了起点。
Introduction
噬菌体或噬菌体是感染和杀死细菌的病毒，具有物种和菌株水平的特异性1。噬菌体在复杂的细菌群落（如肠道微生物群）中发挥着重要作用，它们与调节种群动态和驱动细菌适应性有关2。在过去十年中，由于抗菌素耐药病原体3的兴起，以及噬菌体疗法作为替代治疗策略的潜力，人们对噬菌体研究重新产生了兴趣。近年来，裂解噬菌体混合物已静脉注射，在人类严重的抗生素耐药细菌性败血症感染中取得了一些成功 3,4。口服噬菌体疗法也被提议作为抗生素的潜在替代品，以治疗肠道感染和炎症。此外，噬菌体还与粪便滤液移植 （FFT） 的成功有关，FFT 是经过过滤以去除细菌的粪便微生物群制剂，用于治疗复发性艰难梭菌感染 （rCDI）5,6、炎症性肠病 （IBD）7,8 和早产猪坏死性小肠结肠炎9.鉴于这些结果，重要的是要考虑噬菌体与肠道微生物群以及噬菌体与哺乳动物宿主之间的相互作用，因为将新型噬菌体添加到预先存在的群落中可能会对整个群落产生间接影响，而不仅仅是其目标细菌2,10。
体外噬菌体与其靶细菌相互作用的研究已被证明有助于了解肠道中噬菌体和细菌相互作用的机制和影响。在这种情况下，已经表明 Caudovirales 目的大肠杆菌特异性 T4 噬菌体需要位于病毒粒子表面高度抗原外衣壳 （Hoc） 蛋白内的免疫球蛋白 （Ig） 样结构域才能粘附在肠粘液上 11。此外，transwell 试验表明，T4 噬菌体能够与上皮细胞培养物相互作用，并通过巨胞饮作用通过细胞层易位12,13。这些结果支持噬菌体可以与后生宿主相互作用的假设，即使它们无法感染真核细胞。这些模型虽然有用，但缺乏肠道生态系统中发生的全部复杂相互作用，而这些相互作用是全面探索噬菌体、细菌和后生动物宿主之间的三方相互作用所必需的。
小鼠模型是研究复杂环境中噬菌体的重要工具。噬菌体给药的理想应用是作为治疗抗微生物药物耐药性感染或与慢性炎症性疾病（包括 IBD）相关的病原体的替代策略。然而，新兴文献表明，噬菌体在体外的行为并不能完全代表体内功能。Buttimer等人14证明，噬菌体混合物能够在体外耗尽简化的人类微生物群联盟中的靶细菌，但不能在用相同细菌-噬菌体联盟定植的灵知小鼠中在体内复制。此外，在常规小鼠微生物组中，T7噬菌体导致其靶肠道细菌的选择性耗竭，尽管随着时间的推移观察到逐渐恢复，表明进化了耐药性15。其他研究表明，口服噬菌体及其靶细菌菌株在体内共存 2,16。事实上，除了噬菌体/细菌共存之外，噬菌体给药还导致了整体微生物群落组成和功能的广泛变化2,16。这在疾病环境中是相关的，因为一些研究发现，Caudovirales 的相对丰度增加与 IBD7、8、17 之间的关联与细菌丰度的变化无关7。目前尚不清楚这是疾病发病机制的驱动因素还是结果。
噬菌体研究的历史焦点一直是围绕噬菌体与其靶细菌之间的关系。然而，考虑噬菌体与后生动物宿主的粘膜、上皮和免疫系统之间的潜在相互作用也很重要。这些相互作用在肠道噬菌体感染的整体反应中都起着重要作用。为了证明这一点，已经使用无菌 （GF） 小鼠研究了噬菌体，以阐明它们在不受微生物群干扰的情况下对免疫系统的影响8。在该系统中，噬菌体核酸由位于吞噬细胞免疫细胞（巨噬细胞和树突状细胞）内体内体内的Toll样受体（TLR）检测。这激活了下游信号转导并刺激了 T 细胞依赖性干扰素 （IFN）-γ 8 或 I 型 IFN的产生 18。此外，Fluckiger等人19认为记忆CD8+ T细胞与噬菌体编码（噬菌体）抗原的识别有关，这导致T细胞与肿瘤抗原的交叉反应，从而降低肿瘤负荷。最后，噬菌体特异性抗体的产生已在小鼠研究中被记录在小鼠研究中，其中噬菌体通过饮用水以连续的方式递送至动物模型 8,20，或通过几个月的重复口服强饲20，证明了噬菌体蛋白促进体液免疫反应的能力。尽管这些噬菌体接种模式允许免疫系统的最佳和持续启动，但它们可能不代表噬菌体与肠道环境之间自然发生的相互作用，也不代表口服噬菌体疗法的动力学。到目前为止，有限数量的研究已经检查了噬菌体与单定植小鼠模型中单一细菌物种的相互作用21。然而，单定植小鼠被证明在破译单个物种对胃肠道 （GI） 和免疫发育的微生物特异性影响方面至关重要 22,23,24，并且它们可能被证明有助于理解噬菌体、其靶细菌和后生动物宿主之间的三方相互作用。
令人兴奋的是，关于肠道噬菌体和肠道共生细菌之间的相互作用，以及后生动物宿主与居住在其中的噬菌体之间发生的相互作用，还有很多东西需要了解。该方案提供了一组程序来研究分离的T4噬菌体及其细菌对应物大 肠杆菌 （K-12，BW25113），使用灵敏素小鼠模型。这些标准化程序还为优化其他噬菌体/细菌二元组奠定了基础，使生长参数适应感兴趣的对。本文概述的方法包括：（1）制备用于小鼠口服强饲的T4噬菌体和载体裂解物;（2） 大肠杆 菌单定植gnotobiotic小鼠口服T4噬菌体;（3）监测小鼠粪便和组织中T4噬菌体水平随时间的变化。
对于这里介绍的代表性结果，纯化的 T4 噬菌体裂解物是从 Rohwer 实验室维护的噬菌体库储备中繁殖的。如本方案所述，用于繁殖 T4 噬菌体的噬菌体方法进行了调整 25。该方法可在三天内产生高滴度、内毒素低的噬菌体原液。利用这种方法，常规收集 10 mL ≥10 10 个斑块形成单位 （pfu）/mL 的 T4 噬菌体，< 0.5 个内毒素单位 （EU）/mL。口服或静脉给药小鼠的推荐内毒素水平分别为 ≤ 20 EU/mL 和 ≤ 5 EU/kg/h（或 20 g 小鼠在 1 小时内施用 0.1 EU），使其成为 体内 接种的噬菌体制备的合适方法。所有噬菌体储备均储存在4°C盐水镁（SM）噬菌体缓冲液中（步骤1.1.5.1中提供的配方）。 大肠杆菌 在LB培养基中培养。对于各种噬菌体-细菌对，不同的培养基和生长条件可以从该方案中调整。噬菌体也可以来自环境，例如废水、海水、土壤和肠道内容物，并且可以在制备之前按照 Sambrook 和 Russell26 的规定进行分离和纯化，使用适当的生长和繁殖条件对每个噬菌体宿主对 25。或者，噬菌体可以从商业来源（见 材料表）或噬菌体库获得。
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Protocol
所有实验均按照UBC动物护理委员会和生物安全委员会批准的协议（A23-0113，B19-0038）制定的指南进行。小鼠被安置在不列颠哥伦比亚大学疾病建模中心的无病原体条件下。C57BL/6小鼠在无菌柔性薄膜隔离器中饲养，提供无菌小鼠饮食，水，垫料和筑巢材料。小鼠维持在12小时的昼夜循环中。实验小鼠，包括雄性和雌性，在每个实验中年龄匹配，年龄在6至12周之间，所有实验的体重为15-30克。
1.噬菌体和载体裂解物的制备，用于口服灌胃到小鼠体内
- 噬菌体纯化和原液生成
注意：在这项研究中，T4噬菌体通过使用单琼脂层方法接种到细菌草坪上来生长和滴度，如下所述。双琼脂层方法前面已经描述过25,27并且也可以以类似的功效使用。该方案选择了单琼脂层方法，因为它提供了更好的斑块可见性28.- 在无菌聚苯乙烯或玻璃培养管（带盖）中的 5 mL 无菌 LB 培养基中培养 大肠杆 菌。在37°C下孵育管，以200rpm振荡过夜，直到达到固定相。
- 在补充前，用0.5%琼脂高压灭菌LB并冷却至50°C或以下（同时保持液体），在玻璃培养基瓶中制备软琼脂。准备足够的软琼脂，每块板 15 mL。
- 用 MgSO4 和 CaCl2 补充软琼脂，使其最终浓度为 1 mM。每 3 mL 软琼脂加入 100 μL 过夜 大肠杆菌 培养物。使用磁力搅拌棒轻轻搅拌，使补充剂匀浆，并在软琼脂中培养。
注意：添加到软琼脂制剂中的大肠杆菌 体积和密度的一致性至关重要（在代表性结果部分中概述）。 - 使用血清移液管向每个培养皿（直径 15 cm）加入 15 mL 软琼脂 + 大肠杆 菌。让板在室温下凝固，以便当天使用。
注意： 板将在打开盖子的情况下在大约 20 分钟内凝固。琼脂将保持柔软，但当平板倒置时不会移动。 - 通过在SM缓冲液中稀释，以10的因子制备8-10次源T4噬菌体的连续稀释液。将每种稀释液的 5 μL 点在板上。让斑点干燥，倒置并在37°C下孵育板过夜。
- 为了制备盐水镁（SM）噬菌体缓冲液，在1L去离子H2O中，溶解100mM NaCl，8mM MgSO4·7H2O和50mM Tris-HCl（pH 7.4）。高压灭菌并在室温下储存。
注意：第二天，大肠杆菌应该在整个柔软的LB琼脂中长成草坪。噬菌体杀死受感染的大肠杆菌宿主的地方将出现斑块或清除的大肠杆菌草坪中可见的生长区域。每个斑块代表一个斑块形成单元 （pfu）。
- 为了制备盐水镁（SM）噬菌体缓冲液，在1L去离子H2O中，溶解100mM NaCl，8mM MgSO4·7H2O和50mM Tris-HCl（pH 7.4）。高压灭菌并在室温下储存。
- 通过将无菌移液器吸头推入斑块的中心，从软琼脂平板中挑选一个斑块，在吸头末端形成琼脂塞。将斑块塞重悬于1.7mL微量离心管中的1mL SM缓冲液中。以最大速度涡旋管 1 分钟进行混合。
- 在室温下以4000× g 离心管5分钟，以除去裂解物中的任何碎屑。将上清液转移到新的微量离心管中。
- 要繁殖分离的噬菌体，请重复步骤1.1.1-1.1.3。将 100 μL 分离的噬菌体加入 15 mL 等分试样中，加入含有 大肠杆菌的 15 mL 软琼脂中。将试管倒置三次，将琼脂混合并倒入培养皿中。
- 让板干燥，然后倒置并在37°C下孵育过夜。 准备一个没有噬菌体的草坪对照板，以确认 大肠杆菌 的活力。
注意：孵育过夜后，对照板应具有 大肠杆菌 草坪，而含噬菌体的板应完全裂解。 - 为了从板中提取噬菌体，将5mL SM缓冲液加入噬菌体清除板的表面，并在室温下在摇杆上以70rpm摇动15分钟。
- 将缓冲液从板收集到50mL锥形离心管中，并在室温下以4000× g 离心5分钟，以从琼脂平板中沉淀任何碎片。
- 将T4噬菌体原液裂解物收集到新管中，并在4°C下储存直至滴定和繁殖。
注意：T4噬菌体稳定超过10年25;然而，稳定性将取决于噬菌体的类型和储存条件。噬菌体滴度也会随储存时间而变化。噬菌体对冷冻很敏感。因此，建议在液氮中冷冻保存并避免冻融循环，因为这可能会损害噬菌体，降低噬菌体滴度25。 - 滴定T4噬菌体原液裂解物以确定pfu / mL的浓度，如前所述25,29,30。高滴度 T4 噬菌体原液将含有 108 pfu/mL 或更多。
- 实验噬菌体裂解物的制备
- 在无菌聚苯乙烯或玻璃培养管（带盖）中的 5 mL LB 培养基中培养 大肠杆 菌。将管在37°C下孵育过夜，以200rpm振荡，直至达到固定相。
- 在玻璃锥形瓶中的 100 mL LB 培养基中以 1：50 的比例传代培养过夜 的大肠杆菌 培养物。在37°C下孵育，以200rpm振荡，直到细菌达到指数期的早期至中期（约1.5小时）。
注意：可以执行初始生长曲线以确定细菌培养物处于指数阶段的600nm（OD600）范围内的光密度。建议在玻璃锥形管中培养，因为最近的证据表明噬菌体能够粘附在塑料上，例如聚丙烯31。 - 将步骤1.1中的100μL高滴度T4噬菌体原液加入 大肠杆菌 传代培养物中，并在37°C振荡孵育3小时，或直到新的裂解物不再浑浊。将T4噬菌体裂解物收集到50mL锥形管中，直接进行纯化步骤，或者如果需要，在4°C下储存至第二天。
注意：较大的噬菌体爆发大小（表明每个复制周期释放的平均病毒粒子数量更高）需要更长的孵育期，用于步骤1.2.2中的细菌传代培养。这在用噬菌体原液加标之前提供了增加的细菌密度。 - 在室温下以4000× g 离心裂解物20分钟，以沉淀任何残留的细菌和细胞碎片。使用 0.22 μm 尼龙过滤器对所得上清液进行过滤灭菌，并将滤液转移到新的 50 mL 锥形离心管中。
- 在每体积过滤的 T4 噬菌体裂解物中加入 0.1 体积的氯仿，以杀死任何残留的细菌并防止细菌生长。短暂涡旋混合并在室温下孵育 10 分钟。
注意：脂质包膜噬菌体对氯仿敏感，这可能会降低噬菌体滴度25。如果需要，请跳过此步骤。
注意：氯仿是一种有毒的有机溶剂，吸入、摄入或通过皮肤吸收时是危险的。使用氯仿时，请使用通风橱和适当的个人防护设备 （PPE）。使用氯仿时，使用玻璃代替聚苯乙烯血清移液器，因为它与大多数塑料不兼容。氯仿可以放置在聚丙烯锥形离心管中，用于步骤1.2.5-1.2.6，但不应长期储存在塑料管中。 - 在室温下以4000× g 离心裂解物5分钟，以将氯仿与裂解物分离。使用血清移液管小心地将顶部裂解物层转移到新的 50 mL 锥形管中，而不会干扰下面的氯仿层。将氯仿废物丢弃到适当的危险液体废物容器中。将裂解物储存在4°C，直至第二天浓缩和缓冲液交换。
- 通过将 13 mL 噬菌体裂解物加入设备的上部储液并以 4000 x g 离心 5 分钟，或直到大部分裂解物通过过滤器进入下部储液库，将噬菌体裂解物浓缩在 100 kDa 离心过滤装置（参见材料表）中。
注意：目标是在离心时间结束时获得大约 2 mL 的裂解物。随着裂解物的加入，过滤器中的噬菌体浓度增加，离心时间可能会增加。离心过滤装置具有物理止动装置，以防止它们干燥旋转 32.如果打算继续使用（即从上部储液罐中除去所有液体），请不要让滤膜变干。离心时间可能因噬菌体类型和滴度而异。 - 使用 P200 或 P1000 移液器，在每次旋转后，在上部储液槽内轻轻地上下移液 ~2 mL 裂解物，以疏通过滤膜。将滤液从下部储液罐丢弃到废物容器中，将浓缩的噬菌体留在上部储液罐中。
- 重复步骤1.2.7-1.2.8，直到整个体积的噬菌体裂解物通过过滤装置，每次旋转后将~2mL浓缩噬菌体保留在上部储液器中。
- 在最后一次旋转后，通过上下移液管中剩余的裂解物（~2mL）来疏通过滤膜。通过向上部储液槽中加入 12 mL SM 缓冲液并以 4000 x g 离心 10 分钟来洗涤噬菌体（缓冲液交换），或直到大部分缓冲液通过过滤器。
- 弃去滤液并重复洗涤步骤（步骤1.2.10）。将剩余的 2 mL 裂解物重悬于 SM 缓冲液中至最终体积为 10 mL（或更少），以便长期储存。将裂解物转移到50mL锥形离心管中，并在4°C下储存直至去除内毒素。
注意：在此阶段对噬菌体进行滴度是可选的，以确保噬菌体裂解物已浓缩（>10 8 pfu/mL），并确定内毒素去除过程中的噬菌体损失。 - 通过向裂解物总体积中加入0.4体积的1-辛醇（参见 材料表），从T4噬菌体裂解物中去除污染性内毒素。
注意：内毒素被去除，因为它们具有高度免疫刺激性，因此它们的存在可能导致诱导噬菌体非依赖性先天免疫反应25。
注意：1-辛醇是一种芳香族、有机、易燃化合物，气味强烈，对眼睛有刺激性。使用 1-辛醇时，请穿戴适当的 PPE。在通风橱中进行所有工作，以避免吸入蒸气。在通风柜外工作时，使用密封膜防止管子泄漏。 - 用密封膜密封锥形离心管的盖子，以防止泄漏。在室温下在平台或摇床上以120rpm振荡1小时，然后在4°C下孵育1.5小时，不振荡。
- 以4000× g 离心10分钟，将内毒素清除的裂解物与1-辛醇分离。1-辛醇层将漂浮在裂解物的顶部。使用 P1000 移液器小心地去除尽可能多的 1-辛醇，然后丢弃到适当的危险/易燃液体废物容器中。
- 使用 18 G 针头和 10 mL 注射器收集剩余 1-辛醇层下方的噬菌体裂解物，注意不要收集 1-辛醇层。将裂解物储存在4°C直至加速真空。
- 将 1 mL 等分试样的 T4 噬菌体裂解物转移到无菌的 1.5 mL 微量离心管中。在室温下以4000× g 打开盖子的真空速度，以蒸发裂解物中残留的1-辛醇。将真空速度加热3小时或直到噬菌体裂解物体积减少30%25。储存在4°C直至滴定。
- 滴定噬菌体裂解物以确定浓度（pfu/mL）。将SM缓冲液中所得的T4噬菌体裂解物稀释至所需浓度并重新滴定以确认。
- 根据制造商说明，使用显色内毒素定量试剂盒定量T4噬菌体裂解物中存在的内毒素（参见 材料表）。将最终噬菌体裂解物中的内毒素水平与去除内毒素前样品、载体对照、缓冲液和小鼠饮用水进行比较。
注意：显色内毒素定量试剂盒被 1-辛醇25 灭活。在定量内毒素之前，执行快速真空步骤以去除 1-辛醇（步骤 1.2.16）。蒸馏水的内毒素含量估计为 20 EU/mL25;然而，小鼠饮用水中的内毒素含量可能因设施而异。如果噬菌体裂解物中的内毒素水平超过饮用水中的含量，考虑重复内毒素去除步骤（1.2.12-1.2.16）。 - 将浓缩的内毒素清除的T4噬菌体裂解物储存在4°C的SM缓冲液中。
- 用于载体控制的无噬菌体细菌裂解物的制备
注意：可以制备无噬菌体裂解物作为载体，以控制由于步骤1.2中噬菌体裂解物生产过程中产生的细菌污染物（例如内毒素）引起的任何影响，当接种到小鼠中时，这可能会影响实验结果。- 从 大肠杆菌过夜培养物中，将 大肠杆菌 以 1：50 的比例传代到 100 mL LB 培养基中。在不添加噬菌体的情况下，在37°C下振荡3小时的同时继续培养细菌，或匹配步骤1.2中产生的噬菌体裂解物的孵育时间。
- 将 大肠杆菌 培养物转移到 50 mL 锥形管中，并使用超声探针（参见 材料表）在冰上以 30 kHz 进行 30 秒脉冲 （3x） 以手动裂解细菌细胞。
- 从步骤 1.2.4 开始，按照步骤 1.2 遵循协议的其余部分，包括所有清理、清洗和内毒素去除步骤。
注意：在使用离心过滤装置浓缩期间，由于没有噬菌体，载体裂解物将比噬菌体裂解物更快地流过过滤器。因此，将离心时间从5分钟缩短到2-5分钟，以确保超滤膜在长时间离心过程中不会变干。 - 滴定载体裂解物以确认其不含噬菌体。
- 按照制造商说明使用显色内毒素定量试剂盒测量载体裂解物中的内毒素水平。在SM缓冲液中稀释载体裂解物，以匹配噬菌体裂解物中的内毒素水平。
- 替代实验对照：热灭活噬菌体裂解物的制备
注意：无噬菌体裂解物的替代品是热灭活噬菌体裂解物。热灭活使噬菌体病毒粒子解离，而残留的内毒素如脂多糖 （LPS） 是热稳定的 8,33。Gogokhia等人[8]使用这种方法来确定免疫激活是否需要完整、活的噬菌体病毒粒子。鼓励研究人员测试这两种方法（无噬菌体与热灭活），并确定哪种对照最适合他们的实验需求。无论选择哪种方法，重要的是要承认缓冲液对照不太可能是合适的，因为浓缩和清理噬菌体储备需要大量操作。- 将步骤1.2（每只小鼠100μL）中所需体积的清洁，纯化和稀释的T4噬菌体裂解物转移到装有盖锁的无菌微量离心管中。
- 在95°C的加热块上加热裂解物15分钟16。
- 可选：如果需要去除噬菌体/细菌核酸，请按照 Jakočiūnė 和 Moodley34 进行 DNase I 和 RNase A 处理。简要：
- 将 50 μL DNase I 10x 缓冲液、1 μL DNase I （1 U/μL） 和 1 μL RNase A （10 mg/mL）（参见 材料表）加入 450 μL 热灭活噬菌体裂解物中。
- 将裂解物在37°C下在热块中孵育1.5小时，不要摇晃。
- 通过加入 20 μL 0.5 M 乙二胺四乙酸 （EDTA） 34 灭活 DNase I 和 RNase A。
- 将裂解物在室温下保持10分钟以冷却，如果使用多个试管，则合并裂解物。储存在4°C直至滴定。
- 进行噬菌体滴度以确认裂解物中不存在活的 T4 噬菌体。将热灭活的裂解物储存在4°C。
- 按照制造商的说明使用显色内毒素定量试剂盒测量热灭活裂解物中的内毒素水平。根据匹配的噬菌体裂解物中存在的内毒素水平稀释SM缓冲液中的热灭活裂解物。
2.大肠杆菌单定植小鼠T4噬菌体的给药和监测
- 大肠杆菌小鼠的单定植
- 通过培养从LB培养基中的单个菌落中挑选的大肠杆菌过夜，制备大肠杆菌以施用到GF小鼠8中。
- 在严格的无菌条件下35，通过口服强饲法将200μL大 肠杆 菌培养物施用于饲养在无菌乙烯基隔离器或生物排他性密封笼中的GF小鼠。如果使用耐气细菌，也可以通过在每只小鼠的背部施加200μL细菌培养物来定植小鼠。
注意：接种剂量将取决于菌株，因为不同的细菌表现出不同的pH存活能力36,37。Zucoloto 等人 35 建议每只动物接种 1 x 108 cfu。这里显示的代表性结果是从接种过夜培养物的小鼠中产生的（cfu未确定）。可以进行中试实验以确定导致目标小鼠品系可靠定植的剂量。通过口服强饲法施用的细菌体积可能会受到小鼠年龄和体重的影响。请查阅个人实验室或机构动物伦理协议，了解最大允许剂量。此处建议的体积基于小鼠体重的 10% 的管饲允许量（例如，20 g 小鼠的最大管饲量为 200 μL）。一些细菌物种不能忍受胃的酸度，也无法在肠道中定植。考虑首先用 100 μL 1 M NaHCO3 灌胃以中和胃酸2。如果使用严格的厌氧菌定植，则需要在厌氧条件下生长微生物，并在单独制备的气密容器（每只小鼠 1 个）中转移到 gnotobiotic 动物设施中。打开容器后，快速进行每次管饲，以限制因氧气暴露而导致的微生物活力损失。 - 监测小鼠的不良健康影响。
注意：如果对健康产生不利影响，请参阅相关动物护理机构制定的标准。可能的不良健康影响包括但不限于：（1）吸入管液：症状包括通过鼻子排出气泡、“张口”呼吸/喘息。（2）食道穿孔：症状包括健康状况迅速恶化、驼背、嗜睡，导致动物在24小时内死亡。 （3）反复管饲引起的食管发炎：症状包括插入管饲针困难。（4）由于微生物组改变引起的腹泻。 - 通过每周至少培养一次和/或通过 16S rRNA 测序35 确认粪便颗粒中的细菌定植。
注意：如果在灵活分离器中定植育种者以生产实验小鼠，请至少提前 9 周计划生成 6 周龄的第一代后代 （F1） 实验小鼠。或者，GF成年小鼠可以单定植。在这种方法中，建议在噬菌体接种前等待定植后 7 周，因为这是将复杂的微生物群引入 GF 小鼠38 后肠粘膜稳定所需的时间。
- 将T4噬菌体口服接种到 大肠杆菌 单定植小鼠中
- 将T4噬菌体裂解物和载体对照稀释至SM缓冲液中的预定浓度。根据 Hsu 等人 2，稀释噬菌体裂解物以允许每只小鼠施用 2 x 106 pfu2。
注意：根据噬菌体 在体内的稳定性，可以使用更高或更低浓度的噬菌体。每只小鼠 2 x 102、2 x 104 和 2 x 106 pfu 的 T4 噬菌体剂量导致肠道中稳定和长期定植，这似乎不是剂量依赖性的（如代表性结果部分所示）。因此，在进行大规模实验之前，应 在体内 试验噬菌体动力学。 - 在无菌的灵敏条件下，用100μL高压灭菌的1M NaHCO3 灌胃每只小鼠以中和胃酸。等待 10 分钟，然后用 100 μL T4 噬菌体裂解物或载体对照管饲。
- 监测小鼠的不良健康影响。
- 将T4噬菌体裂解物和载体对照稀释至SM缓冲液中的预定浓度。根据 Hsu 等人 2，稀释噬菌体裂解物以允许每只小鼠施用 2 x 106 pfu2。
3. 监测体内T4噬菌体水平
注意：一旦小鼠接种了噬菌体，就可以在粪便或组织样本中测量噬菌体和目标细菌的浓度。这提供了有关噬菌体感染动力学和两种生物体定植动力学的信息。
- 点接种T4噬菌体以确定粪便颗粒中的浓度
- 将每只小鼠的粪便沉淀收集到无菌，预称重的微量离心管中，以测量T4噬菌体和 大肠杆菌 水平。将试管存放在冰上直至电镀。
注意：在收集和电镀之间的过渡期间将样品放在冰上，以减缓耐气细菌的生长。在几个小时内，可能仍有需氧细菌的生长，或者由于氧气暴露而导致厌氧细菌死亡，这可能导致细菌计数偏斜。因此，细菌和噬菌体接种应在样品采集后尽快进行。专性厌氧菌不能耐受氧气暴露。为了保存样品，将样品收集到密封管中，并在收集后尽快将试管转移到厌氧室。如果在粪便样本中未检测到生长，请考虑使用16S rRNA qPCR等替代方法进行细菌定量。 - 记录每个试管的最终重量，并通过减去初始试管重量来计算样品重量。这将用于将 T4 噬菌体和 大肠杆菌 浓度归一化为样品重量（分别为 pfu/g 或 cfu/g）。
- 向每个试管中加入 1 mL 无菌 SM 缓冲液，并以最大速度（>1 分钟）彻底涡旋以匀浆粪便颗粒。如果样品小于 15 mg，则可以添加较小体积的 SM 缓冲液。记录添加到每个样品中的SM缓冲液的体积，以计算样品的cfu / g或pfu / g。
- 在180μLSM缓冲液中制备一系列8（或更多，取决于预期的噬菌体浓度）连续稀释20μL每个样品，系数为10。在加入第一个试管/孔之前，将每个均质样品短暂涡旋混合。移液器在每次添加之间混合，并在每次稀释之间更换吸头，以防止噬菌体或细菌计数因样品残留而膨胀。
注意：如果样品中存在的纤维和碎屑阻碍了移液，请向粪便浆液中添加额外的缓冲液以进一步稀释储备样品。 - 将每种稀释液的 5 μL 点样到含有 大肠杆菌 的 LB 软琼脂平板（用于噬菌体斑块测定）或 LB 琼脂平板（1.5% 琼脂，用于细菌菌落测定）上，以确定每个样品中的 T4 噬菌体和 大肠杆菌 浓度。为准确起见，请一式三份地发现每个样品。
注意：如果在 96 孔板中制备连续稀释液，则可以使用 8 通道 P20 多通道移液器将每列连续稀释的样品移液到板上。在每次稀释之间更换吸头，即使从最稀释到最浓缩，因为噬菌体可能粘附在移液器吸头的壁上并改变添加到每个新孔中的噬菌体量31。 - 让每个点干燥，然后将板倒置并将其放入培养箱中。在37°C孵育过夜。
- 对于每个样品，选择每个点有 3-30 个可计数斑块的稀释度。计数并记录现场的斑块数量和使用的稀释度。
- 通过将斑块数量除以每个点中铺板的体积来计算样品的 pfu/g，得到 pfu/μL。 将其乘以稀释因子和添加到每个样品中的 SM 缓冲液的体积，得到 pfu/样品。最后，除以样品重量得到 pfu/g30。
- 将每只小鼠的粪便沉淀收集到无菌，预称重的微量离心管中，以测量T4噬菌体和 大肠杆菌 水平。将试管存放在冰上直至电镀。
- 实验终点的组织取样
- 在每个选定的时间点，根据批准的机构动物伦理协议对小鼠实施安乐死，并将盲肠内容物、大小肠内容物以及任何感兴趣的组织收集到无菌、预称重的 2 mL 圆底微量离心管中。
- 记录每个试管的最终重量以计算样品重量。将组织和盲肠内容物储存在冰上，直到当天电镀。
- 向每个试管中加入无菌SM缓冲液并记录添加的体积。
- 对于盲肠和肠道内容物，按照步骤3.1.3彻底涡旋（>1分钟）。
- 对于组织样本，在每个试管中加入一个无菌金属珠。使用组织裂解器（参见 材料表）在20Hz下匀浆组织5分钟或直到组织解离并且悬浮液均匀。
注意：如果样品不能很好地匀浆，请考虑增加添加的SM缓冲液的体积，增加均质时间，或将均质频率提高到30Hz。组织匀浆器也可用于解离组织，同时允许细菌和噬菌体回收39,40。均质器的运行频率高于组织裂解器，同时保持细菌的完整性。 - 如步骤3.1.4-3.1.841所述，以10倍的倍数制备每个样品的连续稀释液，并进行点铺板以确定每个样品中的大肠杆菌和T4噬菌体浓度。
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Representative Results
为了研究小鼠肠道中T4噬菌体/大肠杆菌 二联体之间的相互作用，制备、净化和纯化T4噬菌体和载体裂解物（图1A）。通过斑块测定滴定T4噬菌体裂解物，并在SM缓冲液中稀释至2×107 pfu / mL（2 x 106 pfu /小鼠）。还滴定载体裂解物以确认不存在活噬菌体，并在与 T4 噬菌体裂解物相同体积的 SM 缓冲液中稀释。使用显色内毒素定量试剂盒对稀释裂解物中的内毒素水平进行定量。T4噬菌体、热灭活噬菌体和载体裂解物的内毒素水平低于饮用水的可接受水平（<20 EU/mL）25（图1B）。由于载体裂解物的内毒素含量与T4噬菌体裂解物相似，因此被认为是合适的对照。热灭活噬菌体裂解物（热处理前为2 x 107 pfu/mL）的内毒素少于载体和T4噬菌体裂解物。根据试剂盒说明，通过向载体裂解物（加标载体）中加入内毒素标准品来测试经过 1-辛醇处理的样品的测定抑制作用，最终浓度为 0.5 EU/mL。根据制造商的建议，加标的车辆内毒素水平减去车辆内毒素水平测量值为0.5 EU/mL±25%（图1B）。这表明1-辛醇被成功除去，并且裂解物没有引起可能干扰测定结果的测定抑制。
大肠杆菌 K-12（BW25113）单定植C57BL / 6小鼠在无菌柔性薄膜乙烯基隔离器中繁殖（图2A）。F0 代小鼠通过将其添加到其环境和共同饲养中与大肠杆菌定植。仅使用从出生到垂直传播和共同饲养与大肠杆菌定植的后代（F1 和 F2 代）进行实验。该策略控制了响应细菌接种而发生的免疫系统、粘液产生和胃肠道发育的变化22,37，因此允许测量仅由于噬菌体引入而发生的变化。成熟后，将实验小鼠转移到无菌等笼中，在6-8周龄时，它们分别通过口服强饲法接受2×106 pfu的T4噬菌体或等体积的载体裂解物。T4噬菌体和大肠杆菌丰度分别在0.5%（软）琼脂或1.5%琼脂上收集粪便沉淀和点斑板测定，监测超过4周。在该实验过程中，T4噬菌体和大肠杆菌能够共存，而不会耗尽任何一个种群（图2B，C）。与2×106 pfu相比，以较低剂量的2×102和2×104 pfu/小鼠口服T4噬菌体并没有降低T4噬菌体在肠道中定植的能力（图2D）。同样，未观察到T4接种对大肠杆菌水平的剂量依赖性影响（图2E）。
重要的是，样品之间镀层的一致性被发现对斑块计数至关重要。例如，当将细菌添加到软琼脂中时，确定细菌的密度极大地影响了测定的结果。加入传代培养 1 小时、1.5 小时或 2 小时的大肠杆菌，导致的斑块计数低于加入传代培养 2.8 小时或更长时间的大肠杆菌。此外，当大肠杆菌传代培养2.8小时至16小时（过夜）时，斑块定量稳定在~1 x 109 pfu / mL，与从1小时传代培养（~2 x 108 pfu / ml）计算的值相比，大约增加了5倍（图3A）。可以将目标细菌接种到过夜培养物的软琼脂中，而不是传代培养。在这里，接种到软琼脂中的16小时（过夜）大肠杆菌培养物的体积影响斑块计数（图3B）。这些结果表明，琼脂中大肠杆菌的密度会影响斑块测定计数。在这两种方法中，噬菌体定量结果在相同的值（109 pfu / ml）下趋于稳定，这表明目标细菌在软琼脂中必须具有足够高的密度，以确保斑块计数的准确性。
综上所述，这些结果强调了在进行实验操作之前通过 体外 和 体内 试验实验了解噬菌体-细菌动力学的重要性。
图1：噬菌体裂解物的制备。 （A） 从高滴度噬菌体原液开始噬菌体裂解物的工作流程。裂解物扩增、净化、浓缩，去除内毒素。污染的1-辛醇通过速度真空除去。（B） 使用显色内毒素定量试剂盒对噬菌体和载体裂解物中的内毒素进行定量。蓝色虚线表示在产物抑制控制中反驳产物抑制的上限和下限（0.5 EU/mL ± 25%）。每个点代表两个技术重复中的一个。条形高度表示跨重复的平均值。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2：单定植小鼠的产生和粪便颗粒中噬菌体和细菌水平的监测。 （A） 用单一细菌物种定植无菌小鼠并生成 F1 和 F2 单定植小鼠的工作流程。（B-E）在出生时单定植大肠杆菌并在 6-8 周龄时接种 T4 噬菌体的 C57BL/6 小鼠的粪便颗粒中检测到 T4 噬菌体和大肠杆菌的水平。在第 0 天（定植前）和定植后指示的天数，使用单琼脂层方法通过斑点铺板和斑块测定测量 T4 噬菌体水平。通过在1.5%LB琼脂上点铺测量大肠杆菌水平。（乙、丙）接种 2 x 106 pfu 的 T4 噬菌体或载体裂解物（体积和内毒素水平标准化）后，回收粪便颗粒中 （B） T4 噬菌体和 （C） 大肠杆菌水平的动力学。（D、E）（D） 接种 2 x 102 pfu、2 x 104 pfu 或 2 x 106 pfu T4 噬菌体后回收粪便颗粒中的 T4 噬菌体和 （E） 大肠杆菌水平。误差线表示均值和均值的标准误差 （SEM）。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：斑块检测的故障排除准确性。 （A） 使用 大肠杆菌 过夜培养物或用于软琼脂制备的传代培养物（0.5% 琼脂，LB）的 T4 噬菌体裂解物滴度。使用1：50稀释过夜 大肠杆菌 培养物到新鲜LB中进行传代培养，5 mL软琼脂制剂接种100 μL 大肠杆菌 和20 μL T4噬菌体。对于这些测试，CaCl2 和 MgSO4 未添加到软琼脂中，但如果需要，可以添加。 大肠杆菌 传代培养时间低于 2.8 小时导致表观噬菌体滴度降低。（B） 在软琼脂制备中使用不同 大肠杆 菌密度的 T4 噬菌体裂解物滴度。将来自过夜培养物的不同体积 的大肠杆菌 （不是传代培养，如 A）添加到软琼脂中，导致不同的表观噬菌体滴度。误差线表示计算出的噬菌体滴度不确定度。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
与细菌对应物相比，微生物组中噬菌体的研究提出了重大挑战。具体来说，噬菌体不包含所有噬菌体共有的保守系统发育标记，类似于 16S 和 18S 核糖体亚基，分别允许对原核和真核物种进行测序和鉴定42。然而，随着下一代测序方法的进步，包括增加读长、通量和降低成本，噬菌体基因组数据库的快速扩展42,43,44。随着噬菌体发现的大量基础工作顺利进行，噬菌体研究现在比以往任何时候都更容易获得。作为肠道微生物组的关键成员，以及地球上遗传多样性最强的生物，噬菌体为研究微生物组复杂性的新研究提供了一个令人兴奋的角度。这里描述的方案侧重于研究用靶细菌定植的小鼠中的已知噬菌体物种。应该注意的是，这些方案为研究体内噬菌体提供了指南，并且可以随着该领域的发展而扩展。
随着 1940 年代抗生素的出现，用于细菌感染治疗的噬菌体研究在很大程度上已经过时了。然而，抗生素的过度处方和滥用加速了多重耐药病原体的出现，成为主要的公共卫生问题3。噬菌体具有高度的宿主特异性，是抗生素的潜在替代品3。重要的是，由于噬菌体作为人类肠道微生物组的成员自然居住，因此有必要首先了解噬菌体在这些复杂环境中所扮演的角色。虽然许多研究已经在体外调查了噬菌体与其靶细菌之间的关系，但重要的是要考虑这些关系如何在胃肠道景观中保持。与调查微生物群细菌成分的探索性研究一样，简化的小鼠模型（如GF和单定植小鼠）使我们能够分离噬菌体对其目标物种的影响，以及这种关系如何促进免疫反应。这是迈向噬菌体治疗的重要一步，因为一些噬菌体在引入肠道时可能无法提供益处。例如，铜绿假单胞菌噬菌体 Pf4 通过抑制抗菌免疫反应和角质形成细胞迁移，导致伤口愈合受损，从而加剧其宿主引起的疾病18,45。这里描述的程序旨在标准化研究噬菌体作为小鼠微生物群成员的技术。与调查微生物群对后生动物宿主影响的开创性研究相呼应，在微生物群的背景下对噬菌体的持续研究可能证明对更广泛地了解多生物组46 令人兴奋和重要。
局限性
当T4噬菌体通过口服强饲法施用到大肠杆菌单定植小鼠时，这里描述的方案已经过优化，用于研究T4噬菌体与其靶细菌大肠杆菌之间的竞争。与细菌一样，不同的噬菌体物种彼此行为不同，具有不同的复制时间、爆发大小和细菌靶标范围47。因此，在研究类似动物模型中的其他噬菌体-细菌对时，应注意在所有步骤中优化这些方案。例如，具有较长复制时间和/或较小爆发尺寸的噬菌体可能需要与其细菌靶标进行更长的孵育以产生高滴度裂解物。同样，对于斑块测定，可能需要延长板孵育时间。此外，复制时间短和/或爆发大小大的噬菌体可能需要更短的平板孵育，因为过夜孵育可能导致斑块过度生长。如果感兴趣的特定噬菌体的繁殖条件未知，则应在开始体内工作之前建立确定生长条件的基础48。
在 T4 噬菌体的 Hoc 衣壳蛋白中发现的 Ig 样结构域有助于粘附于肠粘液11。根据所选噬菌体的粘液结合能力，粪便样品中噬菌体水平的动力学可能与图2B-E所示的结果不同。例如，在肠道芯片系统中显示，与Hoc缺陷噬菌体11相比，含有完整Hoc蛋白的噬菌体具有更高的大肠杆菌杀伤能力。虽然怀疑 T4 噬菌体通过体内粘液结合保留 11,12,13，但不能排除通过小鼠的共噬行为重新接种的影响。这些影响可以通过使用钢丝笼底部或经常更换钢丝笼来减少。由于 Ig 样结构域尚未在 ssDNA 或 RNA 噬菌体49 中鉴定出来，因此梳理噬菌体用于保持肠道粘膜内驻留的其他策略将很有趣。
最后，这些探索性研究仅检查了体内平衡时的噬菌体-细菌-宿主相互作用。在人类疾病的动物模型中，尚不清楚肠道屏障完整性的变化（例如IBD）如何影响这些相互作用。最近的研究表明，Caudovirales 噬菌体增加了 IBD患者的丰富度和多样性 7,8。在小鼠模型中，研究表明，连续噬菌体治疗加剧了葡聚糖硫酸钠 （DSS） 诱导的实验性结肠炎8。噬菌体-细菌-宿主相互作用如何在炎症环境中发挥作用，以及屏障完整性受损是否促进噬菌体诱导的炎症仍有待确定。
疑难解答和替代方法
鼠标模型
单定植小鼠模型允许在宿主生理学上询问单一种类的细菌16。涉及单定植小鼠的研究在阐明微生物群如何影响免疫系统方面发挥了至关重要的作用22。作为一个模型系统，单定植小鼠不能概括其传统微生物群对应物的生理学。与GF小鼠更相似的是， 大肠杆菌 单定植小鼠的粘液产生减少（类似于GF小鼠50）和免疫系统不成熟23。然而，单定植小鼠对于揭示单个物种对胃肠道和免疫发育的微生物特异性影响非常宝贵。一个典型的例子是发现分段丝状细菌 （SFB） 是小鼠 CD4+ T 辅助细胞 17 细胞的有效诱导剂24。关于粘液，对粘液基因转录51和粘液厚度50有微生物特异性影响。虽然数量有限，但单定植小鼠提供了在对照模型中研究一对噬菌体-细菌对哺乳动物宿主影响的机会。重要的是，噬菌体可以而且应该在复杂微生物群的背景下进行研究。在撰写本文时，很少有研究涉及噬菌体捕食传统微生物组内共生细菌物种的影响。这是本文中提出的协议的未来应用，可以对其进行调整以促进这些研究。
使用适当的车辆控制装置
在任何实验中，适当的对照都是必不可少的。在这里，定义了一种适合对小鼠口服给药的载体，用于控制T4噬菌体裂解物的多步骤清洁和纯化。一个重要的要求是载体对照含有与噬菌体裂解物相同水平的细菌内毒素，以控制任何内毒素介导的免疫反应。作为纯化过程的一部分，将氯仿和1-辛醇添加到裂解物中，随后除去。为了控制可能产生的对痕量水平的这些化学物质产生的潜在免疫反应，可以生产无噬菌体的细菌裂解物作为载体对照。T4噬菌体和载体裂解物含有非常低浓度的细菌内毒素，远低于饮用水25中允许的水平（图1B）。可以使用替代对照，并可以对其进行修改以适应预期的研究问题。最简单的是，可以使用含有等量内毒素的噬菌体缓冲液，尽管这不考虑多步骤的清洁和纯化过程。Gogokhia等人[8]报道了使用热灭活噬菌体作为对照，以确定没有DNA的噬菌体蛋白是否足以引起免疫反应。在我们手中，热灭活噬菌体的内毒素水平低于T4噬菌体裂解物（图1B），因此在本研究中不用于控制内毒素水平。但是，我们鼓励对两种方案进行测试，以确定哪种方法最适合单个实验目的。如果载体和T4噬菌体裂解物在内毒素的量上存在显着差异，则含有较低水平的裂解物可以补充纯化的内毒素。在纯化过程中将 1-辛醇添加到裂解物中，但使显色内毒素定量试剂盒测试失活。通过样品中潜在的干扰物质来测试产品抑制非常重要，以确保内毒素测量准确。如果怀疑产品抑制，则样品可能没有经过足够长的快速吸尘时间。如果问题仍然存在，可以使用透析去除剩余的 1-辛醇25。
给药途径和剂量
由于T4噬菌体的粘液结合能力，小鼠模型以单次口服强饲剂量接种。其目的是监测噬菌体和大肠杆菌在胃肠道共存的持续时间;然而，已经报道了在体内模型中研究噬菌体的其他方法。例如，富含噬菌体的饮用水已被用于为小鼠提供持续的噬菌体供应8,20。这种给药方法的好处是，即使在没有细菌宿主的情况下，噬菌体也能不断补充，正如Gogokhia等人所证明的那样。8. 该实验设计允许在没有细菌的情况下评估对噬菌体的免疫反应，并在实验过程中提供持续的免疫刺激。从生理学上讲，这种方法并不代表噬菌体感染或噬菌体在肠道环境中定植的自然过程，但它确实为反复接触噬菌体如何启动免疫系统提供了重要的见解。这在噬菌体疗法开发的背景下具有重要意义，因为噬菌体鸡尾酒可以作为治疗肠道细菌感染的疗程，类似于抗生素治疗方案。在T4噬菌体-E.大肠杆菌对的背景下，确定减少口服给单定植小鼠的T4噬菌体剂量不会改变粪便噬菌体或细菌水平（图2D，E）。因此，在这种情况下，T4噬菌体的接种剂量对于维持稳定的T4噬菌体-E.大肠杆菌在双定植小鼠肠道中的定植并不重要。值得注意的是，施用的最低剂量为 200 pfu/小鼠，最高剂量为 2 x 106 pfu/小鼠（根据 Hsu 等人）。2.因此，本研究无法获得支持超出此范围的T4噬菌体-E.大肠杆菌动力学的数据。
斑点和全板噬菌体滴度
为了测量粪便和组织中的T4噬菌体水平，此处概述的方案依赖于点铺技术而不是全板斑块测定，这可能导致小鼠之间噬菌体水平的变异性（图2B）。在整板技术中，斑块在更大的区域进行计数，从而实现更准确的定量。然而，每个样品的适当稀释通常必须通过点镀预先确定。由于样品是在样品采集当天进行检测的，因此对于高通量方法，点镀被认为是最合适的方法。因此，该数据的分辨率最准确地表示为每个样品中噬菌体的数量级。对于精确的噬菌体测量，每种噬菌体都有额外的注意事项。通过整板测定或对每个样品使用较小的连续稀释范围，可以获得更准确的测量结果。如果这些方法仍然导致噬菌体或靶细菌计数可变，那么通过宏基因组测序或其他实验评估共同进化和耐药性的方法来评估噬菌体和细菌之间的独特相互作用是否可以解释个体小鼠之间的差异将是谨慎的。根据Bonilla等人25，在制备用于斑块测定的软琼脂时，重要的是与添加的细菌宿主的量一致25。如图3所示，即使是细菌培养时间（图3A）和密度（图3B）的相对较小的变化也会影响斑块测定的准确性。对于其他噬菌体-细菌对，这些发现可能有所不同，并且建议在开始使用新生物体时进行类似的实验。此外，对于新的噬菌体-细菌对，应进行探索性实验以确定每个噬菌体的生长特性。例如，可以执行生长曲线来确定细菌的滞后、指数和固定阶段以及生长速率。一步生长实验可用于确定噬菌体的潜伏期（裂解时间）和爆发大小（细菌裂解时释放的噬菌体数量）52,53。
通过qPCR替代T4噬菌体测量
噬菌体的定量可以通过斑块测定（如上所述）或通过定量聚合酶链反应（qPCR）进行。这两种方法有一个重要的区别：斑块测定确定能够感染和杀死其细菌宿主的活噬菌体的数量，而qPCR量化噬菌体特异性遗传物质（作为存在的噬菌体数量的代理），但不提供有关噬菌体的活力和感染性的信息。使用Hsu等人描述的引物进行qPCR以比较噬菌体基因拷贝的定量与斑块测定中形成的斑块（图4）。从T4噬菌体/大肠杆菌双定植小鼠的盲肠内容物中提取并扩增T4噬菌体DNA。在大多数小鼠中，qPCR和斑块测定在盲肠内容物中检测到相似水平的T4噬菌体（图4A，B）。虽然在载体接种的盲肠内容物中检测到一些扩增，但计算出的基因拷贝数/g低于检测限（LOD）（图4A）。通过凝胶电泳证实这些样品中没有可定量的噬菌体。T4噬菌体基因产物（96bp）在从T4接种小鼠的盲肠内容物中分离的DNA中很容易可视化，但在载体对照中不存在（图4C）。
在这些测试中，尽管无法在同一样品的斑块测定中检测到T4，但通过qPCR在一只T4噬菌体定植小鼠的盲肠内容物中检测到T4噬菌体基因拷贝（图4B，箭头）。这些结果表明，由于产生有缺陷的病毒颗粒或噬菌体和/或细菌的共同进化，可能在体内出现不形成斑块的病毒颗粒。硬琼脂上的细菌接种技术可用于确定粪便细菌对噬菌体的敏感性14。我们认为，qPCR介导的检测可能是体内噬菌体工作流程的一个有价值的补充，因为它靶向短而保守的基因序列，因此它可能对肠道环境中的噬菌体进化更具鲁棒性。宏基因组学等无偏倚方法对于检查噬菌体-细菌的共同进化和相对丰度很有价值，但最终可能成本更高。
图 4：通过 qPCR 检测 T4 噬菌体。 （A，B） 在接种 T4 噬菌体或载体后第 29 天，通过 （A） 绝对 qPCR 或 （B） 噬菌斑测定在大肠杆菌定植的 C57BL/6 小鼠的盲肠内容物中测量 T4 噬菌体负荷。箭头表示来自个体小鼠的结果，该小鼠具有可检测到的 T4 基因组拷贝，但在盲肠内容物中没有可斑块的病毒。（C） PCR产物的凝胶电泳显示T4噬菌体接种的盲肠样品中存在96 bp条带，但在载体接种的样品中不存在。使用 100 bp DNA 分子量标准。LOD = 检测限。误差线表示平均值和 SEM。 请点击这里查看此图的较大版本.
应用
噬菌体占微生物组中存在的病毒样颗粒的 90% 以上44;然而，噬菌体对肠道微生物组的影响知之甚少。调查微生物组细菌成分的初步研究是通过分离特定物种并研究它们对免疫成熟的影响来实现的 22,24。对相组的类似审讯是一项艰巨但必要的任务，也是全面了解多生物组的必要条件46.虽然噬菌体疗法开发的重点往往着眼于治疗化脓性细菌感染，但重要的是要了解在胃肠道中添加噬菌体混合物如何改变肠道生态系统。此外，应通过生成免疫谱来评估治疗性噬菌体混合物的安全性。噬菌体已被研究为肠道细菌感染的潜在治疗方法，例如艰难梭菌 5 和鼠伤寒沙门氏菌血清型54。最近的研究还表明，FFT 在治疗早产猪坏死性小肠结肠炎方面同样或更有效9，这表明粪便微生物群移植 （FMT） 的病毒成分可能在减少疾病方面发挥积极作用。有必要继续研究噬菌体在微生物组中的作用，以进一步开发针对肠道病原体的噬菌体疗法，同时也为FMTs作为疾病的治疗方法提供更好的信息。通过标准化体内噬菌体研究的方法，将提高噬菌体研究的透明度和可重复性，同时为那些将工作扩展到小鼠模型的人提供指导。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者承认，他们进行这项研究的土地是 xwməθkwəy̓əm（马斯昆族）民族的传统、祖先和未割让的领土。它所在的土地一直是马斯昆族人的学习场所，几千年来，他们的文化、历史和传统在这个地方代代相传。我们鼓励其他人更多地了解他们在 https://native-land.ca 生活和工作的故乡。作者感谢加拿大自然科学与工程委员会 （NSERC） 加拿大研究生奖学金 - 硕士 （NP）、迈克尔·史密斯健康研究 BC 实习生奖（RT-2023-3174，至 MH）、加拿大自然科学与工程研究委员会 （NSERC） 发现资助计划（RGPIN-2019-04591 至 C.T.，RGPIN-2016-04282 至 LCO）、加拿大高级研究所/人类与微生物组（FL-001253 Appt 3362， C.T.）、迈克尔·史密斯健康研究基金会学者奖（18239 至 C.T.）、加拿大卫生研究院（PJT-159458 至 LCO）和加拿大创新基金会（34673 至 LCO，38277 至 CT）。我们感谢 UBC 疾病建模中心和 ubcFLOW 的技术支持，并得到 UBC GREx 生物复原力倡议的支持， 以及 Osborne 和 Tropini 实验室的成员对手稿的批判性讨论和评估。 图1A 和 图2A 是使用 Biorender.com 创建的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-octanol (99%) | Thermofisher | CAAAA15977-AP | |
| 50 ml PES Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units | Millipore Sigma | SCGP00525 | |
| Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade) | Fisher BioReagents | BP160-500 | |
| Amicon® 100kDa Ultra-15 centrifugal filter device, Ultracel-100 | Millipore Sigma | UFC910008 | |
| BD Microtainer® Tubes, SST | BD Medical | 365967 | |
| Bioexclusion airtight cages (ISO cages) | Techiplast | 1245ISOCAGE | |
| C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module | BioRad | 1851196 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (White Crystals to Powder) | Fisher BioReagents | BP510-500 | |
| Cap Locks For 1.5ML Tube 100/pk | Andwin Scientific | 16812612 | |
| Chloroform (Ethanol as Preservative/Certified ACS) | Fisher | C298-500 | |
| Copper coated steel beads (4.5 mm) | Crosman Corporation | 0767 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (50) | Thermo Scientific | 69504 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt solution, for molecular biology, 0.5 M in H2O | Sigma Aldrich | E7889 | |
| Fisher BioReagents™ Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents™ | Fisher Bioreagents | BP1423-500 | |
| Fisher BioReagents™ Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox | Fisher Bioreagents | BP1427-500 | |
| GeneRuler 100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0241 | |
| Green FastMix® qPCR mix, 1250 rxns | QuantaBio | 95072-012 | |
| HEPA filters for isocage lids, AUTOCLAVABLE H14 FILTERS FOR ISO LINE- IRRADIATED | Techiplast | UISOHEPAXTBOX-300 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher BioReagents | BP213-1 | |
| MaxQ 6000 Incubated Shaker | Thermo Scientific | 8354-30-0009 | |
| Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox | Fisher BioReagents | BP1427-500 | |
| Microcentrifuge Tubes with Locking Snap Cap, 2ml | Fisher | 14-666-315 | |
| Parafilm sealing film | Bemis | PM-996 | |
| Phage stocks | Carolina Biological Supply | n/a | |
| PicoLab® Mouse Diet 20 EXT | LabDiet | 5R58 | |
| Pierce™ Chromogenic Endotoxin Quant Kit | Thermo Scientific | A39552S | |
| RNase A (17,500 U) | Qiagen | 19101 | |
| RNase-free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) | Fisher Chemical | BP328-500 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Chemical | S271 | |
| Sonicator (probe model CL-18; power source model FB50) | Fisher scentific | n/a | |
| Sterile flexible film isolator | Class Biologically Clean | n/a | |
| SYBR™ Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| T4 phage primer, forward (CCACACATAGCGCGAGTATAA) | IDT | n/a | |
| T4 phage primer, forward (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA) | IDT | n/a | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | AAJ22638AE | |
| Water, (DNASE, RNASE free) | Fisher BioReagents | BP2484100 |
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